Soutenance mémoire
Formation du réseau vasculaire
Le tissu adipeux humain
Le tissu adipeux, présent en grande quantité chez les mammifères, est surtout connu pour permettre de survivre à des épisodes d’apports caloriques limités en emmagasinant de l’énergie excédentaire sous forme de lipides lors de périodes d’abondance. Les adipocytes, principales cellules composant le tissu adipeux, sont les seules cellules qui sont spécialisées et parfaitement adaptées pour accumuler les lipides sans compromettre leur intégrité fonctionnelle grâce à leur machinerie enzymatique appropriée (Fonseca-Alaniz et al. 2007). Il existe deux types de tissus adipeux qui sont fondamentalement différents par leur distribution, leurs fonctions et leur histologie : le tissu adipeux brun et le tissu adipeux blanc. Le tissu adipeux brun joue un rôle important dans la régulation de la thermogenèse grâce à la grande quantité de protéines UCP-1 (uncoupling protein-1) ou thermogénine que l’on y retrouve.Cette protéine, située dans la membrane interne des mitochondries, agit à titre de canal à protons. Elle permet d’éliminer la différence de potentiel à la membrane, empêchant ainsi la production d’ATP (adénosine triphosphate) par l’ATPase. L’énergie résiduelle est alors libérée sous forme de chaleur (Cannon and Nedergaard 2004). La grande quantité de mitochondries dans la cellule peut être à l’origine de leur couleur brunâtre. Les adipocytes composant le tissu adipeux brun ont un diamètre variant entre 30 et 40 μm, contiennent plusieurs gouttelettes lipidiques de tailles variées et ont un cytoplasme relativement abondant (Fonseca-Alaniz et al. 2007). Les humains, tout comme les rongeurs, possèdent des dépôts de tissu adipeux brun. Très localisés, on les retrouve chez les foetus et les nouveau-nés, dans les régions axillaires, cervicales, périrénales et surrénales (Cannon and Nedergaard 2004).Bien que le tissu adipeux brun soit présent tout au long de la vie du rongeur, on croyait traditionnellement que les dépôts chez l’humain s’atrophiaient au cours des premières années de vie de l’enfant, jusqu’à devenir négligeables à l’âge adulte (Gesta et al. 2007). Cependant, l’utilisation de la tomographie à émission de positrons au fluorodéoxyglucose (FDG PET) en oncologie a permis de mettre en évidence la persistance de dépôts de gras brun chez l’adulte. En effet, le traceur utilisé se concentre dans des régions métaboliquement très actives, disposées symétriquement dans le haut du corps, soit dans le cou, sous les clavicules et le long de la colonne vertébrale (Figure 1.1A) (Nedergaard et al. 2007). L’intérêt envers ce tissu est grandissant car ce dernier pourrait devenir une cible dans l’élaboration d’un traitement contre l’obésité en tirant profit de la dépense énergétique qu’il entraîne, puisqu’il a été démontré que l’activité du gras brun peut être stimulée chez l’humain (Ouellet et al. 2012, van Marken Lichtenbelt et al. 2009).
Les adipocytes
Les adipocytes du tissu adipeux blanc sont les cellules différenciées qui possèdent la machinerie cellulaire nécessaire à l’accumulation des lipides. Leur taille peut varier, mais elle peut atteindre plus de 100 fois celle d’un globule rouge, soit de 60 à 100 μm en moyenne, et même atteindre plus de 120 μm chez les personnes obèses (Hauner 2004). Les gouttelettes lipidiques contenues dans la cellule peuvent atteindre 85 à 90 % de la masse cellulaire, repoussant les autres constituants du cytosol (organelles, noyau) au pourtour de la cellule. Dans le tissu adipeux, chacun des adipocytes est à proximité de capillaires. Le tissu adipeux est doté d’une grande plasticité qui lui est unique. Pour pouvoir assurer l’homéostasie de l’énergie en fonction de l’apport et des dépenses énergétiques, il doit pouvoir s’adapter facilement. Ainsi, en présence d’une balance énergétique positive, l’énergie supplémentaire peut être accumulée sous forme de 6 triglycérides dans les cellules adipeuses existantes, qui augmenteront alors en taille (hypertrophie) ou encore nécessiter la différenciation de nouveaux adipocytes à partir de précurseurs pour répondre à la demande (hyperplasie). Il existe un équilibre entre les deux phénomènes. Bien qu’on estime le nombre d’adipocytes relativement constant à l’âge adulte, l’adipogenèse est essentielle pour assurer le renouvellement et l’intégrité du tissu adipeux. Chez un adulte, on estime que 10% des cellules adipeuses se renouvelleront annuellement (Spalding et al. 2008).
L’adipogenèse se compose de deux phases principales.
La première phase, nommée détermination, consiste en la prolifération des cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux et de leur engagement dans la voie de différenciation adipocytaire pour former les précurseurs des adipocytes (préadipocytes). Bien que le phénotype cellulaire change peu lors de cette étape, les préadipocytes commencent à exprimer des marqueurs précoces de la différenciation adipocytaire. Les processus cellulaires responsables de la détermination des cellules souches vers cette voie de différenciation sont encore incertains (Butterwith 1994, Gregoire et al. 1998, Guilak et al. 2006). Des études ont cependant mis en évidence l’implication de certains facteurs de transcription tels que Zfp423 et Zfp467 (Protéine à doigt de zinc 423 et 467, ou Zinc finger protein 423 et 467) comme régulateurs potentiels dans le recrutement des préadipocytes par leur action sur l’expression de protéines clés de l’adipogenèse (Cawthorn et al. 2012, Gupta et al. 2010, Quach et al. 2011). La différenciation des préadipocytes en adipocytes matures constitue la deuxième phase de l’adipogenèse (Butterwith 1994). Elle est caractérisée par une augmentation de l’activité lipogénique, qui nécessite une machinerie enzymatique appropriée permettant le transport des lipides, la sensibilité à l’insuline et la sécrétion de protéines spécifiques aux adipocytes (Butterwith 1994).On observe également l’adoption graduelle d’une morphologie uniloculaire caractéristique de l’adipocyte mature qui remplace la morphologie fibroblastique associée aux préadipocytes. In vitro, les cellules doivent atteindre la confluence et cesser leur croissance en phase G1/S du cycle cellulaire pour engendrer de tels changements (Ailhaud et al. 1989, Amri et al. 1986). Plusieurs signaux extracellulaires peuvent mener à l’adipogenèse, mais la cascade de signalisation impliquant les facteurs de transcription de la famille des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxisomes (PPAR) et de la famille C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein) joue un rôle déterminant (Figure 1.3).Les lignées cellulaires 3T3-L1 et 3T3-F422A ont grandement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l’adipogenèse (Green and Kehinde 1975, 1976) et des études effectuées sur le gras humain et murin ont confirmé que ce modèle était approprié pour l’étude générale de la formation de l’adipocyte chez l’animal. Bien que l’utilisation de telles cellules offre l’avantage de travailler avec une population cellulaire homogène au niveau du stade de différenciation, les processus cellulaires étudiés à l’aide de lignées cellulaires sont parfois moins représentatifs que ceux retrouvés dans des préadipocytes humains (Ali et al. 2013). Les membres de la famille des PPARs sont des récepteurs nucléaires jouant le rôle de facteurs de transcription. Ils agissent sur le métabolisme des lipides et des acides gras, ces derniers étant des ligands naturels des PPARs (surtout l’acide arachidonique et ses métabolites) (Obregon 2008). On dénombre plusieurs membres de la famille des PPARs : PPARα, qui régule la β-oxidation, le catabolisme des lipides et l’inflammation, PPARβ/δ, dont le rôle physilologique est moins bien connu, mais qui semble être impliqué dans le catabolisme des lipides dans le muscle squelettique et la sensibilité à l’insuline, et PPARγ (Grimaldi 2007, Obregon 2008).Il existe deux isoformes de la protéine PPARγ, soit PPARγ1 et PPARγ2, qui sont identiques, bien que PPARγ2 soit doté de 30 acides aminés supplémentaires à l’extrémité N-terminale (Fajas et al. 1997). PPARγ1 est retrouvé dans plusieurs tissus alors que le PPARγ2 est exprimé presque exclusivement dans le tissu adipeux (Farmer 2006). PPARγ est le régulateur majeur de l’adipogenèse et est nécessaire pour le maintien d’un état différencié de la cellule (Rosen and MacDougald 2006). Le mode d’action de ce récepteur nucléaire nécessite la formation d’un hétérodimère avec le récepteur X de l’acide rétinoïque (RXR), activant ainsi l’élément de réponse à PPAR (PPRE), que l’on retrouve dans le promoteur de plusieurs gènes cibles de l’adipogenèse, dont l’ «adipocyte protein» 2 (aP2), la synthase des acides gras (fatty acid synthase, FAS), la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK), la lipoprotéine lipase (LPL), la stéaroyl-CoA désaturase (SCD), etc (Obregon 2008). PPARγ induit également l’expression d’un isoforme protéique de la famille des « basic leucine zipper », C/EBPα, un autre gène clé de l’adipogenèse. PPARy est capable d’induire l’adipogenèse dans des cellules déficientes en C/EBPα, mais l’inverse ne s’applique pas (Rosen et al. 2002), faisant de PPARγ le facteur déterminant de l’adipogenèse.
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Table des matières
Résumé
Abstract
Table des matières
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Remerciements
Chapitre 1 : Introduction générale
1.1 Le tissu adipeux humain
1.1.1 Types de tissus adipeux et distribution dans le corps humain
1.1.2 Types de cellules composant le tissu adipeux blanc
1.1.2.1 Les adipocytes
1.1.2.2 Les cellules endothéliales
1.1.2.3 Les cellules stromales/souches du tissu adipeux
1.1.3 Fonction du tissu adipeux blanc
1.1.3.1 Protection physique et thermogenèse
1.1.3.2 Emmagasinage d’énergie et métabolisme des lipides
1.1.3.3 Organe endocrine
1.2 Formation du réseau vasculaire
1.2.1 Vasculogenèse
1.2.2 Angiogenèse
1.2.3 Réseau vasculaire du tissu adipeux
1.2.3.1 Relation entre l’adipogenèse et l’angiogenèse
1.2.3.2 Propriétés angiogéniques du tissu adipeux
1.2.3.3 Modèles d’étude de l’angiogenèse in vitro
1.3 La greffe de tissu adipeux
1.3.1 Modèles de tissus adipeux reconstruits in vitro
1.3.3 Modèles de tissus adipeux reconstruits enrichis en cellules endothéliales
1.4 Problématique et objectifs
Chapitre 2 : Formation de réseaux de capillaires dans des tissus humains produits par génie tissulaire : impact des adipocytes et de leurs produits sécrétoires.
2.1 Avant-Propos
2.2 Résumé
2.3 Manuscrit soumis pour publication
2.3.1 Abstract
2.3.2 Introduction
2.3.3 Materials and methods
2.3.3.1 Cell isolation and amplification
2.3.3.2 Production of human connective and adipose reconstructed tissues
2.3.3.3 Histological analyses and measurements
2.3.3.4 Quantification of adipose differentiation by Oil Red O staining
2.3.3.5 Immunolabelings and analyses on tissue cryosections
2.3.3.6 Confocal imaging and analyses
2.3.3.7 Quantification of secreted products from reconstructed tissues (ELISA)
2.3.3.8 Statistical analyses
2.3.4 Results
2.3.4.1 Defining optimal conditions for production of endothelialized tissues
2.3.4.2 Revealing the endothelial networks formed in presence or absence of adipocytes
2.3.4.3 Determination of capillary’s mean diameter
2.3.4.4 Influence of the tissue microenvironment: kinetics of bioactive molecule secretion
2.3.4.5 Impact of endothelial cells within the substitutes
2.3.4.6 Impact of adipocytes
2.3.4.7 Impact of coculture media
2.3.5 Discussion
2.3.6 Conclusion
2.3.7 Acknowlegments
2.3.8 References
Chapitre 3 : Discussion générale
3.1 Influence des adipocytes sur la formation du réseau de capillaires dans les tissus reconstruits
3.2 Comparaison des profils de sécrétion de molécules ayant des effets pro-angiogéniques
3.3 Comparaison avec d’autres modèles
Chapitre 4 : Conclusion
Bibliographie
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