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Généralités sur Aspergillus flavus et les mycotoxines (Aflatoxines)
Aspergillus flavus
Classification et caractérisation morphologique de Aspergillusflavus
Aspergillus flavus est une espèce de champignons (Johann Heinrich Friedrich Link, 1809) qui appartient au sous-règne des ascomycètes, à la classe Eutiomycètes, à l’ordre des Eurotiales, à la famille Trichocomacées, au genre Aspergillus et à l’espèce A. flavus. Il existe plusieurs espèces de Aspergillus: Aspergillus niger, A. ochratus, A. parasiticus, A. candidus, A. fumigatus, A. lucknowensis, A. sydowii, A. tamarii, A. terreus, A. versicolor, etc. (Kulwant et al., 1991; DFGSM, 2013). La variabilité génétique au sein des souches de Aspergillus flavus a fait l’objet de nombreuses études. Les études phylogénétiques précédentes ont conduit à deux critères de description. Selon Cotty (1989), il existe deux groupes morphologiques (« L » et « S ») en fonction de la taille du sclérote. Les isolats « L » produisent généralement des sclérotes de grande taille (> 400 Ilm de diamètre) peu abondants et éparses par opposition aux isolats « s » qui produisent des sclérotes de petite taille « 400 Ilm de diamètre) et abondants. Selon Geiser et al. (1998), les souches de A. flavus ont été organisées en groupe 1et groupe II basé sur le RFLP (restriction fragment length polymorphisms) du gène nucléaire codant et la séquence de l’ADN. Le Groupe 1 contient les souches L et S dont les souches toxinogènes produisent seulement l’aflatoxine B et le groupe II contient uniquement les souches S qui produisent les aflatoxines B et G. Les organes de reproduction et de diffusion (conidies) illustrés par la figure 1 sont des petites particules sphériques avec une surface rugueuse de 3 à 5 Ilm de diamètre. Elles sont formées de stipes rugueux mesurant 400 Ilm à 1 mm de long et se terminant par une vésicule de 20 à 50 Ilm de diamètre (Kulwant et al., 1991; Mathur et Kongsdal, 2003; ANSES, 2012).
Croissance, dissémination et cycle de vie de Aspergillus j1avus
La distribution de cet agent pathogène s’étend au monde entier mais de préférence dans les zones tropicales et subtropicales. Contrairement à la plupart des champignons, le développement de Aspergillus jlavus est favorisée par des conditions chaudes et sèches. Sa température optimale de croissance est de 37° C, mais il se développe également à des températures allant de 12 à 48° C. Ces microorganismes sont cosmopolites, capables de coloniser le sol, les débris végétaux et infectent plusieurs cultures comme les céréales (maïs, riz), arachides, coton, etc. (Inra, 2004 ; Bourais et Amine, 2006). Les conidies sont généralement dispersées dans l’environnement par le vent (l’air, la poussière) et l’eau de pluie mais aussi par les insectes et l’introduction anarchique des semences infectées d’une région à l’autre. Grâce à son pouvoir saprophytique, cet agent pathogène parvient facilement à coloniser les sols, les cultures en pleine croissance, les graines et aussi les aliments lorsque les conditions sont favorables. Le cycle de vie de ce champignon est caractérisé par la colonisation des débris végétaux dans le sol et l’invasion de nouvelles cultures. Les spores de A. jlavus se conservent dans le sol sous forme de sclérotes ou de mycélium et lorsque les conditions deviennent favorables, ils constituent l’inoculum primaire pour l’infection des graines et des cultures en pleine croissance. Cependant, en raison de la dispersion par le vent et les insectes, les conidies sont conduites sur les sites d’infection ou les blessures causées par des insectes ou des animaux sur les plantes. Après l’étape de l’infection, quand les conditions climatiques deviennent favorables (température, sécheresse et stress élevé), l’agent pathogène se développe davantage et réduit la résistance de l’hôte et les conidies ainsi produites sont les inocula secondaires qui retournent au sol et s’y conservent.
Toxicité et pathogénicité de Aspergillus flavus
A. jlavus attire l’attention à cause de sa pathogénicité sur plusieurs espèces végétales et animales, y compris les humains et les animaux domestiques. Ce champignon élabore diverses métabolites toxiques tels que l’aflatoxines BI et B2, acide aspergillique, acide kojique, acide cyclopia-zonique, acide 3-nitropropionique. Il est responsable d’otomycoses (Aspergilloses pulmonaires) et de kératites mycotiques. La sécrétion d’aflatoxines provoque aussi des troubles d’hépatites graves ainsi que de nombreux cancers (Poumon, foie, rate, estomac, colon et reins). Des aflatoxicoses aiguës ou chroniques ont été fréquemment observées en élevage. Les animaux les plus sensibles sont les volailles, les porcins, les jeunes ovins et bovins, ainsi que les truies (Ehrlich, 2006; AFSSA, 2009). En plus de sa toxicité sur la santé humaine et animale, ce champignon a également un effet négatif sur le développement et la croissance des plantes en raison de sa capacité à dégrader et à utiliser les différents substrats et composantes de plante tels que la cellulose, la pectine, la lignine, les tanins, la cutine, l’amidon, les lipides et les protéines (Guo et al., 1996; Long et al., 1998; Hasan, 1999; Brown et al., 2001; Mellon et Cotty 2004; Batra et Saxena 2005; Hom, 2007). Sa capacité à produire un large éventail d’enzymes dégradantes est révélatrice de son mode de vie opportuniste (Leger et al., 1997). Lorsque le sol ou les semences utilisées sont fortement infestés par ce champignon, la manifestation précoce de la maladie est la baisse de la capacité genninative des semences après la gennination, on a les fontes de semis qui se caractérisent par une nécrose du système racinaire et des jeunes tiges, suivie de la mort éventuelle des plantules. Les plantules survivantes présentent une diminution de vigueur et une réduction de résistance à toute situation de stress (Agrios, 1988).
Diversité des populations de Aspergillus flavus
Il y a une grande variété de sous espèces de A. jlavus. Il existe de nombreuses souches et différents Groupes de compatibilité végétative (VCG) (Cotty, 1989; Bayman et Cotty, 1993), mais toutes les souches ne sont pas capables de produire de l’aflatoxine. Certaines souches sont atoxinogènes car elles ne peuvent pas synthétiser l’aflatoxine. Il existe une réelle concurrence avec les souches toxiques lorsque les souches atoxinogènes sont appliquées sur les cultures. Le séquençage de l’ADN a conduit à la caractérisation génétique de plusieurs souches de Aspergillus jlavus. L’incapacité de certaines souches à produire l’aflatoxine est due à des mutations ou des modifications génétiques au sein du génome. Contrairement à A. parasiticus, environ 50 % des souches de A. jlavus sont productrices d’aflatoxine, mais cela varIe en fonction du substrat initial. La présence de ses deux groupes physiologiques (atoxinogènes et toxinogènes) dans un milieu ou sur un substrat conduit à une compétition exclusive. Parmi les souches atoxinogènes découvertes, la souche AF36 reste l’une des plus efficaces dans la lutte contre les aflatoxines produites par les souches atoxinogènes. Les efforts déployés pour réduire les concentrations d’aflatoxine dans les cultures reposent sur la lutte biologique à l’aide de la souche AF36 non toxinogène (NRRL 18543). Lorsque les souches toxinogènes sont appliquées sur les cultures, elles entrent automatiquement en concurrence avec les souches toxiques pour les ressources.
Généralement, l’application des souches atoxinogènes sur le sol entraîne une réduction importante ou l’élimination des souches toxinogènes. Hom et Domer (2007) et Wagacha et Muthomi (2008) ont montré une réduction de 77 à 98 % de la contamination par les aflatoxines dans les arachides avec l’application de souches atoxinogènes. De nombreuses études ont confirmé cette efficacité sur certaines cultures telles que les arachides (Cheng, 2007) et le maïs World Irade Organisation (WIO), 1998 ; Atehnkeng et al., 2008).
Mycotoxines
Le terme mycotoxine vient du grec «mycos» qui signifie champignon et du latin «toxicum» qui signifie poison (Quillien, 2002; Bourais et Amine, 2006). Ce sont des métabolites secondaires ou des substances toxiques dérivées des champignons microscopiques (Principalement Aspergillus, Penicillium. Fusarium). En effet, une seule espèce peut sécréter plusieurs types de mycotoxines et une mycotoxine peut être produite par différentes espèces de champignons. Les mycotoxines ont été découvertes pour la première fois en GrandeBretagne en 1960 où l’on a assisté à des pertes considérables des dindes suite à des nécroses importantes du foie causées par une famille de mycotoxine, les aflatoxines (Bourais et Amine, 2006). L’agent pathogène infeste les produits végétaux au cours du cycle végétatif ou pendant le stockage des récoltes et produit diverses substances toxiques. Ces métabolites sont de petites molécules, insolubles dans l’eau, stables à l’acidité et à la chaleur et difficilement dégradable par les organismes vivants. Ils sont généralement rencontrés dans un grand nombre de produits alimentaires et leur toxicité dépend des dérivés impliqués, la fréquence de l’exposition et la quantité ingérée (Qayyum, 2002 ; Boiron, 2006 ; Bourais et Amine, 2006). Certaines mycotoxines vont entraîner une intoxication aiguë avec apparition rapide de symptômes (Diarrhée, convulsions, etc.), tandis que d’autres donnent lieu à une toxicité chronique, avec des effets cumulatifs à long terme (cancérigène, hépatotoxique, hématotoxique, immuno modulateurs, effets mutagènes, oestrogéniques, neurotoxiques, nécrosantes et néphrotiques) (Qayyum, 2002 ; Boiron, 2006; Brochard et Le Bacle, 2009).
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Table des matières
Introduction
Première partie: Généralités sur Aspergillus fla vus et les mycotoxines (Aflatoxines)
1. Généralités sur Aspergillus flavus et les mycotoxines (Aflatoxines)
1.1 Aspergillus flavus
1.1.2 Classification et caractérisation morphologique de Aspergillus flavus
1.1.3 Croissance, dissémination et cycle de vie de Aspergillus flavus
1.1.4 Toxicité et pathogénicité de Aspergillus flavus
1.1.5 Diversité des populations de Aspergillus flavus
1.2 Mycotoxines
1.2.1 Aflatoxines
1.2.2. Facteurs de croissance des aflatoxines
1.2.3 Propriétés physico-chimiques et biochimiques des aflatoxines
1.2.4 Impact des aflatoxines sur la santé humaine et animal
1.2.5 Incidence économique des aflatoxines
1.2.6 Rôle des différentes souches de Aspergillus flavus dans la lutte biologique
1.3 Identification de l’ADN des souches de Aspergillus
1.3.1 Réaction de polymérisation en chaine ou Polymerase Chain Reaction (PCR)
1.3.2 Procédés d’amplification isotherme
Deuxième partie: Etude expérimentale
2. Matériel et méthodes
2.1 Croissance mycélienne des souches de A. flavus
2.1.1 Souches de A. flavus
2.1.2 Culture des différentes souches de Aspergillus flavus obtenues
2.2.1 Extraction de l’ADN des différentes Souches obtenues
2.2.2 Détermination de la qualité et de la concentration de l’ADN extrait
2.3 Réaction d’amplification de l’ADN extrait
2.3.1 Amplification génomique (PCR)
2.3.2 Loop-mediated isothennal amplification (LAMP)
2.3.3 Réaction d’amplification de la technique RCA
3. Résultats
3.1 Culture des souches de A. jlavus
3.2. Extraction d’ADN à partir du mycélium des souches
3.3 Alignement des séquences et conception des amorces
3.3.1 Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
3.3.2 LAMP (Loop mediated isothennal amplification)
3.3.3 RCA
4. Discussion
Conclusion générale
perspectives
5. Bibliographie
Annexes
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