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Les biocapteurs
Généralités sur les biocapteurs
L’idée de biocapteur est née du besoin d’analyse en temps réel sans traitement préalable de l’échantillon et sans manipulation de produits dangereux [1]. Le marché et les applications des biocapteurs sont très larges. Ils concernent non seulement le domaine médical pour le diagnostic [2-4], mais aussi les analyses environnementales [5-9] et l’agroalimentaire [2, 8, 10-17]. Le développement des biocapteurs a débuté dans les années 1960 avec l’introduction des premières électrodes à enzymes. Elles se sont étendues dans les années 1980 par la commercialisation de biocapteurs ampérométriques pour la mesure du glucose et en 1990 dans le domaine médical. Plus de 40 biocapteurs ont été commercialisés pour le diagnostic médical, pour mesurer les paramètres aussi divers que le taux de glucose, taux de cholestérol et certains analytes1 comme l’urée, les lactates [18]. Ces dernières années, le domaine des biocapteurs a connu un développement remarquable sous la pression de plusieurs facteurs selon les domaines d’application:
· le besoin en capteurs fiables (pharmacie);
· rapidité de mesure (monitoring médical) ;
· la généralisation de l’automatisation dans le génie des procédés;
· la recherche du moindre coût dans le domaine de l’analyse biomédicale ou environnementale. L’utilisation des techniques de microélectronique dans le domaine des biocapteurs permet en particulier d’envisager des productions massives à faible coût.
Pour le contrôle de la qualité des aliments et produits alimentaires, l’industrie agroalimentaire a de plus en plus besoin de techniques analytiques fiables et peu coûteuses. Ce besoin provient d’une part d’une demande des organismes de régulation mais aussi d’un plus grand intérêt porté par le consommateur à la fiabilité des produits qu’il consomme. La contribution des techniques analytiques devient de plus en plus importante pour le contrôle des matières premières, la vérification du contenu des produits, l’évaluation de leur fraîcheur et aussi la détection des contaminants. Plusieurs de ces techniques reposent le plus souvent sur des approches conventionnelles de mise en culture et d’enrichissement préalable. Ceci conduit à un procédé long, coûteux et ne permet pas une intervention rapide dans la chaîne alimentaire.
Les techniques alternatives comme les biocapteurs qui allient un élément biologique sélectif (anticorps, enzyme …) à un transducteur permettent de quantifier rapidement certains constituants des matrices alimentaires et jouent ainsi un rôle prépondérant dans le contrôle de la qualité des aliments. Leur caractère compact, leur grande spécificité, leur sensibilité et leur caractère portatif font d’eux une des meilleures alternatives aux techniques existantes.
Principe de fonctionnement des biocapteurs
Un biocapteur est issu de l’association d’un élément biologique (enzyme, anticorps, antigène, fragment d’ADN, d’ARN, microorganisme) possédant une fonction de reconnaissance spécifique et un élément transducteur (électrode, microbalance à quartz, fibre optique) qui assure le transfert de l’événement biologique « reconnaissance de l’analyte » et la transforme en un signal exploitable (électrique ou lumineux). La qualité du biorécepteur conditionne l’efficacité du dispositif en terme de sélectivité, sensibilité, répétabilité et reproductibilité. La couche bioreceptrice doit répondre à certains critères : une bonne conservation de l’immunoréactivité, une quantité importante de molécules immobilisées avec un faible taux de dénaturation et une bonne stabilité vis-à-vis des variations de pH, de force ionique.
Trois grands types de biomolécules sont généralement utilisés comme éléments de reconnaissance. On distingue : les enzymes, les immunoespèces (anticorps, antigènes), et les acides nucléiques. Dans le cas des biocapteurs enzymatiques, la mesure de l’analyte se fait par détection d’un produit de la réaction chimique provoquée par l’enzyme immobilisée, ou par détection d’une conséquence physique de cette réaction. Les biocapteurs basés sur des immunoespèces (immunocapteurs) détectent l’analyte par l’intermédiaire des modifications physiques de la couche sensible, modifications induites par la formation des complexes immuns (effets de géométrie, de masse, modification de propriétés électriques). Les biocapteurs qui utilisent les fragments d’ADN exploitent l’appariement de deux monobrins d’oligonucléotides complémentaires. Avec un microréseau d’ADN, il est possible d’identifier la séquence d’un gène et de détecter des mutations génétiques.
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Table des matières
CHAPITRE I: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I-1- Les biocapteurs
I- 1-1- Généralités sur les biocapteurs
I-1-1-1- Principe de fonctionnement des biocapteurs
I-1-1-2- Types de biorécepteurs et de transducteurs
I- 1-1-3- Types de biocapteurs selon le transducteur
I-1-1-3-1- Transducteurs électrochimiques
I-1-1-3-2- Transducteurs optiques : biocapteurs optiques
I-1-1-3-3- Transducteurs gravimétriques
I-1-2- Immobilisation du biorécepteur
I-1-2- 1- Fixation directe
I-1-2- 1- 1- Adsorption physique
I-1-2- 1- 2- Confinement
I-1-2- 1- 3- Technique de Langmuir-Blodgett
I-1-2- 1- 4- Liaisons covalentes
I-1-2- 2- Fixation indirecte
I-1-3- Domaines typiques d’applications des biocapteurs
I-2- La fonctionnalisation de surfaces
I-2-1- Fonctionnalisation de surfaces pour l’immobilisation des biomolécules
I -2-1-1- Fonctionnalisation par le groupement Azlactone
I -2-1-2- Fonctionnalisation par les Self Mono-Assembled layer (SAM)
I-2-1-2-1- Fonctionnalisation par le SAM d’acide mercapto-undécanoïque
I-2-1-2-2- Fonctionnalisation par le SAM du mélange d’acide 11-mercapto undecanoique et 6-mercaptohexanol
I -2-1-2-3- Fonctionnalisation par les Self Mono-Assembled layer (SAM) de l’acide 16-mercapto-6-decanoïque (16-MHA) complexé par un métal
I -2-1-3- Fonctionnalisation par les hydrogels (dextran)
I-2-1- 4- Fonctionnalisation par un polymère contenant des unités sucres sulfonés
I -2-1-5- Fonctionnalisation par les molécules d’ester maléïmide et succinimide
I -2-1-6- Fonctionnalisation des particules magnétiques par le dextran
I -2-1-7- Fonctionnalisation des nanoparticules de Fe3O4 par le bleu de Prusse
I-2-1-8- Fonctionnalisation du polystyrène par des nanoparticules magnétiques
I -2-1-9- Fonctionnalisation par le sepharose NHS activé
I -2-1-10- Modification de la surface par plasma hors équilibre basse pression
I-3- Le polythiophène
I-3- 1- Applications des polythiophènes (PT)
I-3- 2- Principe de la conduction
I-3- 3- Stabilité et comportement des polymères conducteurs
I-3- 3- 1- régiorégularité des polythiophènes
I-3- 3- 2- Méthodes de synthèse des polythiophènes
I-3- 3- 2-1- Electropolymérisation
I-3- 3- 2-1-1- Mécanisme d’électropolymérisation
I-3- 3- 2-1-2- Dopage du polymère obtenu
I-3- 3- 2- 2- Synthèse par polymérisation chimique
I-3- 3- 2- 3- Synthèse par couplage organométallique
I-3- 4- Techniques de caractérisation des polythiophènes
I-4- Interaction rayonnement- matière
I-4-1- Absorption
I-4-2- Diffusion
I-4-3- Modes de vibration
I-5- La spectroscopie Raman
I-5-1- Historique
I-5-2- Mise en oeuvre
I-5-2- 1- Principe de la spectrométrie Raman
I-5-2- 2- Structure d’un spectromètre Raman
I-5-2- 3- Imagerie Raman
I-5-3- Théorie de la diffusion Raman
I-5-3- 1- Traitement Classique
I-5-3- 2- Apport de la mécanique quantique
I-5-4- Avantages et inconvénients de la spectroscopie Raman
I-5-4- 1- Avantages
I-5-4- 2- Inconvénients
I-5-5- Application de la spectroscopie Raman
I-5-5-1- Application à la santé et aux milieux biologiques
I-5-5-2- Applications variées de la spectroscopie Raman
I-6- La microbalance à cristal de quartz
I-6-1- Principe de fonctionnement de la microbalance
I-6-2- Exemples d’applications de la microbalance à cristal de quartz
CHAPITRE II: RESULTATS ET DISCUSSIONS
II-1- Synthèse du polythiophène
II-1-1- Critère de choix du monomère : N,N-diéthyl-(2-thiophén-3yl-éthoxyméthyl) benzènesulfonamide (M)
II-1-2- Synthèse du Monomère
II-1-3- Purification du monomère
II-1-4- Formation du poly (N,N-diéthyl-(2-thiophén-3yl-éthoxyméthyl) –benzènesulfonamide
( PolyM)
II-1-5- Etude électrochimique du film poly (N,N-diéthyl-(2-thiophén-3yl-éthoxyméthyl)
Benzènesulfonamide
II-1-5-1- Comportement anodique
II-1-5-2- Comportement cathodique
II-1-6- Immobilisation des biomolécules sur le support polymère
II-1-6-1- Immobilisation de la protéine A
II-1-6-2- Immobilisation de l’IgG spécifique à Salmonella
II-1-6-3- Immobilisation de l’IgG fluorescence
II-1-6-4- Immobilisation de la bactérie
II-2- Modification de la surface d’or
II-2-1- Synthèse électrochimique du chlorure de parabenzènesulfonyle
II-2-1-1- Synthèse à partir du chlorure de 4-nitrobenzènesulfonyle
II-2-1-2- Synthèse à partir de l’acide sulfanilique (acide 4-amino benzènesulfonique)
II-2-2- Contrôle de la fonctionnalisation de la surface d’or par AFM
II-2-3- Immobilisation des biomolécules
II-2-3- 1- Immobilisation de la protéine A
II-2-3- 1- 1- Protocole d’immobilisation de la protéine A
II-2-3- 1- 2- Identification de la protéine A
II-2-3-2- Immobilisation de l’immunoglobuline : IgG humain
II-2-3-2- 1- Protocole d’immobilisation de l’immunoglobuline : IgG humain
II-2-3-2- 2- Identification de l’immunoglobuline: IgG humain
II-2-3-3- Reconnaissance anticorps-antigène
II-2-3-3-1- Protocole d’immobilisation de l’antigène
II-2-3-3-2- Identification de l’antigène
II-2-4- Contrôle d’immobilisation des biomolécules par AFM
II-2-4-1- Contrôle d’immobilisation de la protéine A
II-2-4-2- Contrôle d’immobilisation de l’IgG
II-2-4-3- Contrôle d’immobilisation de l’IgG Fluorescent
II-2-4-4- Contrôle d’immobilisation de l’IgG fluorescent par microscopie à fluorescence
II-3- Interactions entre biomolécules
II-3-1- Origine des interactions entre protéines
II-3-2- Nature des interactions
II-3-2-1- Les liaisons covalentes
II-3-2-2- Les interactions électrostatiques
II-3-2-3- Les liaisons hydrogènes
II-3-2-4- Les liaisons de Van der Waals
II-3-2-5- Les associations hydrophobes
II-3-3- Outils de détections des interactions
II-3-4- Identification des interactions
II-3-4-1- Fonctionnalisation du substrat
II-3-4-2- Immobilisation des protéines A et IgG
II-3-4-3- Identification des interactions
II-3-4-4- Interactions protéines- surface
II-3-5- Paramètres physicochimiques
II-4- Synthèse du monomère photopolymérisable
II-4-1- Généralités sur la photopolymérisation
II-4-1-1- Principe de base de la photopolymérisation
II-4-1-2- Photopolymérisation radicalaire
II-4-1-2-1- Photoamorceurs de type I
II-4-1-2-2- Photoamorceurs de type II
II-4-1-3- Photopolymérisation cationique
II-4-1-3-1- Photoamorceurs cationiques
II-4-1-3-2- Mécanisme de photopolymérisation cationique
II-4-1-4- Avantages du procédé photochimique
II-4-2- Synthèse du monomère
II-4-2-1- Schéma du principe de synthèse
II-4-2-2- Protocole de synthèse du monomère
II-4-2-2-1- Refroidissement du milieu réactionnel
II-4-2-2-2- Synthèse du monomère à haute température
Conclusion générale et perspectives
CHAPITRE III: MATERIELS ET METHODES
III-1- Caractéristiques des produits chimiques utilisés
III-1-1- Solvants et réactifs
III-1-1-1- Solvants
III-1-1-2- Réactifs
III-1-2- Techniques de caractérisation
III-1-2-1- Résonance magnétique Nucléaire (RMN)
III-1-2-2- Chromatographies
III-1-3- Modes opératoires des synthèses organiques
III-1-3-1- Synthèse du monomère N,N-diéthyl-(2-thiophén-3yl-éthoxy méthyl) benzènesulfonamide
III-1-3-1-1- Synthèse du 4- bromométhyl-N,N-diéthylbenzènesulfonamide
III-1-3-1-2- Synthèse du N,N-diéthyl-(2-thiophén-3yl-éthoxy méthyl) benzène sulfonamide
III-1-3-1-3- Synthèse de l’acide 4-méthacryloyloxybenzène sulfonique.
III-2- Instruments et procédures chimiques et électrochimiques
III-2-1- Cellules électrochimiques
III-2-2- Mesures électrochimiques
III-2-2-1- Potentiostat/galvanostat
III-2-2-2- Microbalance à Cristal de quartz
III-2-3- Synthèse et refonctionnalisation du poly(N,N-diéthyl-4-(2-thiophén-3yléthoxyméthyl)
benzènesulfonamide
III-2-3-1- Polymérisation anodique du monomère
III-2-3-2- Refonctionnalisation du poly (N,N-diéthyl-4-(2-thiophén-3yl-éthoxy méthyl)
benzènesulfonamide en chlorure de poly(N,N-diéthyl-4-(2-thiophén-3yl-éthoxyméthyl) benzènesulfonyle
III-2-3-3- Modification de la surface d’or par le chlorure de parabenzènesulfonyle
III-2-4- Synthèse du chlorure de 4-méthacryloyloxybenzènesulfonyle
III-2-4-1- Matériels nécessaires
III-2-4-2- Méthodes de synthèse
III-3- Procédures et matériels biologiques
III-3-1- Appareillage
III-3-1-1- Autoclave
III-3-1-2- Poste de sécurité microbiologique
III-3-2- Matériels biologiques
III-3-2-1- La protéine A
III-3-2-2- L’anticorps : IgG
III-3-2-3- L’antigène
III-3-3- Préparation des échantillons
III-3-3-1- Tampon phosphate (phosphate buffer solution : PBS)
III-3-3-2- Préparation de la solution de protéine A
III-3-3-3- Préparation de la solution d’IgG : (IgG anti E. coli et Salmonella)
III-3-3-4- Préparation de la bactérie E. coli et Salmonella
III-4- Spectroscopie Raman
III-5- Microscopie à Force Atomique
III-6- Microscopie à fluorescence
Références bibliographiques
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