Généralités sur la sensibilité des mycoplasmes aux antibiotiques

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Caractères bactériologiques des mycoplasmes

Caractères morphologiques et structuraux

La caractéristique commune des mycoplasmes est l’absence de paroi d’où un aspect polymorphe et l’impossibilité de les mettre en évidence par la coloration de Gram. Cependant ils peuvent être faiblement colorés par le Giemsa, la faible taille du génome particulièrement riche en base adénine-thymine et surtout leur insensibilité totale aux β-lactamines. La microscopie électronique est d’un très grand intérêt car elle montre que ces microorganismes sont des cellules simples, de la forme d’un coccus.
De très petite taille, 300-850 nm, il existe des formes allongées, fusiformes ou filamenteuses longues de 1μm et des formes arrondies de 90nm de diamètre. Le diamètre de petits cocci capables de se répliquer est de 300 nm environ. Cette taille leur permet de passer à travers des filtres de porosité 450 nm.
Les mycoplasmes sont en outre entourés d’une membrane plasmique à trois feuillets. Cette membrane est constituée de lipides, de protéines, de polysaccharides et de lipopolysaccharides. Ils possèdent également de nombreux ribosomes et parfois des corps dont on ne connaît pas la nature exacte (3,4,7,11,12).

Caractères biochimiques

Les mycoplasmes possèdent des caractères biochimiques communs dont des enzymes nécessaires à leur propre synthèse. Ils peuvent donc se multiplier en l’absence de cellules vivantes. Leur système de transport d’électrons est relativement simple.
Ils sont le plus souvent exigeants et nécessitent des milieux complexes et enrichis. Selon leur espèces, certains fermentent le glucose, d’autres hydrolysent l’urée et d’autres l’arginine. Ces propriétés sont utilisées dans le diagnostic biologique et permettent de les différencier (7,11).

Caractères culturaux

Les exigences nutritionnelles et les conditions de culture des mycoplasmes nécessitent des milieux sélectifs spécifiques préparés à partir d’un milieu de base constitué d’extraits de boeuf, de peptone, du chlorure de sodium et des suppléments minéraux. Il peut être rendu solide par addition d’agar. A ce milieu de base on ajoute :
– du sérum de cheval apportant des protéines naturelles, des lipides non toxiques, du cholestérol non estérifié. Ce cholestérol s’incorpore dans la membrane et leur confère la solidité dans l’environnement.
– de l’extrait de levure qui apporte des vitamines et des ions minéraux.
– de l’arginine pour la croissance de M.hominis
– de l’urée pour la croissance de U.urealyticum
– des antibiotiques tels la vancomycine et la colistine pour inhiber des contaminants comme des levures.
Il présente un pH ajusté de 7,6 à 8 et contient du rouge de phénol permettant d’apprécier à tout instant de la culture les modifications du pH. Pour favoriser l’identification et l’isolement de mycoplasmes, il est conseillé en outre l’adjonction de cystéine et des cofacteurs (polyvitex) pour améliorer le rendement, la qualité de la culture :
 Le facteur température : les mycoplasmes humains croient entre 36 et37˚C
 La durée d’incubation est de 24 et 48 heures respectivement pour U.urealyticum et M.hominis
Sur milieu gélosé, après incubation sous atmosphère anaérobie, les mycoplasmes donnent des colonies de 100-300 μm de diamètre ; en forme d’oeuf sur plat pour M.hominis et 10-50 μm en forme d’oursin pour U.urealyticum, visibles au microscope optique (4,6,7,13).

Facteur de virulence

Les mycoplasmes possèdent différents mécanismes leur permettant d’exercer leur pouvoir pathogène. Ces mécanismes sont plus connus dans le cas de U.urealyticum. Parmi les facteurs de virulence on retrouve l’adhérence aux surfaces cellulaires où les mycoplasmes sont rarement présents à l’état libre dans l’organisme ; ils « s’attachent » aux cellules du siège de l’infection (cellules HeLa, spermatozoïdes…). Ces micro-organismes sont étroitement associés aux surfaces muqueuses et une adhérence aux surfaces épithéliales conditionnent leur implantation chez un hôte neuf.
L’adhérence des mycoplasmes aux récepteurs neuraminiques est liée à la température. Ces bactéries instillent leurs déchets toxiques : peroxyde d’hydrogène, ammoniac et enzymes dans la cellule hôte à travers la membrane cellulaire et récupérent le cholestérol et autres nutriments de la cellule à leur profit créant ainsi une déplétion vitale de la cellule hôte.
U.urealyticum possède des activités enzymatiques variées mais aussi une uréase très puissante, une IgA protéase et une phospholipase toutes intervenant dans un pouvoir pathogène (14, 15)

Généralités sur la sensibilité des mycoplasmes aux antibiotiques

Antibiotiques actifs

Les exigences nutritionnelles des mycoplasmes nécessitent des méthodes de sensibilité différentes des méthodes standards recommandées pour la plupart des bactéries.
Les antibiotiques potentiellement actifs sur mycoplasmes et habituellement utilisés en thérapie sont les tétracyclines, les fluoroquinolones et les macrolides. Seules les fluoroquinolones ont un effet bactéricide potentiel. Des concentrations critiques pour les principaux membres de ces trois familles ont récemment été définies par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (16,17).
Cependant la sensibilité des mycoplasmes génitaux (U.urealyticum et M.hominis) à ces antibiotiques est variable. 5 à 10% des souches de U.urealyticum ainsi qu’un pourcentage non défini de souches de M.hominis hébergent le gène de résistance “tet M” et résistent aux tétracyclines. Cette résistance est susceptible d’être à l’origine d’échecs thérapeutiques (13).
La résistance des mycoplasmes urogénitaux (Ureaplasma spp. et M.hominis) est à rechercher chaque fois que l’on estime qu’ils sont en situation pathogène. Cette résistance est à craindre particulièrement lorsqu’ils sont isolés de sites extra-génitaux chez des immunodéprimés soumis à des pressions thérapeutiques multiples.

Résistance naturelle

Deux sortes de résistance naturelle sont observées chez les mycoplasmes, l’une commune à toutes les espèces appartenant à la classe des Mollicutes et l’autre spécifique à certaines espèces.

Résistances liées à la classe

Tous les organismes de la classe des Mollicutes résistent aux antibiotiques ayant pour cible la paroi bactérienne (β-lactamine, glycopeptides, fosfomycine), structure bactérienne dont ils sont dépourvus. Ils résistent en outre aux polymyxines, aux sulfamides, aux triméthoprime, à l’acide nalidixique et à la rifampicine. La résistance à cette dernière, étudiée chez un mollicute des plantes, Spiroplasma citri, est liée à une mutation naturelle du gène 526 de rpoB codant pour la sous-unité β de l’ARN polymérase ADN dépendante, qui empêche la fixation de l’antibiotique cible. M. hominis et Ureaplasma spp. résistent au linézolide, de la classe des oxazolidinones.

Résistances liées à l’espèce

Cette résistance naturelle concerne essentiellement le groupe macrolides-lincosamides-streptogramines et ketolides (MLSK). Parmi les mycoplasmes humains, M.genitalium est naturellement sensible à tous les MLSK, à l’exception de la lincomycine qui présente une activité modeste sur ces deux espèces. Ureaplasma spp. est sensible aux macrolides, ketolides, streptogramines mais résistant aux lincosamides. A l’inverse, M. hominis résiste aux macrolides ayant un cycle à 14 et 15 chaînons ainsi qu’à l’érithromycine, de la famille des ketolides. Il est sensible à certains macrolides à 16 chaînons (josamycine et midécamycine) et aux lincosamides mais non à la spiramycine, autre macrolide à 16 chaînons (6,16).

Résistance acquise

Parmi les mécanismes de résistance acquise décrits chez les bactéries, seules des altérations ou protections des cibles de l’antibiotique et mécanismes d’efflux ont été décrits chez les mycoplasmes. Le support génétique de la résistance chez les mycoplasmes peut correspondre à des mutations ou à un transfert de gènes par transposon. Les mycoplasmes se caractérisent par des fréquences de mutation élevées. L’étude de plusieurs génomes de mycoplasmes séquencés a montré la faible quantité d’information génétique dédiée au système de réparation de l’ADN. Ce mécanisme de résistance concerne toutes les classes d’antibiotiques utilisées pour le traitement des infections à mycoplasmes (16).

Validation d’une méthode qualitative et évaluation des incertitudes de mesure

Validation de la méthode

Toute mesure obtenue expérimentalement comporte une incertitude qui fixe les limites de la validité de chaque méthode. La validation analyse et caractérise les méthodes d’essai par rapport à ces limites de performance. En tenant compte des incertitudes, elle démontre par une traçabilité suffisante et des preuves tangibles qu’une méthode d’essai est appropriée pour remplir les conditions d’une tâche fixée.
En général, la validation d’une méthode qualitative et l’évaluation de son incertitude de mesure par
comparaison à une méthode de référence, doit comporter les paramètres suivants : la spécificité, la
sensibilité, l’exactitude relative, la précision, la conformité statistique, les valeurs prédictives positives et négatives. Pour la comparaison des méthodes qualitatives, on procède selon le tableau suivant (17) .

Matériels de transfert et de conservation des souches

 cryotubes à billes
 tubes à visse
 tubes nunc
 écouvillons
 portoir

Matériels de préparation des antibiotiques

 micro plaques
 micro pipettes de 10 μl, 1000 μl
 embouts
 four à micro-onde
 hotte à flux laminaire
 tubes à essai pour les dilutions
 eau distillée stérile
 filtres
 seringues
 bec bunsen

Réactifs et Antibiotiques

 Bouillon A3 pour ATB : milieu de conservation et de transport des mycoplasmes.
 Milieu de base PPLO
 Extrait de levure 10
 Sérum de cheval
 Isovitalex ou PVS
 VCN
 Eau distillée
 Urée
 Rouge de phénol
 Arginine
 PPLO Agar base Mycoplasma
 Chlorhydrate de cystéine
 Pénicilline (500.000 U/ml)
 Tétracyclines, Erythromycine, Lincomycine, Ciprofloxacine et Lévofloxacine

Méthodologie

Principe

L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a consisté à ajouter et préparer des solutions d’ATB de deux concentrations critiques : concentration critique supérieure (C.C.S) et inférieure (C.C.I) permettant d’étudier la sensibilité des souches de mycoplasmes urogénitaux identifiées et isolées. Après une incubation de 18 à 24 heures voir 48h à 37°C, la croissance bactérienne a été décelée grâce au virage de l’indicateur coloré (rouge de phénol).

Préparation des milieux

Deux types de bouillons A3 ont été préparés : l’un sans indicateur pour la conservation et le transport des souches et l’autre pour l’antibiogramme contenant de l’indicateur coloré puis conservés à 4°C. (Voir annexes)

Préparation des solutions des antibiotiques

Il est basé sur la préparation d’une solution mère 100 fois plus concentrée que la concentration critique supérieure initiale (STCCS) de l’antibiotique dans le solvant considéré. Les masses d’antibiotiques à peser dépendent de leur activité et elles étaient dissoutes dans le volume de solvant stérile exigé pour obtenir la concentration de la solution mère qui était conditionnée en
cryotubes puis conservée à −70°C.

Validation de la méthode

Pour la validation de notre méthode, nous avons mesuré des paramètres tels que la spécificité, la sensibilité, l’exactitude relative, la précision, la conformité statistique, les taux de faux-positifs et faux-négatifs. Afin d’y parvenir nous avons effectué une comparaison avec une méthode de référence qui nous permet de savoir si les souches sont vraiment sensibles ou résistantes aux molécules.

Spécificité

Dans le cadre de cette étude, la spécificité mesurée donne le pourcentage de toutes les vraies souches résistantes; les souches intermédiaires ont été considérées comme résistantes. Cette spécificité désigne la faculté de la microméthode de ne pas identifier de souches sensibles lorsqu’elles ne sont pas identifiées par la méthode de référence (Mycoplasma IST2).

Sensibilité

Pour notre étude la sensibilité calculée donne le pourcentage de toutes les souches sensibles qui sont reconnues comme sensibles. Cette sensibilité désigne la faculté de la microméthode, en comparaison avec la méthode Mycoplasma IST2, d’identifier les souches sensibles lorsqu’elles sont aussi identifiées par la méthode de référence (Mycoplasma IST2).

Exactitude relative

Pour la validation de notre méthode, l’exactitude relative exprime le degré de concordance des résultats obtenus entre la microméthode et la méthode de référence Mycoplasma IST2. Elle donne la probabilité que les deux méthodes de comparaison donnent les mêmes résultats.

Précision

La précision décrit les écarts aléatoires des valeurs autour d’une moyenne. La précision de répétabilité (r) correspond à la comparaison de résultats provenant de mesures répétées du même échantillon homogénéisé dans les mêmes conditions (mêmes personnes, laboratoires, équipements, réactifs, conditions d’environnement). Lors de l’évaluation de la répétabilité, le même échantillon contenant une quantité de souches dans le domaine de mesure a été analysé 5 fois dans les mêmes conditions et cela pour chaque souche. Elle se calcule par : r = x/ n.
x= nombre de résultats concordants dans des conditions de répétabilité
n = nombre de mesures ; la limite de détection est fixée à r = 0,5

Concordance statistique

Pour l’évaluation statistique de notre méthode nous avons procédé à la détermination de l’indice de concordance kappa. L’index de concordance kappa mesure la concordance entre la microméthode et Mycoplasma IST2. Elle se calcule de la manière suivante : Kappa = 2 (ad – bc) / [(a + c)(c + d) + (a + b) (b + d)].
La concordance est évaluée suivant la valeur kappa ci-après :
Si Kappa compris entre 0,10 – 0,40 la concordance est faible
Si Kappa compris entre 0,40 – 0,60 la concordance est nette
Si Kappa compris entre 0,60 – 0,80 la concordance est forte
Si Kappa compris entre 0,81 – 1,00 la concordance est presque complète.

Discussion

Un total de 19 souches de M.hominis et U.urealyticum ont été inclus dans cette étude. Les résultats de cette étude indiquent que pour les quinolones U.urealyticum présente 84,6% de souches résistantes à la ciprofloxacine et 23,1% de souches sont résistantes à la lévofloxacine. Par contre aucune souche de M.hominis n’est résistante à la ciprofloxacine. Ces résultats sont comparables à ceux de Min Young Lee et coll. en 2016 qui montre une résistance de 62,1% à la ciprofloxacine et aucune résistance pour M.hominis (20). Concernant les cyclines, 15,4% de souches de U.urealyticum sont résistantes à la tétracycline seule molécule testée ; M.hominis présente 16,7% de résistances. Ceci rejoint les études de BEBEAR et coll. en 2007 qui affirme que certains U.urealyticum ont acquis une résistance génétique à la Tétracycline grâce à une mutation génique Tet(M) (21).
Quant aux macrolides, U.urealyticum présente une faible résistance de 30,8% à l’érythromycine et 69,2% de souches sensibles à l’opposé de la lincomycine avec une totale résistance pour la même souche. Des fréquences de résistances plus basses ont été rapportées par DJIGMA et coll. en 2008 soit 6,3 % à l’érythromycine (22). Cette molécule est efficace sur U.urealyticum mais ne présente aucune activité sur M.hominis. Avec la lincomycine, 66,7% de M.hominis sont restés sensibles et 33,3% de souches résistantes. Nos résultats sont comparables à ceux de SOW et coll. (2000) à Dakar dont les échantillons présentaient une sensibilité à la lincomycine (70,0 %) (23). Ceci démontre une faible activité des quinolones sur les mycoplasmes contrairement aux cyclines.
En outre, les résultats de l’évaluation de notre test montrent 50,9% de vraies souches sensibles et 45,6% de vraies souches résistantes aux molécules d’ATB. Nous notons également 3,5% de fausses souches résistantes et 1,7% de fausses souches sensible à la microgalerie MicroCSB System® ; avec une sensibilité de 93,55% et une spécificité de 96,16%. Ces résultats sont similaires à ceux de Tiziana et coll. en 2017, qui ont montré une sensibilité de 95,3% pour Mycoplasma IT2 (24). Ceci démontre la grande capacité du test à identifier des souches sensibles et ceux résistantes.
L’exactitude relative entre la microméthode et la méthode de référence calculée a donné 94,74%. L’index de concordance trouvé indique que la concordance des résultats de la microméthode MicroCSB System® était presque complète à ceux de Mycoplasma IST2. Cela montre l’utilisation du test sans risque de contamination et de résultat discordant pour un même patient. Le test peut être donc réalisé dans la plupart des laboratoires de diagnostic et ne nécessite pas une expertise particulière.
Pour le test de répétabilité, la limite de détection doit être inférieure ou égal à 0,5 pour valider la méthode (17). La précision du test de répétabilité était de 100% ; ce qui montre la qualité des résultats et de la méthode.
Ces performances analytiques sont excellentes. Cette méthode simple, qui ne nécessite pas un grand matériel permet une bonne étude de sensibilité des mycoplasmes urogénitaux et est appelée à s’implanter dans tous les laboratoires de bactériologie.

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Table des matières

LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
I. Généralités sur les mycoplasmes
I.1. Taxonomie
I.2. Marqueurs épidémiologiques
I.3. Caractères bactériologiques des mycoplasmes
I.3.1. Caractères morphologiques et structuraux
I.3.2. Caractères biochimiques
I.3.3. Caractères culturaux
I.4. Facteur de virulence
II. Généralités sur la sensibilité des mycoplasmes aux antibiotiques
II.1. Antibiotiques actifs
II.2. Résistance naturelle
II.2.1. Résistances liées à la classe
II.2.2. Résistances liées à l’espèce
II.3. Résistance acquise
III. Validation d’une méthode qualitative et évaluation des incertitudes de mesure
III.1. Validation de la méthode
III.1.1. Spécificité
III.1.2. Sensibilité
III.1.3. Exactitude relative
III.2. Evaluation des incertitudes de mesure
III.2.1. Valeur prédictive positive
III.2.2. Valeur prédictive négative
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. Objectifs
II. Cadre de l’étude
III. Matériel
III.1. Souches bactériennes
III.2. Matériels de préparation des milieux
III.3. Matériels de transfert et de conservation des souches
III.4. Matériels de préparation des antibiotiques
III.5. Réactifs et Antibiotiques
IV. Méthodologie
IV.1. Principe
IV.2. Préparation des milieux
IV.3. Préparation des solutions des antibiotiques
IV.4. Contrôle de qualité des milieux et des antibiotiques
IV.5. Mode opératoire de la réalisation de la microplaque pour l’étude de la sensibilité des souches
IV.5.1. Distribution et déshydrations des solutions d’antibiotiques
IV.5.2. Contrôles de qualité des plaques déshydratées
IV.5.3. Lecture et interprétation
IV.5.4. Validation de la méthode
IV.5.4.1. Spécificité
IV.5.4.2. Sensibilité
IV.5.4.3. Exactitude relative
IV.5.4.4. Précision
IV.5.4.5. Concordance statistique
V. Résultats
VI. Discussion
RECOMMANDATIONS
CONCLUSION
REFRENECES BIBLIOGRAPHIQUES

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