Soutenance mémoire
Généralités sur Astrocaryum vulgare Martius
Généralités sur la famille des Arecaceae
La famille des palmiers (Arecaceae, Arécacées ou Palmae) est particulièrement importante puisqu’elle regroupe près de 2 500 espèces réparties en plus de 200 genres, dans les régions tropicales, subtropicales et tempérées chaudes, de l’Afrique aux Amériques jusqu’à l’Asie (De Granville, 1989). Plante à la fois primitive et très évoluée, le palmier peut s’adapter à des conditions climatiques très diversifiées. Sensibles au gel, ils ne dépassent pas la latitude de 50° nord ou sud. Seules deux espèces (Phoenix theophrasti, le dattier de Crète, et Chamaerops humilis, le palmier nain ou palmier doum) sont spontanées en Europe.
Occupant une place à part dans le monde végétal, ils comptent parmi les plus anciennes espèces de plantes puisqu’ils existent depuis plus de 80 millions d’années. Ils font partie intégrante de l’écosystème tropical. Un grand nombre d’espèces poussent dans les forêts pluvieuses tropicales, au niveau de la canopée et dans la strate arborescente inférieure. Les palmiers poussent également dans des endroits durablement humides, comme les marais, à proximité des mangroves et sur les rives des fleuves. Ils prospèrent également dans les forêts semi-arides et arides de plaines. On les rencontre encore à 4 000 mètres d’altitude dans la cordillère des Andes, ou dans les oasis, notamment au Sahara.D’un point de vue botanique, les palmiers sont des monocotylédones et ne sont donc pas des arbres mais des « herbes géantes » qui peuvent aller jusqu’à 40 à 60 m de haut pour le Ceroxylon des Andes, et jusqu’à un mètre de diamètre pour le cocotier du Chili (Jubaea chilensis).
Présentation d’Astrocaryum vulgare
Appareil végétatif
C’est une famille de plantes généralement arborescente parfois à l’aspect de lianes ou d’arbustes, à bois atypique n’ayant pas de cambium pour assurer une croissance en largeur du tronc (Judd et al., 2001). Le port paraît être ligneux, mais l’anatomie est différente de celle d’un arbre :
• Il n’y a pas de formation secondaire.
• Le nombre de faisceaux criblo-vasculaires est multiplié.
• On observe une intense lignification du sclérenchyme ce qui leur confère une structure très dure.
Le tronc porte le nom de stipe, et est rempli de moelle. Sa croissance provient de la chute des palmes laissant une écaille ligneuse qui perdure toute la vie de la plante. Les palmes ou feuilles, qui sont en perpétuel renouvellement, avec un entre-nœud court, poussent en bouquet à partir du méristème terminal. Selon les espèces, ces feuilles peuvent avoir la forme d’un éventail (feuilles palmées), d’une plume (feuilles pennées) ou d’une structure intermédiaire (feuilles costapalmées).
Appareil reproducteur
L’inflorescence caractéristique est le spadice qui se développe toujours très lentement.
Certains palmiers ont des fleurs qui se développent régulièrement sous le bouquet de feuilles, d’autres palmiers ne fleurissent qu’une fois dans leur vie. L’inflorescence se développe au niveau de la partie terminale, par différenciation du méristème. L’axe de l’épi est parfois très lignifié comme dans le cas de la datte ; ce spadice possède une bractée à la base, la spathe qui est très développée et joue le rôle d’un cornet protecteur. Les fleurs sont petites, régulières en épi, avec des bractéoles à la base. Elles sont unisexuées, étagées et monoïques, avec souvent en haut les fleurs mâles et en bas les fleurs femelles. La trimérie domine, avec 2 cercles de 3 pièces au niveau du périanthe indifférencié, c’est-à-dire 6 tépales et 2 × 3 étamines ou 3 carpelles. Les pièces florales sont, soit soudées, soit libres. Les trois carpelles ne contiennent qu’un seul ovule chacun. Le développement de l’un des ovules inhibera la fécondation et le développement des ovules des deux autres carpelles. L’anémophilie est relativement fréquente comme mode de dissémination.
Études pharmacologiques
Une étude de screening des activités anti-tyrosinase de plusieurs plantes n’a pas montré d’activité importante pour un extrait issu du fruit d’awara (Baurin et al., 2002). La tyrosinase, largement distribuée dans la nature,est une enzyme impliquée dans la synthèse de la mélanine, c’est une enzyme cible dans le traitement des maladies associées à la pigmentation. Un screening de différents extraits de plantes sur l’activité inhibitrice de la PLA2 a montré une inhibition de 30 % pour un extrait issu du fruit de l’awara, la PLA2 étant une enzyme clé de l’inflammation (Bernard et al., 2001).En 2000, un premier brevet a été déposé, par Pauly G. sur l’ « Usage d’extraits de plantes à activité anti-radicalaire » parmi lesquels figure l’awara (Pauly et Moretti, 2000). En 2003, une thèse a été réalisée sur l’« activité anti-inflammatoire des composés insaponifiables d’Astrocaryum vulgare » par Asma Chaik (Chaik, 2003). L’auteur a montré dans l’œdème à la patte induit par la carragénine que la fraction insaponifiable de l’huile de pulpe d’awara avait une activité
Présentation d’Astrocaryum vulgare
anti-inflammatoire à la fois par administration orale et intra-péritonéale alors que l’huile de pulpe avait une faible activité. Cependant, ces résultats n’ont pas fait l’objet de publications scientifiques.
Suite à ces travaux, deux brevets ont été déposés en 2004, par Benjelloun-Mlayah B. sur les « Extraits de fruits d’Astrocaryum vulgare et préparations obtenues à caractère anti-inflammatoire » (Benjelloun-Mlayah et al., 2004) et en 2006, par Bonnafous C. sur les « Propriétés antioxydantes, anti-radicalaires et anti-raideurs rhumatismales des huiles et du tourteau d’Astrocaryum vulgare » (Bonnafous et al., 2006).
L’inflammation
L’inflammation est un mécanisme de défense normal qui protège l’organisme des infections et autres agressions. Ce mécanisme de défense initie la destruction des agents pathogènes, les processus de réparation tissulaire et de restauration de l’homéostasie au niveau des sites infectés ou endommagés (Figure 4) (Medzhitov, 2008). Quelque soit l’étiologie, l’ensemble des modifications tissulaires, vasculaires et humorales successives à des lésions cellulaires ou tissulaires, comprend :
• Des phénomènes généraux, qui sont exprimés cliniquement de façon variable, le plus souvent par de la fièvre, et localement par des symptômes de rougeur, chaleur et tuméfaction.
• Des phénomènes locaux qui se déroulent dans les tissus vascularisés, préférentiellement dans le tissu conjonctif. L’inflammation vise à éliminer l’agent pathogène et à réparer les lésions tissulaires. Cependant, l’inflammation peut être néfaste par persistance de lésions trop importantes ou de la substance pathogène, ou par anomalies des régulations du processus inflammatoire.
L’inflammation peut être causée par différentes agressions ou pathologies :
• agents infectieux : bactéries, virus, parasites, champignons ;
• agents physiques : traumatismes, chaleur, froid, radiations ionisantes ;
• agents chimiques : caustiques, toxines, venins ;
• corps étrangers : exogènes ou endogènes ;
• défaut de vascularisation : réaction inflammatoire secondaire à une nécrose par ischémie ;
• anomalie de la réponse immunitaire, allergies, auto-immunité ;
• tumeurs malignes ou bénignes.
L’initiation : réaction vasculo-exsudative
Elle se traduit cliniquement par des signes de rougeur, chaleur, tuméfaction et douleur et comporte trois phénomènes :
• La congestion active due à une vasodilatation survenant après une brève phase de vasoconstriction qui favorise l’hémostase. Elle est caractérisée par une augmentation du débit sanguin mais un ralentissement circulatoire et se traduit par une accumulation de sang au site inflammatoire. Elle est déterminée par un mécanisme nerveux et un mécanisme chimique impliquant l’histamine, la sérotonine, les kinines et les prostaglandines provenant des mastocytes et des plaquettes.
• L’œdème inflammatoire qui, par augmentation de la perméabilité vasculaire, a pour conséquence de diluer le foyer inflammatoire, de limiter ce foyer par une barrière fibrineuse, de concentrer sur place les moyens de défense humoraux (immunoglobulines, complément),d’apporter des médiateurs chimiques et de ralentir le courant circulatoire par hémo-concentration. Ces différents phénomènes favorisent la diapédèse leucocytaire.
• La diapédèse leucocytaire est la traversée active des parois vasculaires par les leucocytes.
Elle est favorisée par le ralentissement circulatoire, la turgescence endothéliale et l’afflux leucocytaire.
La réaction cellulaire
Elle se caractérise par la formation d’un tissu de granulation inflammatoire. La composition du tissu de granulation varie en fonction du temps. L’inflammation aiguë est caractérisée par la présence de polynucléaires neutrophiles, mais l’évolution du tissu de granulation inflammatoire fait apparaître plus de cellules inflammatoires mononucléées (macrophages, lymphocytes, mastocytes et monocytes) que de polynucléaires. Puis progressivement, sous l’influence de facteurs de croissance, le tissu de granulation s’enrichit en fibroblastes et en cellules endothéliales.
La composition du tissu de granulation varie aussi en fonction de la cause de l’inflammation : un type cellulaire pouvant prédominer sur un autre.
Le granulome inflammatoire a pour but d’assurer la détersion par les phagocytes, de développer une réaction immunitaire B et/ou T et de sécréter de multiples médiateurs intervenant dans le recrutement cellulaire, la phagocytose, la défense immunitaire, et la modification de la matrice conjonctive. Durant ces phénomènes, des métabolites toxiques et des protéases peuvent être libérés dans l’espace extra-cellulaire, ce qui engendre des lésions tissulaires.
La détersion succède progressivement à la phase vasculo-exsudative, et est contemporaine de la phase cellulaire. La détersion est l’élimination des tissus nécrosés (issus de l’agression initiale ou du processus inflammatoire lui-même), des agents pathogènes et de l’exsudat, soit par phagocytose, soit par des mécanismes spontanés (ex : suppuration). La détersion prépare obligatoirement la phase terminale de réparation-cicatrisation. Si la détersion est incomplète, l’inflammation aiguë va évoluer en inflammation chronique. La réparation tissulaire suit une détersion complète. Elle aboutit soit à une cicatrice soit à une restitution intégrale du tissu. Le processus de réparation implique de nombreux facteurs de croissance et d’interactions complexes
entre cellules et matrice extra-cellulaire.
Les médiateurs de l’inflammation
On retrouve un grand nombre de médiateurs chimiques à tous les stades de l’inflammation, dans le plasma sous forme de précurseurs qui acquièrent leurs propriétés après activation (généralement par protéolyse) ainsi que des médiateurs d’origine cellulaire préformés et séquestrés dans des granules intra-cellulaires ou synthétisés suite à un stimulus. La plupart des médiateurs exercent leur action en se fixant aux récepteurs membranaires de cellules cibles. Ils provoquent des réactions en cascade par libération d’autres médiateurs qui peuvent agir eux-mêmes de façon synergique ou antagoniste, entraînant des mécanismes d’amplification ou de résistance à l’action
médiatrice initiale (Male et al., 2007).
Les anti-inflammatoires stéroïdiens
Les anti-inflammatoires stéroïdiens, également appelés corticostéroïdes, (prednisone, prednisolone, bêtaméthasone) sont des dérivés synthétiques des corticostéroïdes naturels, hormones sécrétées par les glandes cortico-surrénales. Ce sont des anti-inflammatoires puissants
largement utilisés pour supprimer les effets délétères des réponses inflammatoires. Ils agissent à différents niveaux par régulation (activation ou inhibition) de la transcription d’un grand nombre de gènes cibles (Janeway et al., 2009). Ils traversent librement les membranes et se fixent sur un récepteur spécifique appartenant à la superfamille des récepteurs nucléaires aux stéroïdes, libérant
des molécules chaperonnes dont Hsp90 (protéine de choc thermique). La formation du complexe glucocorticoïde-récepteur a lieu dans le cytoplasme, puis celui-ci migre vers le noyau pour agir sur la régulation de la transcription de gènes cibles (Figure 7). Les glucocorticoïdes inhibent la production de la PLA2 et donc la production d’éicosanoïdes. Ils inhibent également de nombreuses
cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6, TNFα…) en agissant sur certains facteurs de transcription nucléaires, en particulier NF-κB et AP-1. Cependant ils possèdent de nombreux effets indésirables tels que l’altération de la peau, la fragilité osseuse, l’apparition d’un état diabétique ou d’hypertension artérielle. Les corticostéroïdes améliorent le pronostic vital et fonctionnel de nombreuses maladies mais n’agissent pas sur la cause de la maladie.
Le stress oxydant
La production de radicaux libres par l’organisme est un mécanisme maîtrisé par les systèmes antioxydants. Dans des conditions physiologiques, la balance entre la production d’oxydants endogènes et l’apport ou la production d’antioxydants est à l’équilibre, les oxydants endogènes produits à faible dose étant utiles à l’organisme (Valko et al., 2007). En effet, les radicaux libres remplissent de nombreuses fonctions utiles dans l’organisme comme la transduction des signaux, la défense immunitaire, le cycle cellulaire, la phagocytose et l’inflammation. Ils participent aux voies de transduction du signal de plusieurs hormones et facteurs de croissance. Le stress oxydant joue un rôle dans la régulation de l’expression de certains gènes par régulation des facteurs de transcription comme NF-κB et AP-1 (Kabe et al., 2005), et à un stade plus élevé, un processus d’apoptose peut être déclenché si les capacités de réparation sont dépassées. Les radicaux libres sont nécessaires à l’organisme, on parle donc de balance antioxydants/oxydants. Les voies thérapeutiques doivent donc prendre en compte l’effet bénéfique des radicaux libres, car une élimination totale des radicaux libres pourrait être néfaste.
Lors d’un excès d’oxydants (endogènes ou exogènes) ou un déficit en antioxydants, l’excès de radicaux libres entraîne un état de stress oxydant. Le déficit en antioxydants peut provenir d’une carence alimentaire ou d’anomalies génétiques au niveau des systèmes antioxydants endogènes.
La capacité antioxydante
Un grand nombre de méthodes de mesure de la capacité antioxydante ont été développées ;cependant il existe une grande variabilité entre les études et donc une corrélation difficile entre les résultats. De par la diversité des espèces réactives et les différents mécanismes oxydatifs intervenant au sein de l’organisme, il est donc difficile de déterminer une seule méthode universelle de mesure de la capacité antioxydante que ce soit in vitro ou in vivo (Niki, 2010).La capacité des antioxydants à piéger les radicaux libres a été largement étudiée. Les différentes méthodes d’étude utilisées font intervenir soit une réaction avec un radical libre stable, soit une méthode de compétition, soit une réduction d’ions métalliques. On peut également classer ces méthodes en fonction du type de transfert impliqué : un atome d’hydrogène (HAT : Hydrogen Atom Transfert) ou un électron (SET : Single Electron Transfert).
Les méthodes SET
Les méthodes SET sont basées sur la capacité d’un antioxydant à transférer un électron afin de réduire un oxydant. Le suivi de la réaction rédox se fait généralement par colorimétrie par la différence de couleur de l’oxydant entre son état réduit et oxydé. La capacité antioxydante correspond donc à la capacité de réduction de l’antioxydant.On retrouve parmi les différentes méthodes SET, les méthodes DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle), TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) et FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). La méthode TEAC utilise l’ABTS (2,2′-azino-bis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate)) qui nécessite un radical peroxyle ou un autre oxydant pour donner le radical ABTS+• alors que les deux autres méthodes utilisent directement des radicaux libres stables. La méthode DPPH est une méthode rapide et largement utilisée, cependant la réduction du radical DPPH est suivie en UV-visible ce qui entraîne des interférences de mesure lorsque les antioxydants testés sont colorés et tout particulièrement avec les caroténoïdes (Prior et al., 2005).Les méthodes HAT sembleraient plus adaptées que les méthodes SET puisque les radicaux peroxyles sont les radicaux libres prédominants dans les systèmes biologiques, cependant les autres sources de radicaux (•OH, O2•−, RO2•…) sont également impliquées dans le stress oxydant.
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Table des matières
INTRODUCTION
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1. Présentation d’Astrocaryum vulgare Martius
I. Généralités sur la famille des Arecaceae
I.1. Botanique
I.1.1. Appareil végétatif
I.1.2. Appareil reproducteur
I.2. Intérêts
II. Généralités sur Astrocaryum vulgare Martius
II.1. Caractères botaniques
II.2. Distribution, culture et production
II.3. Utilisations traditionnelles
II.3.1. Usages industriels
II.3.2. Utilisations alimentaires et thérapeutiques
II.4. Études pharmacologiques
Chapitre 2. L’inflammation
I. La réaction inflammatoire
I.1. L’initiation : réaction vasculo-exsudative
I.2. La réaction cellulaire
II. Les cellules de l’inflammation
II.1. Les cellules phagocytaires
II.2. Les lymphocytes
II.3. Les mastocytes, polynucléaires basophiles et éosinophiles
II.4. Les fibroblastes
II.5. Les cellules endothéliales
II.6. Les plaquettes
III. Les médiateurs de l’inflammation
III.1. Les amines vaso-actives
III.2. Les médiateurs lipidiques
III.2.1. Les dérivés de l’acide arachidonique
III.2.2. Le facteur d’activation plaquettaire (PAF)
III.3. Les cytokines
III.4. Les molécules d’adhérence
III.5. Les systèmes d’activation plasmatiques
III.5.1. Le système des kinines
III.5.2. Le système du complément
III.5.3. Le système coagulation fibrino-formation/fibrinolyse
III.6. Les enzymes lysosomiaux
IV. Les anti-inflammatoires
IV.1. Les anti-inflammatoires stéroïdiens
IV.2. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens
Chapitre 3. Le stress oxydant
I. Les radicaux libres et leurs cibles
I.1. Les radicaux libres
I.2. Les cibles des ERO et ERN
I.2.1. Les lipides
I.2.2. Les protéines
I.2.3. L’ADN
II. Les systèmes antioxydants présents dans l’organisme
II.1. Les systèmes antioxydants enzymatiques
II.1.1. Les superoxides dismutases
II.1.2. La catalase
II.1.3. Les glutathions peroxydases
II.1.4. La thiorédoxine
II.2. Les systèmes antioxydants non enzymatiques
II.2.1. Les systèmes antioxydants non enzymatiques endogènes
II.2.2. Les systèmes antioxydants non enzymatiques exogènes
III. Le monoxyde d’azote
IV. La capacité antioxydante
IV.1. Les méthodes HAT
IV.2. Les méthodes SET
Chapitre 4. Les modèles d’études de l’inflammation
I. Du macrophage activé au choc septique
I.1. L’activation du macrophage
I.2. Le choc septique
I.2.1. Définition du choc septique
I.2.2. Physiopathologie du choc septique
II. L’œdème : un modèle d’inflammation aiguë
III. L’asthme : un modèle d’inflammation chronique
III.1. Généralités sur l’asthme
III.2. Physiopathologie de l’asthme
III.2.1. L’inflammation bronchique
III.2.2. Les conséquences fonctionnelles et cliniques
III.2.3. Le stress oxydant dans l’asthme
III.3. Les traitements de l’asthme
Chapitre 5. Phytochimie d’Astrocaryum vulgare
I. La pulpe d’awara
II. L’huile de pulpe d’awara
II.1. Généralités sur les huiles végétales
II.2. Caractéristiques de l’huile de pulpe d’awara
III. La fraction insaponifiable de l’huile de pulpe d’awara
III.1. Généralités sur la fraction insaponifiable des huiles végétales
III.2. Les caroténoïdes
III.2.1. Structure et classification
III.2.2. Propriétés biologiques
III.2.3. Composition en caroténoïdes de l’huile de pulpe d’awara
III.3. Les phytostérols
III.3.1. Structure et classification
III.3.2. Propriétés biologiques
III.3.3. Composition en phytostérols de l’huile de pulpe d’awara
III.4. Les tocophérols et tocotriénols
III.4.1. Structure et classification
III.4.2. Propriétés biologiques
III.4.3. Composition en tocophérols de l’huile de pulpe d’awara
TRAVAUX DE LA THESE
Matériels et Méthodes
I. Le matériel végétal
II. Préparation des échantillons
II.1. Extraction de l’huile de pulpe
II.2. Obtention de l’extrait insaponifiable brut d’huile de pulpe
II.3. Obtention de la fraction insaponifiable
III. Analyses chimiques
III.1. Détermination de la composition en acides gras de l’huile
III.1.1. Préparation des esters méthyliques
III.1.2. Analyse des esters méthyliques par CG
III.2. Détermination de l’acidité de l’huile
III.3. Détermination de l’indice de peroxyde de l’huile
III.4. Dosage des tocophérols
III.5. Dosage des caroténoïdes totaux
III.6. Identification et dosage des caroténoïdes par CLHP-DAD-SM
III.7. Identification et dosage des phytostérols par CG-SM
IV. Étude des propriétés antioxydantes
IV.1. Méthode du DPPH in vitro
IV.2. Méthode du SNP in vitro
V. Étude des propriétés anti-inflammatoires in vitro
V.1. Mesure de l’activité des COX
V.2. Activités in vitro sur une lignée de macrophages murins
V.2.1. Lignée cellulaire
V.2.2. Mesure de la viabilité cellulaire
V.2.3. Traitements et activation des cellules
V.2.4. Dosage des nitrites
V.2.5. Dosage des PGE2, du TNFα, de l’IL-6 et de l’IL-10
V.2.6. Analyse en Western-blot de l’expression de l’iNOS et de la COX-2
VI. Étude des propriétés anti-inflammatoires in vivo
VI.1. Modèle d’inflammation aiguë chez le rat : œdème à la carragénine
VI.2. Modèle d’inflammation aiguë chez la souris : choc endotoxique au LPS
VI.2.1. Traitements
VI.2.2. Prélèvements
VI.2.3. Dosage des protéines
VI.2.4. Dosage des cytokines
VI.2.5. Mesure de la capacité antioxydante du sérum
VI.3. Modèle d’inflammation bronchique chez le rat sensibilisé
VI.3.1. Modèle animal
VI.3.2. Sensibilisation et traitement
VI.3.3. Évaluation de l’inflammation
VII. Statistiques
Résultats et Discussion
I. Composition chimique, propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes de l’huile de pulpe d’awara
I.1. Caractéristiques physico-chimiques du fruit et de l’huile de pulpe d’awara
I.2. Effets de l’huile de pulpe d’awara et de l’extrait insaponifiable dans l’œdème à la patte induit par la carragénine
I.2.1. Effet de l’huile de pulpe d’awara
I.2.2. Effet de l’extrait insaponifiable
I.3. Publication
I.4. Conclusion
II. Composition chimique et propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes de la fraction insaponifiable
II.1. Préparation de la fraction insaponifiable
II.1.1. Solubilisation de l’extrait insaponifiable
II.1.2. Capacité de piégeage du radical DPPH
II.2. Comparaison de la composition chimique de l’extrait et de la fraction insaponifiable.
II.2.1. Comparaison de la teneur en tocophérols
II.2.2. Comparaison de la teneur en caroténoïdes
II.2.3. Comparaison de la teneur en phytostérols
II.3. Essais préliminaires en culture cellulaire
II.3.1. Effet de la fraction insaponifiable sur la viabilité cellulaire
II.3.2. Effet de la fraction insaponifiable sur des macrophages J774 non activés
II.3.3. Détermination des conditions de prétraitement en culture cellulaire
II.4. Publication n°2
II.5. Conclusion.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES.
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