Soutenance mémoire
Généralités sur les cellules souches : sources, caractérisation et mécanismes d’action
Sources de cellules souches mésenchymateuses et notions de niches
Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) sont les cellules souches adultes les plus utilisées, elles ont d’abord été étudiées au niveau de la moelle osseuse puis il a été mis en évidence qu’elles étaient présentes dans beaucoup voir tous les organes et types tissulaires adultes (Fortier, 2005 ; Bakker et al., 2013).
D’après la revue sur les MSCs de Stewart et son équipe (Stewart, Stewart, 2011) ; les MSCs ont besoin d’un système hautement régulé pour être maintenues dans un état indifférencié et proliférer à un taux approprié au besoin en cellules progénitrices des tissus et à leur renouvellement intrinsèque. Ce système régulateur est spatialement organisé en niches de MSCs contenant la population de MSCs et une ou plusieurs populations de cellules support qui apportent les signaux de contact cellulaire et les molécules nécessaires au fonctionnement des cellules souches. Les localisations précises des niches ne sont pas toutes exactement connues. Mais on sait qu’elles se situent dans le micro-environnement périvasculaire pour assurer la nutrition adéquate des cellules et faciliter la migration des cellules progénitrices. Les MSCs les plus utilisées sont dérivées de moelle osseuse ou de tissu adipeux mais elles peuvent aussi être dérivées de tendon et de synovie ; des MSCs circulantes dans le sang ont aussi été décrites. (Stewart, Stewart, 2011).
Caractéristiques des MSCs
Les critères utilisés pour identifier les MSCs sont leur habilité à adhérer aux surfaces plastiques, leur capacité d’expansion clonale et leur capacité à se différencier en différents lignages de cellules. L’adhérence au plastique est une propriété cellulaire non spécifique mais elle exclue les cellules des lignages hématopoïétiques. L’isolation d’une population de MSCs passe par la capacité des MSCs à l’expansion clonale in vitro. En effet les autres populations cellulaires qui pourraient être incluses dans les échantillons biologiques ne peuvent pas contribuer à l’expansion cellulaire. Les passages successifs des cellules permettent de sélectionner une population à forte prédominance de MSCs.Les MSCs adultes ont une capacité de division limitée dans le temps par rapport aux cellules souches embryonnaires. La forte expansion cellulaire in vitro résulte en une sénescence réplicative des cellules car in vivo les divisions cellulaires sont des évènements rares. Le taux et la persistance de la prolifération des MSCs dépendent de la localisation anatomique et du type tissulaire dont elles sont issues. La sénescence se traduit par la perte de la multipotence des cellules et la diminution de leur capacité à s’implanter sur les sites d’inflammation. (Stewart, Stewart, 2011)
La capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires est une composante du phénotype des MSCs. Les différenciations en lignages adipocytaire, ostéoblastique et chondrocytaire sont les plus étudiées in vitro car les conditions nécessaires et les tests de confirmation sont bien caractérisés chez l’humain et chez beaucoup d’autres espèces animales.
La différenciation ostéoblastique nécessite une culture en une seule couche de cellule dans un milieu contenant du sérum et complémenté principalement en β-glycérophosphate, en dexaméthasone et en acide ascorbique. Le phénotype ostéoblastique est confirmé par le dépôt d’une matrice minéralisée extra-cellulaire mise en évidence par une coloration von Kossa ou au rouge Alizarine. L’étude de l’expression de gènes spécifiques des ostéoblastes comme osterix, Runx2, osteopontin, osteonectin, bone sialic protein et ALP peut aussi mettre en évidence une augmentation de leur expression (Stewart, Stewart, 2011).La différenciation adipocytaire passe par une culture en mono-couche dans un milieu contenant du sérum et complémenté avec de la dexaméthasone, de l’isobutylméméthylxanthine (IBMX), de l’insuline et de l’indométhacine dans certains protocoles. Le phénotype adipocytaire est caractérisé par la formation de gouttelettes lipidiques mises en évidence par la coloration à l’huile rouge O. L’augmentation de l’expression de PPARϒ, CEBPα, FABP4, LPL peut aussi être étudiée (Stewart, Stewart, 2011).La différenciation chondrogénique passe par un système de culture en 3 dimensions avec la formation de micro-masses de cellules appelées pellets, la plupart des protocoles utilisent un milieu sans sérum complémenté en insuline, acide ascorbique, transferrine, sélénium et des facteurs de croissance β ou des BMP. Le phénotype chondrocytaire se caractérise par le dépôt de collagène de type II et de glycosamminoglycanes sulfatés. Le dépôt de glyscosamminoglycanes peut être mis en évidence par coloration au bleu alcian, au bleu de toluidine, ou à la safranine O ; la présence de collagène de type II se valide par immunohistochimie. La différenciation chondrocytaire peut aussi être étudiée avec le profil d’expression de certains gènes spécifiques des chondrocytes comme Sox9, Collagen type II et Aggrecan (Stewart, Stewart, 2011).
Le profil des marqueurs de surface cellulaire est aussi étudié chez les MSCs afin de pouvoir identifier une population sur la base de ces marqueurs. Ceci permettrait d’isoler rapidement une population de MSCs dans une préparation de plusieurs types cellulaires et de standardiser les protocoles de préparation de MSCs. Une gamme de marqueurs négatifs a été développée pour exclure les populations de type non-MSCs : les clusters de différenciation CD34 et CD117 des cellules souches hématopoïétiques, la glycophorine A des précurseurs érythroides, CD11b des cellules immunitaires myéloides, CD19 et CD45 de la lignée cellulaire B, CD31 des cellules endothéliales, CD14 des monocytes et le complexe majeur d’histopcompatibilité II des lymphocytes. Il est difficile de définir un ou des marqueurs cellulaires positifs pour les MSCs, du fait d’une grande variabilité interspécifique, de plus il a été démontré que l’immunophénnotype des MSCs évoluait avec les stades de culture. (Stewart, Stewart, 2011). Plusieurs études ont montré l’expression simultanée de plusieurs marqueurs de surface chez les MSCs : par exemple Stro1, CD73 et CD106 permettraient de sélectionner les MSC humaines (Stewart, Stewart, 2011). Pour les autres espèces il est difficile de déterminer un immunophénotype car il y a un manque d’anticorps validés spécifiques de chaque espèce.De plus il a été montré que des populations de MSCs présentant des immunophénotypes similaires, mais originaires de différents types tissulaires, avaient pourtant des propriétés de différenciation très différentes (Stewart, Stewart, 2011). Des études récentes ont montré l’expression simultanée de CD29, CD44 et CD90 chez le cheval (Stewart, Stewart, 2011) et la présence simultanée de plusieurs marqueurs (CD29, CD73, CD105, CD44, Thy 1 et CD90) a aussi été mise en évidence pour les ASCs canines (Bakker et al., 2013). Ces données suggèrent qu’il pourrait exister des marqueurs cellulaires interspécifiques pour les MSCs.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Etude des ASCs canines |
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: ETUDE BIBILIOGRAPHIQUE
I. Généralités sur les cellules souches : sources, caractérisation et mécanismes d’action
Sources de cellules souches mésenchymateuses et notions de niches
Caractéristiques des MSCs
Mécanisme d’action des MSCs
II. Etude des ASCs canines
Intérêts et applications
Travaux réalisés sur les ASCs canines
Perspectives
Limites actuelles des études réalisées
Caractérisation et production des MSCs canines
Caractérisation des MSCs canines
a) Type de MSCs canines utilisées
b) Caractérisation des MSCs canines
Etude comparative de la production des ASCs canines dérivées de tissu adipeux
PARTIE EXPERIMENTALE : PRODUCTION ET CARACTERISATION DES ASCs CANINES A STROMALAB
I. Matériel et méthodes
Chiens et prélèvements de tissu adipeux
Cultures cellulaires
Extraction des cellules : préparation de la Fraction Stromale Vasculaire (SVF)
Mise en culture
Colony Forming Units fibroblastics (CFU-f) .
Prolifération
Potentiels de différenciation adipocyraire et ostéoblastique
a) Potentiel de différenciation adipocytaire
b) Potentiel de différenciation ostéoblastique
Potentiel de différenciation chondrocytaire
Méthode d’analyse par q PCR
Caractérisation des cellules par cytométrie en flux
Congélation des cellules.
Analyse des données
II. Résultats
Multiplication
Rendements et temps de doublement des ASCs de tissu adipeux sous cutané
CFU-f des ASCs de tissu adipeux sous cutané
Prolifération des ASCs de tissu adipeux sous cutané
a) Tendance
b) Passages successifs
Comparaison de la prolifération des ASC de tissu adipeux sous cutané et viscéral
a) Rendement et temps de doublement
b) CFU-f
c) Prolifération
Potentiel de différenciation
Potentiel adipocytaire
a) Aspect qualitatif au cours de la différenciation
b) Coloration
c) qPCR
Potentiel ostéoblastique
a) Aspect qualitatif au cours de la différenciation
b) Coloration
c) qPCR
Potentiel chondrocytaire
a) Appréciation qualitative de la formation des pellets
b) Coloration
c) qPCR
Cytométrie en flux
III. Discussion
Production
Caractérisation
Potentiel de différenciation
a) Potentiel adipocytaire
b) Potentiel ostéoblastique
c) Potentiel chondrocytaire
Marqueurs de surface
PERSPECTIVES
Production
Caractérisation
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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