Généralité sur le cancer du colon 

Généralité sur le cancer du colon 

Généralité sur le mélanome

Définition du mélanome 

Le mélanome est le cancer de la peau ou des muqueuses, développé aux dépens des mélanocytes. Son siège initial est la peau dans l’immense majorité des cas. Il existe des mélanomes de l’œil (mélanome choroïdien), des muqueuses (bouche, canal anal, vagin), et plus rarement, des organes internes. En dépit de ce que son nom suggère, un mélanome n’est pas toujours foncé. 5 % environ des mélanomes nodulaires sont « achromiques » de la couleur normale de la peau chez les personnes autres qu’à peau noire.
La peau est constituée de trois couches représentées par l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Le mélanome se forme dans environ 70 % des cas, sur une peau auparavant indemne, et dans environ 30 % des cas, sur un grain de beauté préexistant de type nævus. Il se développe à partir des mélanocytes. La kératose solaire favorise la survenue de ce cancer.
Ainsi, contrairement à une idée reçue, les naevus ne sont pas dans l’immense majorité des cas,
des états précancéreux qui se transforment en cancer suite à des expositions solaires multiples.
L’exérèse systématique des naevus dans le but d’éviter la survenue de mélanome est donc inutile. De plus, les naevus du tronc et de la face (zones habituellement plus exposées aux UV) n’ont pas plus de risque de se transformer en mélanome que ceux d’autres zones de la peau, qui sont plus protégées.

Epidémiologie 

La fréquence du mélanome augmente plus que celle de tout autre cancer (elle a doublé ces dix dernières années).Son incidence est très variable selon la latitude et la composition ethnique des populations. Il est de 5 à 15 nouveaux cas pour 100.000 habitants par an en Europe. Ce taux est bien plus élevé en Australie et en Nouvelle- Zélande (40 à 50 nouveaux cas pour 100.000 habitants par an), mais par contre nettement plus bas dans les pays à phototype V dominant (Asie, Amérique Latine) et plus bas encore en Afrique (rares cas de mélanomes palmoplantaires). En Europe, l’incidence diminue du Nord vers le Sud avec 15 nouveaux cas pour 100.000 habitants par an en Scandinavie et 5 à 7 nouveaux cas pour 100.000 habitants par an au pourtour de la Méditerranée.
Il est exceptionnel chez l’enfant, rare avant 20 ans. Au-delà, il survient à tous les âges. La sex-ratio en France (F/H) est de 1,4. Les femmes sont touchées en moyenne 3 à 5 ans plus tôt que les hommes. Il constitue le 1er cancer chez la femme entre 15 et 29 ans (25 % des cancers) et chez l’homme entre 30 et 44 ans.

Facteurs de risque 

La brûlure solaire, en particulier dans l’enfance15 et les antécédents familiaux16 sont les principaux facteurs de risque. L’exposition solaire régulière et modérée d’une peau susceptible de bronzer a un certain effet protecteur. Bien qu’il puisse apparaître partout, le mélanome a tendance à se former plus souvent sur les parties du corps qui sont couvertes dans la vie quotidienne mais exposées occasionnellement lors des bains de soleil, comme le torse et les jambes. De même, l’utilisation d’ultraviolets artificiels dans un but de bronzage, augmente significativement le risque de mélanome avec une nette corrélation avec les doses prises. Il semble également exister une majoration modérée du risque de survenue d’un mélanome en cas d’antécédent d’endométriose ou de fibrome de l’utérus chez la femme.La couleur de la peau joue également un rôle important. Le risque est plus que doublé chez les roux et très sensiblement augmenté chez les personnes avec peau pâle18. Il est plus de dix fois moins important chez les personnes de couleur de peau non blanche.

Physiopathologie du mélanome 

Les mécanismes d’apparition des mélanomes ne sont pas complètement élucidés. Les études épidémiologiques ont montré une corrélation entre une exposition solaire brutale et intense (brûlure solaire) et l’apparition d’un mélanome. Ce dernier peut cependant survenir sur des zones cutanées non exposées au soleil.Le développement de mélanome commence par une lésion bénigne dans les mélanocytes au niveau de la couche basale. Cette lésion se propage superficiellement suite à une série de division cellulaire incontrôlée. Il donne naissance à des cellules de forme irrégulière avec un noyau volumineux et un cytoplasme peut abondant. La propagation se poursuit radialement puis verticalement pour arriver finalement au stade le plus dangereux qui est le mélanome métastatique où les cellules cancéreuses se propagent par la circulation sanguine et lymphatique dans tout le corps vers les poumons, le foie et le cerveau.

Altérations génétiques dans le mélanome 

5 à 10 % des patients ayant un mélanome ont un antécédent familial de cette maladie. Des mutations sur plusieurs gènes sont associées avec ce cancer. Comme la mutation de CDKN2A située sur le chromosome 9, des mutations dans les gènes GNAQ/GNA11, N-ras, KIT, PTEN ont été mise en évidence. La mutation la plus fréquente est celle trouvée dans le gène BRAF. Elle est présente dans plus d’un cas sur deux de mélanomes métastasés.
Son incidence augmente de plus de 2 % par an, mais elle tend à se stabiliser dans certains pays, probablement du fait des changements d’habitude d’exposition au soleil.
Cependant, sa mortalité diminue régulièrement, probablement du fait que la plupart des mélanomes détectés sont de petite taille, et donc, de meilleur pronostic.

Généralités sur les gliomes 

Définition des gliomes 

Les gliomes ou tumeurs gliales sont des tumeurs du système nerveux central (SNC).
Ils sont localisés le plus souvent dans l’encéphale, parfois dans la moelle épinière. Ils proviennent des cellules qui entourent les neurones : astrocytes, oligodendrocytes et épendymocytes. Une théorie plus récente laisserait supposer que des cellules progénitrices (cellules non encore différentiées), voire des cellules souches, seraient à l’origine de ces tumeurs. Ce sont des tumeurs rares, dont le pronostic est extrêmement variable. Elles justifient toujours une prise en charge dans un service spécialisé afin d’adapter au mieux le traitement.Le cerveau est constitué de plusieurs lobes (pariétal, frontal, occipital, temporal) et de différentes parties profondes, comme le thalamus. Il communique avec le reste du corps par des influx nerveux transportés par la moelle épinière, qui se poursuit à l’intérieur du crâne par le tronc cérébral. Le tronc cérébral, le cerveau et le cervelet forment ce que l’on appelle l’encéphale.

Epidémiologie des gliomes 

Chaque année, approximativement 2 500 personnes au Canada et 3000 en France sont atteintes d’une tumeur au cerveau. La plus fréquente est un gliome. Il s’agit de la tumeur primitive cérébrale la plus fréquente, représentant 70% de gliomes26. L’incidence annuelle est de 5 à 7 sur 100 00036. Ces tumeurs sont la troisième cause de mortalité chez l’adulte jeune.Chez l’enfant, il s’agit du deuxième cancer le plus fréquent après la leucémie.Les gliomes peuvent se manifester à tout âge avec une pointe d’incidence à la trentaine pour les gliomes de bas grade et une pointe à la cinquantaine pour la forme la plus agressive, les glioblastomes multiformes (GBM). L’incidence des GBM, très faible chez l’enfant, augmente de façon linéaire jusqu’à 75 ans pour diminuer ensuite.Les GBM restent des tumeurs relativement rares ; en Europe et aux Etats-Unis, l’incidence des GBM est respectivement à 2 et 3 sur 100 000. Cette incidence a cependant augmenté au cours des 30 dernières années37. Ceci s’explique par le vieillissement de la population avec un accroissement du nombre de cas au-delà de 70 ans. L’amélioration de l’accès à l’imagerie et des moyens diagnostiques (radiologiques, histologiques) peuvent aussi expliquer cette augmentation.

Physiopathologie des gliomes 

L’évolution des gliomes passe par plusieurs étapes se caractérisant par des mutations, délétions ou inactivation des protéines spécifiques. Le type des gliomes est différent selon les étapes. Le schéma suivant explique la progression des cellules souches vers des cellules cancéreuses.

Classification des gliomes 

La classification histologique de référence est celle de l’OMS révisée en 2007. Elle est basée sur le type cellulaire prédominant (astrocytaire, oligodendrocytaire ou mixte). Un grade est attribué à chaque tumeur en fonction des critères suivants : la densité cellulaire, l’atypies nucléaires, les mitoses, la prolifération micro vasculaire et nécrose.La classification de l’OMS pose différents types de problèmes. Elle n’est pas reproductible car elle repose sur des critères morphologiques qualitatifs qui laissent une grande part à l’interprétation et à la subjectivité. Ceci explique notamment un taux élevé de discordance selon l’observateur en terme de grade et de « lignage ». Elle ne tient pas compte de l’hétérogénéité tumorale et ne prend pas en considération des données de la clinique et de l’imagerie.Les gliomes de grade I correspondent essentiellement à l’astrocytome pilocytique, circonscrit bénin. Les gliomes infiltrants sont de bas grade (II) ou de haut grade (III ou IV).

Altérations génétiques liées au gliome 

Les études génétiques réalisées ces dernières années, ont permis de décrire les principales anomalies récurrentes caractéristiques des gliomes. Il s’agit d’une activation de certaines voies de transduction du signal avec amplification d’oncogènes, tels que EGFR, Braf, dérégulation du cycle cellulaire avec délétion de gènes suppresseurs de tumeurs, tels que p16, p53.Des modèles de progression tumorale ont été proposés. En revanche, ces anomalies ne sont pas spécifiques d’un type histologique donné et leur valeur pronostique est souvent controversée, à l’exception de la perte totale du chromosome 1p combinée à celle du 19q caractéristique des oligodendrogliomes, leur conférant un bon pronostic. Dans l’avenir, l’analyse du transcriptome ainsi que les travaux portant sur les cellules souches neurales fourniront des éléments clés pour la compréhension des mécanismes de gliomagenèse27. La figure suivante résume l’ensemble des altérations génétiques en fonction des grades de gliome.

Etude statistique

Pour évaluer les caractéristiques épidémiologiques des différentes tumeurs étudiées, une étude statistique rétrospective a été réalisée. Les cas étudiés ont été recrutés et recensés au sein du service d’anatomie pathologique du CHU Hassan II de Fès par l’unité de génétique médicale et d’oncogénétique.Au cours des ces deux dernières années, une augmentation du nombre de patients souffrant d’un cancer donné a été remarquée. Cette augmentation peut être en partie expliquée, par l’inauguration du nouveau CHU Hassan II de Fès et par conséquent, le recrutement de plus de malades, provenant des différentes localités autour de Fès pour la prise en charge. La présence d’un CHU, implique l’augmentation de la capacité litière et la mise en place de nouvelles techniques d’exploration et de biopsie (biopsie écho-guidée pour le cancer de prostate, biopsie scanno-guidée…)

Etude histochimique 

L’étude histochimique réalisée sur les échantillons du mélanome a confirmé que les cas analysés en examen histologique sont de vrais mélanomes de type malin. Le résultat a été confirmé en utilisant des anticorps qui révèlent l’expression des antigènes spécifiques.Les anticorps utilisés ne sont pas tous spécifiques; seul l’anti-Melan A, s’il donne un marquage positif, permet de confirmer que la tumeur examinée est maligne et est de type mélanome. Cet anticorps qui est monoclonal marque 80 à 90 % des mélanomes. Son marquage est cytoplasmique et souvent très homogène. Il est responsable de la coloration bleue qui apparait dans les lames au cours de leur observation.
Il existe un autre anticorps très spécifique appelé HMB45, mais qui n’a pas été utilisé pour notre étude. Par contre, l’anti PS100 qui est le plus sensible des marqueurs cytoplasmique et nucléaire est non spécifique des tumeurs mélanocytaires. Il ne permet pas la distinction entre tumeurs bénignes et malignes. Il est utilisé juste pour voir le taux d’expression de l’antigène ciblé.

Etude moléculaire 

Le dosage d’ADN extrait à partir des tumeurs de colon présente la concentration d’ADN la plus élevée. Ce résultat peut être dû à la taille du fragment analysé qui est plus grande (plus de cellules cancéreuses) que les fragments de mélanome et cérébral. La concentration d’ADN est évidemment proportionnelle à la quantité de cellules tumorales à partir desquelles l’extraction est réalisée.
Pour les échantillons du mélanome, bien que la taille du fragment était assez grande, la concentration de l’ADN extrait était moins élevée par rapport à l’ADN des tumeurs du colon.
Ce résultat peut être expliqué de deux façons:
– la première est la durée de fixation des fragments dans le formol qui est normalement différente selon la taille du fragment. Dans ce cas les fragments pourraient être incubés pendant un temps plus long et en utilisant un type de formol qui peut alterer les cellules et par conséquent diminuer la concentration finale de l’ADN.
– Un autre argument qui est plus sûre est l’effet de la mélanine qui se trouve dans les cellules mélanocytaires. Une équipe de recherche a montré que ce pigment altère le dosage d’ADN48. Pour cette raison, un de nos échantillons qui était destiné à l’analyse a été exclu parce qu’on n’a pas pu le doser.
Pour les échantillons de tumeur cérébrale, la petite taille des fragments analysés (seulement des biopsies) est certainement la cause principale de ce faible résultat de dosage.
Au cours de la PCR, seulement 20 cas parmi 34 cas du colon, et 11 cas parmi 16 cas du mélanome ont donné une bonne amplification. L’analyse de la courbe d’absorbance des échantillons non amplifiés montre qu’ils sont de mauvaise qualité. L’ADN est dégradé, et pour cette raison, l’amplification a échoué.
Le résultat PCR montre une bande correspondant à la séquence amplifiée de l’exon 15 du gène BRAF d’une taille approximative de (143pb). Cette bande est visible pour 20 patients atteints du cancer colorectal, pour 11 patients atteints du mélanome et pour 10 patients atteints de l’astrocytome pilocytique. La taille de la bande est presque la même que celle obtenue dans
une étude qui vise à détecter la mutation de B-raf dans différents type de cancer11.
Les résultats montrent aussi qu’après le séquençage, la mutation est plus fréquente dans le mélanome.
Puisque le gène B-raf et K-ras entrent dans la même voie de signalisation qui active la division cellulaire, donc forcement la mutation de l’un ou de l’autre gène peut agir sur l’efficacité du traitement ciblé donné. Pour cela il faut détecter la mutation dans les deux gènes.
L’exon 2 du K-ras de quelques échantillons du colon a été amplifié par PCR puis séquencé pour vérifier la présence ou non de mutation. Malheureusement, aucun des échantillons n’a donné un bon résultat. Probablement il s’agit d’ un problème technique.
D’après l’étude de Laurent-Puig P et al, en 2009 ; cinquante pour cent des malades dont le cancer ne présente pas de mutation de gène KRAS ne répondent pas aux anticorps anti-EGFR. Dans ce contexte, la mutation activatrice de BRAF, pourrait constituer d’autres biomarqueurs de résistance. Les mutations de BRAF, mutuellement exclusives de celles de KRAS, constituent un facteur de résistance aux anticorps anti-EGFR obéissant aux mêmes mécanismes que les mutations de KRAS. Il existe un point chaud de mutation au niveau du quinzième exon du gène BRAF, représentant plus de 90 % des mutations observées, responsable du changement d’une valine en acide glutamique en position 600 (V600E), du fait de la transversion T1799A. La région mutée correspond au domaine kinase de la protéine, qui est une sérine/thréonine kinase. La mutation de BRAF, outre sa valeur prédictive négative, représente également un facteur de très mauvais pronostic.
Jusqu’aujourd’hui, seulement la mutation de gène K-ras est demandée dans le diagnostic. Celle de B-raf est demandée juste pour le pronostic.
On peut donc conclure que le rôle des mutations du gène BRAF chez les patients traités par des agents anti-EGFR est identique à celui joué par les mutations du gène K- Ras.
L’analyse combinée des mutations de KRAS et BRAF devrait être utilisée pour sélectionner prospectivement les patients atteints de CCR, éligibles pour un traitement par les anti-EGFR,
d’où la nécessité de l’étude moléculaire de la mutation du gène KRAS.
Pour confirmer l’utilité de la technique PCR allèle spécifique dans la détection des mutations, cette dernière a été réalisée pour les 11 cas de mélanome. Cette technique a permis de confirmer les
résultats de séquençage par l’apparition de 3 bandes pour 3 échantillons, montrant la présence de
mutation dans l’ADN de ces tumeurs.
Des études similaires sur d’autres maladies génétiques comme la maladie, JAk 2, ont été réalisées par l’utilisation de la technique de PCR allèle spécifique. Ces études ont montré que cette technique est plus sensible dans la détection de mutations en cas d’hétérozygote que le séquençage.

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Table des matières

Introduction
Chapitre I : Partie bibliographique
I. Généralité sur le mélanome
1. Définition du mélanome
2. Epidémiologie
3. Facteurs de risque
4. Physiopathologie du mélanome
5. Altérations génétiques dans le mélanome
II. Généralité sur le cancer du colon 
1. Définition du cancer du colon
2. Epidémiologie du cancer du colon
3. Facteurs de risque
4. Physiopathologie du cancer du colon
5. Types du cancer du colon
6. Altérations génétiques liées au cancer du colon
III. Généralités sur les gliomes
1.Définition des gliomes
2. Epidémiologie des gliomes
3. Physiopathologie des gliomes
4. Classification des gliomes
5. Altérations génétiques liées au gliome
IV. Généralité sur B-raf 
1. Gène B-raf1
2. Protéine B-raf (rapidly accelerated fibrosarcoma)
3. Fonction de la protéine B-raf
4. Mutations dans le gène B-raf
5. Mutation du gène B-raf dans le mélanome
6. Effet de mutation de B-raf sur le développement de mélanome
7. Mutation de B-raf dans le cancer du colon
8. Géne K-ras
9. Altération de B-raf dans les astrocytomes pilocytiques
V. Méthodes de diagnostic 
1. Immunohistochimie
2. Techniques moléculaires
CHAPITRE 2 : Matériel et méthode
I. Matériel utilisé 
II. Méthode
1) Biopsie
2) Examen histologique sur tissu fixé
a) La fixation
b) L’inclusion
c) Réalisation des coupes ou microtomie
d) Coloration
e) Le montage
3) Immunohistochimie
a) Principe
b) Protocole expérimental de l’immunohistochimie manuelle
4) Etude moléculaire
a) Extraction d’ADN à partir de tissus tumoraux
b) Test qualité de l’ADN : dosage des acides nucléiques
c) Amplification de l’ADN extrait par PCR
d) Détection et analyse des produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
e) Séquençage des produits PCR des gènes BRAF
f) Lecture de la séquence
CHAPITRE 3 : Résultat
I. Etude statistique
1. Cancer du colon
2. Mélanome
3. Gliomes
II. Etude histologique 
1. Cancer du colon
2. Mélanome
III. Etude immunohistochimique
IV .Etude moléculaire 
1. Cancer du colon
1.1. Résultat de PCR
1.2. Séquençage
2. Mélanome
2.1. Résultat de PCR d’exon 15 du B-raf
2.2. Résultat de séquençage
CHAPITRE 4 : Discussion des résultats
I. Etude statistique 
1. Cancer du Colon
2. Mélanomes
3. Gliomes
II. Etude histologique 
1. Cancer du colon
2. Mélanome
III. Etude histochimique 
IV. Etude moléculaire 
Conclusion et perspectives
Références

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