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La papaïne
Généralités sur la papaïne
La papaïne est une protéase à cystéine qui catalyse l’hydrolyse des esters, des amides des peptides, des protéines en polysaccharides et acides aminés [19]. La papaïne est une endopeptidase de la famille des peptidases C1. Elle est la mieux connue dans la classe des protéases à cystéine et la plus étudiée [31,41]. La papaïne a comme nomenclature EC 3.4.22.2, classification numérique basée sur la réaction chimique que l’enzyme catalyse, établit par « l’Enzyme Commission ».
Origine et rôles de la papaïne
La papaïne provient du papayer ou Carica papaya linn. aussi appelée mapaza, paza, papay et voapaza dans les différentes régions de Madagascar [3]. Le papayer, illustré par la figure 2, est une plante à latex originaire d’Amérique tropicale (Mexique) à l’allure de jeune palmier portant un bouquet de grandes feuilles lobées et de gros fruits allongés verts ou jaune orangé [11,15,33] . Elle pousse de préférence dans les régions chaudes et humides. La papaïne aurait pour rôle physiologique de catalyser l’hydrolyse des enzymes digestives des insectes qui mangent les feuilles et les fruits du papayer [4, 23]. Toutes les parties de la plante (tige, feuilles, fruits) produisent du latex contenant de la papaïne brute, c’est-à-dire en réalité un mélange d’enzymes protéolytiques [11, 37].
Structure moléculaire de la papaïne
La papaïne brute est un mélange de papaïne, de chymopapaïne, de papayoprotéinase Ω. La chymopapaïne pure est une protéine dont la structure et les propriétés sont très voisines de la papaïne [40] La papaïne est une protéine qui contient :
– 212 acides aminés pour un poids moléculaire de 23406 Daltons [3]
– Une triade catalytique de Cys, His et Asx (Asn et Asp.) dans son site actif [19]
– Une poche oxyanionique formée principalement d’hydrogène polarisé (Gln 19) [29].
Activité catalytique au niveau du site actif
La papaïne catalyse l’hydrolyse des protéines à l’aide d’une paire d’ions présente dans son site actif. Cette paire d’ions comprend un groupe thiol de cystéine et un imidazole d’histidine. Elle existe sous forme thiolate et imidazolium, l’anion thiolate réagit en tant que nucléophile et l’ion imidazolium en tant que acide. La paire d’ions doit être l’une sous forme acide et l’autre sous forme basique dans le site actif pour piéger l’intermédiaire tétraédrique formé au cours de l’étape d’acylation (étape de formation de l’acyl-enzyme décrit dans la figure 3) Cet intermédiaire tétraédrique est stabilisé par la poche anionique (présentant le Gln 19) et par le résidu Asp. 158 qui aide à l’orientation de la boucle imidazole de His 159 lors de la déprotonation. La charge et les liaisons hydrogènes de l’Asp 158 contribuent à l’activité intrinsèque de la papaïne
Facteurs influençant l’activité catalytique
L’efficacité catalytique de la papaïne est influencée par plusieurs facteurs physicochimiques:
– La température : l’optimum d’activité catalytique de la papaïne est à T=65°C, l’enzyme purifié perd son activité à des températures élevées (> 70°C), en solution son activité est détruite après 30 min à 82,5°C.
– La variation du pH : à bas pH, la protonation de l’anion thiolate diminue sa nucléophilie ; à pH élevé, la déprotonation de l’imidazolium diminue la concentration de l’enzyme sous forme active. L’enzyme est efficace à pH 6-7.
– Les agents oxydants inactivent les groupements thiols de la protéine et dénaturent l’enzyme.
Utilisations de la papaïne
La papaïne est utilisée en pharmaceutique pour ses propriétés anti-inflammatoires, dans l’industrie textile comme agent nettoyant ou comme détergent, dans l’industrie alimentaire notamment pour l’attendrissement de la viande [15, 23, 34, 38,39] La papaïne est aussi utilisée :
– dans la production de concentrés solubles de protéines de poisson [13]
– dans la réduction des hernies discales [12]
– comme produit à potentiel antisalissure [27].
– pour l’amélioration de la stabilité colloïdale de la bière [23].
Récolte d’échantillons de feuilles de papayer
La récolte des échantillons de feuilles de papayer a été effectuée au sein du FOFIFA à Ambatobe Antananarivo. La collecte se fait tôt le matin pour avoir des feuilles fraîches avec plus de pourcentage d’activité enzymatique donc d’enzymes protéolytiques. Les échantillons récoltés sont conservés dans une glacière, dans de la glace fondante, pour les maintenir à 0°C pendant le transport. Les feuilles de papayer ont été conservées au congélateur à une température de -18°C immédiatement après la collecte. La qualité morphologique des feuilles est déterminée pour chaque prélèvement.
Purification de la papaïne
La purification de la papaïne est un processus qui se déroule en plusieurs étapes :
– l’extraction initiale
– la précipitation différentielle
– la dialyse
– la chromatographie
– le tamisage moléculaire
Nous avons effectué notre purification jusqu’au niveau de la dialyse pour avoir une purification partielle de la papaïne.
Extraction à froid
La technique d’extraction utilisant l’action mécanique est utilisée pour briser les cellules de feuilles de papayer et extraire l’enzyme recherché.
Principe :
Les complexes enzymatiques perdent leur activité par oxydation [21]. Par conséquent, la température d’extraction doit être aussi basse que possible pour limiter l’oxydation des groupements sulfhydryles des enzymes .
Méthode :
Le broyage des échantillons de feuille de papayer se déroule à température de O°C dans un bac de glace fondante Les matériels de broyage utilisés sont le mortier et le pilon qui sont préalablement refroidis au congélateur avant leur utilisation. Le tampon d’extraction utilisé est le tampon phosphate – citrate pour maintenir le pH à un niveau adéquat [8] La macération du mélange tampon – broyat dure 2 heures à 4°C. L’homogénat est ensuite filtré par passage sur 4 épaisseurs de gaze, les débris de feuilles non broyées sont alors éliminés. Le filtrat obtenu est clarifié par centrifugation pendant 30 minutes à 16000G pour éliminer les grosses particules à l’aide d’une centrifugeuse de marque BECKMAN J 21 B. Le surnageant est recueilli et conservé au congélateur à -18°C par fractions de 5ml pour éviter les cycles de congélations décongélations répétées .
Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium (NH4)2 SO4
C’est une des premières étapes de purification proprement dite. Elle est généralement employée pour séparer une protéine d’intérêt d’autres protéines contaminantes dans une solution contenant un mélange complexe de protéines.
Principe :
Les conditions ioniques ou de pH qui rendent les protéines insolubles varient pour chaque espèce de protéines. A un taux donné de saturation en électrolyte (sulfate d’ammonium dans notre cas), la protéine d’intérêt précipite. Remise dans un tampon adéquat la protéine reprend sa forme native .
Méthode :
La solution de protéines est placée dans un bain de glace fondante sous agitation à l’aide d’un agitateur magnétique, le sulfate d’ammonium est ajouté par petite quantité jusqu’à 25%.de saturation en sel La quantité de sel à ajouter à un certain volume de solution protéique à une température définie (O°C dans notre cas) est établie à l’aide du tableau de saturation en sulfate d’ammonium [9] L’agitation est maintenue 30 minutes après addition du sulfate d’ammonium.
La solution est centrifugée à 5000 G pendant 30 minutes Le surnageant obtenu est remis en solution et la concentration en sulfate d’ammonium de la solution est ajusté à 50%. La manipulation est recommencée au début La même opération est effectuée à 75% de saturation en sulfate d’ammonium. Le culot contenant les protéines est récupéré et son absorbance est lue à 280 nm avec un spectrophotomètre de marque SECOMAM. En effet, les protéines sont analysées par spectrophotométrie d’absorption UV-visible, elles ont des bandes d’absorption dans la région de l’UV proche c’est-à-dire de 200 à 400 nm. L’absorbance à la longueur d’onde caractéristique de 280 nm est communément utilisée pour estimer la concentration totale de protéines dans un échantillon. L’absorbance est proportionnelle à la concentration en protéines .
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Table des matières
INTRODUCTION
RESUME BIBLIOGRAPHIE
I- La papaïne
I- 1. Généralités sur la papaïne
I- 2. Origine de la papaïne
II- Structure moléculaire de la papaïne
III- Mécanisme de la catalyse enzymatique
III- 1. Mécanisme catalytique
III- 2. Activité catalytique au niveau du site actif
III- 3. Facteurs influençant l’activité catalytique
IV- Les utilisations de la papaïne
MATERIELS ET METHODES
I- Récolte d’échantillons de feuilles de papayer
II- Purification de la papaïne
II-1. Extraction à froid
II-2. Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium
II-3. Dialyse
III- Test d’activité
IV- Dosage
IV-1. Méthode par évaporation à sec
IV-2. Méthode de dosage de FOLIN-LOWRY
IV-3. Activité enzymatique et activité spécifique
IV-4. Rendement d’activité et taux de purification
IV-5. Procédé de purification
V- Etude de la cinétique enzymatique
V-1. Paramètres influençant la cinétique enzymatique
V-2. Détermination des constantes cinétiques
RESULTATS ET DISCUSSION
I- Caractères des échantillons des feuilles de papayer
II- Purification
II-1. Saturation en sulfate d’ammonium
II-2. Tableau de purification
III- Courbe d’étalonnage du dosage de FOLIN-LOWRY
IV- Effets des différents paramètres physico-chimiques
IV-1. Cinétique enzymatique en fonction du temps
IV-2. Cinétique enzymatique en fonction de
la concentration en papaïne
IV-3. Cinétique enzymatique en fonction de la température
IV-4. Cinétique enzymatique en fonction du pH
IV-5. Cinétique enzymatique en fonction de la concentration en caséine
V- Les constantes cinétiques
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE I
ANNEXE II
