Fonctions physiologiques et patho-physiologiques du NMD et de ses facteurs

Importance des contrôles pour l’expression des gènes

   La production des protéines en quantité et de qualité nécessaire pour la vie d’une cellule dépend du bon déroulement des étapes indiquées précédemment. Des erreurs sont possibles à chaque niveau. C’est pourquoi, des systèmes de contrôle détectent ces erreurs, les corrigent ou les éliminent. La qualité des ARNs par exemple est très contrôlée (Figure 1) afin d’éviter la traduction d’ARN dit « aberrant ». Par le terme aberrant, on considère ici les ARNs qui, étant apparentés à des ARNm qui codent pour des protéines cellulaires, ne servent pas à cette fonction. Des exemples d’ARNs aberrants sont présentés dans les paragraphes suivants. La transcription est la plus grande source d’erreur pour la synthèse des ARNs aberrants avec quatre erreurs pour un million de bases transcrites (Gout et al., 2017) c’est-à-dire cent fois plus que les erreurs de réplication de l’ADN (Lynch et al., 2016). Les erreurs peuvent être des insertions ou des délétions de base qui provoquent ensuite des changements du cadre de lecture pour la traduction et le codage de codon Stop précoce (PTC : Premature Termination Codon). Ces erreurs sont très délétères car elles peuvent aboutir à la production de protéines tronquées (Hall and Thein, 1994). L’effet de ces mutations dépend du gène dans lequel elle a lieu et si cela aboutit à la production d’une version dominant-négative de la protéine ou non. Dans le cytoplasme, tous les ARNs sont finalement dégradés par leurs deux extrémités par des exonucléases non spécifiques. Dans la plupart des cas, les protéines tronquées n’ont pas d’effet sur le phénotype, mais elles peuvent aussi être toxiques, en cas d’agrégation par exemple (Leeuwen et al., 1998) ou si elles entraînent une perte de fonction par effet de dose (Fan et al., 2001). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), les erreurs de transcription sont associées à un stress protéotoxique ainsi qu’à une augmentation du vieillissement (Vermulst et al., 2015). En plus des erreurs de fidélité de la transcription, le développement du séquençage des ARNs à haut débit a permis d’identifier des catégories d’ARN non traduits provenant de la forte activité de l’ARN polymérase II. Celle-ci s’associe aux régions d’ADN dépourvues de nucléosomes et peut initier des événements de transcription sur le brin sens comme sur le brin anti-sens (Neil et al., 2009; Xu et al., 2009), en amont ou en aval des sites de démarrage de la transcription canonique (Zhang and Dietrich, 2005; Pelechano et al., 2013; Malabat et al., 2015). C’est la transcription « pervasive » (résumé dans Jensen et al., 2013). Ces transcrits plus ou moins longs peuvent avoir une terminaison de la transcription anormale et, dans ce cas, sont reconnus par un complexe de surveillance des arrêts précoces de transcription et dégradés. Ces transcrits sont appelés les transcrits cryptiques non stables (CUT : Cryptic Unstable Transcripts), ils ne sont pas visibles dans des conditions sauvages car dégradés trop rapidement. Pour les observer, il faut inactiver le contrôle nucléaire (Wyers et al., 2005; Davis and Ares, 2006; Houalla et al., 2006). Parfois, les transcrits pervasifs échappent à ce contrôle précoce et sont exportés vers le cytoplasme. Dans d’autres cas, les transcrits ont une terminaison normale et sont de tout point de vue normaux par rapport aux systèmes de contrôle qualité nucléaire. Une fois arrivés dans le cytoplasme, ces divers types de transcrits aberrants entrent en traduction, ce qui déclenche leur dégradation rapide. Cette dégradation commence par l’enlèvement de la coiffe et est poursuivie par la dégradation par Xrn1, une exonucléase 5’ vers 3’ non spécifique. Si on observe une stabilisation d’un transcrit dans des cellules qui n’ont pas de Xrn1, on parle alors de XUT (Xrn1-dependent Unannotated Transcripts ; van Dijk et al., 2011). Certains transcrits pervasifs sont plus résistants à la dégradation et restent suffisamment stables dans le cytoplasme pour être détectés, on les appelle les SUTs (Stable Unannotated Transcripts ; Neil et al., 2009; Xu et al., 2009). Les XUTs et les SUTs sont des catégories non-exclusives, de nombreux transcrits appartiennent aux deux classes. Les différentes étapes de maturation de l’ARN peuvent aussi être altérées. L’ajout de la coiffe est un mécanisme en deux étapes, dans un premier temps l’association d’une enzyme triphosphatase et d’une guanylyl transférase (Cet1/Ceg1 chez la levure S. cerevisiae) ajoute le guanosyl-triphosphate puis Abd1 (S. cerevisiae) transfert un groupement méthyl formant la coiffe m7-GpppN (résumé dans Ramanathan et al., 2016). En cas de dysfonctionnement, par exemple si la méthylation n’a pas lieu, un mécanisme de contrôle nucléaire permet d’enlever la coiffe de guanine en clivant l’ARN rétablissant ainsi une extrémité 5’-monophosphate, qui sera dégradée par une exonucléase nucléaire. Chez les mammifères la protéine DXO assure seule ce contrôle (Jiao et al., 2013), chez la levure de boulanger, il existe deux systèmes redondants, la voie Rai1/Rat1 (Jiao et al., 2010) et la voie Dxo (Chang et al., 2012). Si l’épissage n’est pas correctement réalisé, des contrôles qualités nucléaires évitent l’export de ces ARNs vers le cytoplasme. La poly-adénylation peut aussi être perturbée ou arriver prématurément à des sites cryptiques (Ozsolak et al., 2010). Un ARN non poly-adénylé n’est pas protégé et il est aussitôt dégradé par l’exosome nucléaire (Hilleren et al., 2001). Un ARN non exporté voit sa queue poly(A) allongée ce qui a pour conséquence le recrutement de l’exosome nucléaire qui dégrade les ARNs (Jensen et al., 2001). Par ailleurs les liens existant entre les différentes étapes sont aussi des contrôles, à l’image du complexe de jonction des exons (EJC) chez la plupart des eucaryotes qui est déposé pendant l’épissage sur les ARNs et participe à l’export efficace des ARNs dans le cytoplasme (Le Hir et al., 2001). Enfin la traduction comporte aussi son lot d’erreur, une erreur par millier de bases (Zaher and Green, 2009). Le problème peut provenir des ARNs de transfert (ARNt) si l’anticodon et l’acide-aminé fixé ne correspondent pas. Le ribosome seul peut aussi engendrer des erreurs et incorporer un acide-aminé à la place d’un codon Stop ou décaler le cadre de lecture (résumé dans Dunkle and Dunham, 2015). Les ARNs portants des erreurs ou résultants du manque de précision de la transcription et des étapes de maturations sont considérés comme aberrants et seront dégradés. La dégradation de ces ARNs utilise les voies classiques de dégradation des ARNs de la cellule dans le noyau et dans le cytoplasme.

La dégradation cytoplasmique des ARNs

    La dégradation des ARNs dans le cytoplasme suit deux voies distinctes (Figure 2). Chez la levure S. cerevisiae, ces deux voies impliquent une première étape commune de déadénylation (Decker and Parker, 1993; Muhlrad and Parker, 1992) par les complexes Pan2/Pan3 et Ccr4/Pop2/Not (Brown and Sachs, 1998; Tucker et al., 2001). Pour la voie majeure de dégradation chez les eucaryotes, la dé-adénylation des ARNs est suivie de l’hydrolyse de la coiffe (décapping) en 5’ par l’hétérodimère Dcp1/Dcp2 et le grignotage de l’ARN de l’extrémité 5’ vers le 3’ par l’exonucléase Xrn1 (Beelman et al., 1996; Couttet et al., 1997; van Dijk et al., 2002; Dunckley and Parker, 1999; Hsu and Stevens, 1993; Muhlrad et al., 1994, 1995; Steiger et al., 2003). Ce mécanisme de dégradation est secondé par la voie de l’exosome cytoplasmique qui permet après dé-adénylation de dégrader les ARNs de l’extrémité 3’ vers le 5’ (Anderson and Parker, 1998) aidée du complexe SKI (Ski2, 3, 8) et de la protéine Ski7. Ces deux voies existent chez tous les eucaryotes et leur importance varie en fonction des espèces. La dégradation des ARNs dans le cytoplasme est le dernier levier de régulation de l’expression des gènes. Le temps de vie d’un ARN varie en fonction des espèces d’ARN, de trois minutes à plus de cent minutes chez la levure S. cerevisiae (Wang et al., 2002).
1. Dé-adénylation : La dé-adénylation est le processus permettant la dégradation de la queue poly(A) des ARNs. La queue poly(A) est ajoutée co-transcriptionnellement dans le noyau par une ARN polymérase particulière. Sa taille est homogène au sein d’une espèce mais peut varier entre les espèces, environ 70 adénines pour la levure S. cerevisiae et jusqu’à 250 chez d’autres eucaryotes. Elles sont liées à des protéines de liaison des queues poly(A), les PABPs (Poly(A)-Binding Protein), Pab1 chez S. cerevisiae (Sachs et al., 1986) et PABPC1 chez les métazoaires (Grange et al., 1987). La queue poly(A) et les protéines qui interagissent sur cette partie ont un double rôle dans le métabolisme des ARNs dans le cytoplasme, d’une part elles stabilisent les ARNs et activent l’initiation de la traduction via la formation du complexe de pré-initiation (Figure 4A), d’autre part, elles participent au recrutement des protéines initiant la dé-adénylation (Sachs and Davis, 1989) et donc la dégradation des ARNs. Chez la levure S. cerevisiae, plusieurs complexes protéiques sont impliqués dans l’hydrolyse de la queue poly(A), Pan2/Pan3 (Boeck et al., 1996; Brown et al., 1996) et Ccr4/Pop2/Not (Tucker et al., 2001). Pan2/Pan3 est recruté au niveau de la queue poly(A) via l’interaction de Pan3 avec Pab1 (Siddiqui et al., 2007). L’hydrolyse de la queue poly(A) est catalysée par le domaine exonucléase de Pan2 qui appartient à la famille des RNAses D. Pan3 est la sous-unité régulatrice du complexe. L’activité de Pan2/Pan3 est promue par Pab1 (Boeck et al., 1996), et en condition normale le complexe permet la dégradation de la première partie de la queue poly(A) non liée aux protéines Pab1 (Figure 3B, Yi et al., 2018). Le complexe Ccr4/Pop2/Not est composé de deux sous-unités catalytiques, Ccr4 et Pop2 (CAF1 chez les mammifères, Bianchin et al., 2005; Daugeron et al., 2001; Thore et al., 2003) qui interagissent (Basquin et al., 2012). Les deux protéines ont une activité de déadénylase similaire in vitro mais elles semblent ne pas avoir la même spécificité de substrats au moins chez la levure. En effet, Ccr4 est active pour la dé-adénylation des régions poly(A) riches en PABPs alors que Pop2 permet de dé-adényler les régions pauvres en PABPs (Figure 3A, Webster et al., 2018). Leur action est complémentaire, cependant, chez la levure S. cerevisiae la délétion de CCR4 a plus d’impact que celle de POP2 sur la croissance (Tucker et al., 2002) et indiquerait un rôle moins important pour cette dernière. Le complexe Ccr4/Pop2/Not est recruté au niveau des ARNs par des interactions avec des protéines liant le 3’-UTR, par exemple les protéines de la famille des Puf (Pumilio Family) chez la levure S. cerevisiae (Olivas and Parker, 2000). Chez les mammifères, le complexe Ccr4/Caf1/Not est aussi recruté au niveau d’ARNs précis (Goldstrohm et al., 2006; Stowell et al., 2016; Wahle and Winkler, 2013) pour initier la dé-adénylation rapide dans divers processus biologiques, dont l’embryogenèse, la réponse immunitaire et la prolifération cellulaire (Belloc et al., 2008; Carballo et al., 1998; Subtelny et al., 2014). Les protéines Not1-5, Caf130 et Caf40 sont des cofacteurs pour la dé-adénylation conservées chez les eucaryotes. Not1 est une protéine plateforme (Bai et al., 1999), elle interagit avec Pop2 (Caf1) et d’autres sous-unités Not du complexe (Basquin et al., 2012; Petit et al., 2012). Les sous-unités Not2, Not3 et Not5 de levure activent l’hydrolyse de la coiffe et donc la dégradation des ARNs via une interaction avec le facteur Pat1 (Alhusaini and Coller, 2016). Les autres sous-unités n’ont pas de fonctions définies. La délétion isolée de CCR4 ou de PAN2 entraîne un allongement des queues poly(A) (Boeck et al., 1996; Tucker et al., 2001), ce qui semble montrer une redondance fonctionnelle entre les deux complexes. Cependant, la dé-adénylation complète des ARNs ne peut être assurée que par la combinaison des deux enzymes. Des expériences de pulse-chase pour l’inactivation des deux complexes montrent finalement un mécanisme coopératif, mineur chez la levure (Tucker et al., 2001) et la drosophile et plus important chez l’Homme. Le complexe Pan2/3agit le premier pour une première phase de dé-adénylation rapide de 90 nucléotides à environ 65 chez la levure (Brown and Sachs, 1998; Yi et al., 2018) puis Ccr4/Pop2/Not est recruté dans une deuxième phase (Tucker et al., 2002; Yi et al., 2018). On observe ensuite une pause lorsque la queue poly(A) est réduite à 10-12 bases (Decker and Parker, 1993).
2. Dégradation 5’ vers 3’ : Après la pause de dé-adénylation à 10-12 adénines, le complexe Pat1/Lsm1-7 est recruté à la place de Pab1. Cet échange est probablement un signal permettant l’activation de l’hydrolyse de la coiffe (Chowdhury et al., 2007; Tharun and Parker, 2001) et l’initiation de la dégradation du bout 5’ vers l’extrémité 3’. L’hydrolyse de la coiffe peut être aussi indépendante de la dé-adénylation préalable. Par exemple le transcrit RPS28B est dégradé rapidement par activation du décapping dans une voie dépendante de la protéine Rps28 et du cofacteur de décapping Edc3 (Badis et al., 2004; He et al., 2014). Le complexe d’hydrolyse de la coiffe est composé de deux protéines principales, Dcp1 et Dcp2. Dcp2 est la sous-unité catalytique (van Dijk et al., 2002) permettant le clivage de la coiffe libérant le m7-Gpp de l’extrémité 5’-monophosphate du transcrit (She et al., 2006, 2008). Dcp1 interagit avec Dcp2 et promeut son activité (Deshmukh et al., 2008; She et al., 2004, 2008). Les 300 premiers nucléotides de Dcp2 sont suffisants pour initier l’hydrolyse de la coiffe (Dunckley and Parker, 1999), c’est la région conservée entre les espèces. Dcp1 et Dcp2 forment une holoenzyme régulée par de multiple cofacteurs : Dhh1, Edc3, Pat1, Lsm1-7, Scd6, Sbp1, Mrt1-3 (Hatfield et al., 1996 pour Mrt1-3; He and Jacobson, 2015), Edc4 (Chang et al., 2014), etc. Ces cofacteurs sont impliqués dans les différentes étapes permettant l’hydrolyse de la coiffe, le raccourcissement de la queue poly(A) évoqué précédemment, l’inhibition de la traduction et le décrochage des facteurs d’initiation de la traduction protégeant la coiffe. Dhh1, par exemple, est un activateur de l’hydrolyse de la coiffe (Coller et al., 2001), il a un rôle d’inhibition précoce de l’initiation de la traduction qui permettrait d’affaiblir les interactions entre la coiffe et les facteurs d’initiation la rendant plus accessible à Dcp1/Dcp2. Scd6 et Sbp1, en liant eIf4g (Figure 4A) auraient aussi un effet d’inhibition de la traduction favorisant l’accès à la coiffe (Nissan et al., 2010). Pat1, comme expliqué précédemment permet le recrutement de Dcp1/Dcp2 et Xrn1 au niveau des ARNs (Charenton et al., 2017 pour Dcp2/Pat1; Fromont-Racine et al., 2000; Ho et al., 2002; Krogan et al., 2006 pour Pat1/Xrn1; Tarassov et al., 2008; Tong et al., 2004) où la queue poly(A) est raccourcie. Il contribue aussi à l’inhibition de la traduction (Nissan et al., 2010) et il active Dcp2. Lsm1-7 promeut l’activation de Dcp2 par Pat1 et permet de protéger l’extrémité 3’ de l’ARN pendant la dégradation par Xrn1. Edc3 interagit avec Dcp2, permet de lever son auto-inhibition (Harigaya et al., 2010; He and Jacobson, 2015) et il est présent dans la forme active de l’holoenzyme (Charenton et al., 2016). Chez la levure S. cerevisiae, Dcp2 a une longue extension C-terminale non conservée chez les autres eucaryotes et non requise pour l’hydrolyse de la coiffe. Cette région possède des domaines supplémentaires d’interactions pour plusieurs cofacteurs comme Pat1, Edc3 ou Upf1 (voir partie III.5. « Upf1, facteur majeur du NMD » de l’introduction) qui pourraient avoir un rôle dans le choix de certains substrats particuliers. Le domaine C-terminal pourrait aussi avoir un rôle dans des fonctions accessoires de Dcp2, comme son lien possible avec la transcription (Groušl et al., 2009; Shalem et al., 2011) chez la levure. Plusieurs équipes ont tenté de figer le complexe Dcp1/Dcp2 dans une forme active (Charenton et al., 2016; Mugridge et al., 2016; Valkov et al., 2017; Wurm et al., 2017), cela a abouti à un mécanisme d’activation de Dcp1/Dcp2 par les cofacteurs Edc1 et Edc3 via la levée de l’autoinhibition et la stabilisation du complexe Dcp1/Dcp2 sur les ARNs (Mugridge et al., 2018). Une fois la coiffe dégradée, le complexe d’hydrolyse de la coiffe laisse la place à l’exonucléase Xrn1 (Stevens, 1978). Xrn1 est l’exonucléase cytoplasmique majeure, elle est processive, directionnelle et requiert une extrémité 5’-monophosphate libre (Stevens, 1980). Chez les mammifères, la coordination de l’hydrolyse de la coiffe et de la dégradation pourrait être organisée au niveau de Edc4 (alias Hedls), protéine plateforme permettant l’interaction de Dcp1/Dcp2 et de Xrn1 (Chang et al., 2014). La dégradation de l’ARN par Xrn1 est cotraductionnelle (Hu et al., 2009; Pelechano et al., 2015), elle suit les ribosomes.
3. Dégradation 3’ vers 5’ : La deuxième voie de dégradation des ARNs est la voie de l’exosome. L’exosome cytoplasmique de levure est composé de dix sous-unités dont Rrp44 (Dis3) qui possède une activité exonucléolytique et endonucléolytique (Bousquet-Antonelli et al., 2000; Lebreton et al., 2008; Schaeffer et al., 2009; Schneider et al., 2009), et neuf autres protéines formant un tunnel permettant l’adressage de l’ARN au niveau du site catalytique de Dis3 (Bonneau et al., 2009). L’activité endonucléolytique pourrait ne pas être requise pour l’activité cytoplasmique de Dis3, d’ailleurs, l’équivalent mammifère Dis3L, uniquement cytoplasmique, n’a pas conservé cette capacité (résumé dans Zinder and Lima, 2017). Pour la dégradation des ARNs cytoplasmiques, l’exosome requiert l’aide du complexe SKI. Ce complexe est composé de Ski2, Ski3 et Ski8 et interagit avec l’exosome via Ski7, une protéine faisant le pont entre les deux complexes. Les protéines du complexe SKI forment aussi un canal permettant de diriger l’ARN à dégrader vers l’exosome (Halbach et al., 2013). La protéine Ski2 est probablement une hélicase ARN et elle pourrait permettre de dérouler les structures de l’ARN pour faciliter ensuite la dégradation. Le recrutement de l’exosome a lieu au niveau des extrémités 3’ non protégées ainsi que sur certains ARNs via la liaison de protéines sur des motifs spécifiques (Chen et al., 2001), cependant les mécanismes sont encore peu clairs.
4. Régulation des voies de dégradation des ARNs : Les caractéristiques permettant d’orienter un ARN vers la voie 5’ vers 3’ ou la voie de l’exosome ne sont pas connues. Il semble que certains ARNs soient plus sensibles à l’une ou l’autre des voies. L’importance des deux voies est aussi différente en fonction des espèces. Ainsi la levure utilise principalement la voie de décapping dépendant de la dé-adénylation tandis que chez les plantes c’est la voie de l’exosome qui semble majoritaire. Pourquoi existe t’il de tel différences ? Quels sont les éléments impliqués dans la régulation de ces mécanismes ? La disponibilité des facteurs peut être une explication pour le choix différentiel des voies selon les espèces ou lorsque des modifications de l’environnement affectent leur abondance. Par exemple, chez la levure, la dégradation des ARNs a lieu principalement par la voie 5’ vers 3’ sauf si celle-ci est perturbée (par exemple mutation d’une enzyme du décapping), dans ce cas, l’exosome cytoplasmique prend le relais. La dégradation est aussi régulée en cis via des éléments de l’ARN directement (Cheng et al., 2017). Un exemple déjà évoqué est le recrutement des facteurs de la dé-adénylation via une interaction avec des protéines liant les 3’-UTR. Par exemple, une étude récente montre l’effet activateur de la protéine Mmi1 sur la dégradation d’un ARN de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Mmi1 interagit avec une épingle d’ARN située dans le 3’-UTR et accélère le recrutement du complexe Ccr4/Pop2/Not (Stowell et al., 2016, 2018). Dans d’autres cas de régulation, le court-circuitage de la déadénylation par le décapping permet de dégrader rapidement des ARNs spécifiques (Badis et al., 2004; He et al., 2014). Le taux de dégradation des ARNs est aussi influencé par l’efficacité de la traduction en lien avec l’optimisation des codons le long de la séquence codante (Presnyak et al., 2015). De plus en plus d’articles décrivent des liens entre l’usage des codons, l’efficacité de la traduction et la dégradation des ARNs (Bazzini et al., 2016; Mishima and Tomari, 2016; Presnyak et al., 2015; Radhakrishnan and Green, 2016). Par exemple, une étude propose un mécanisme différentiel des deux dé-adénylases Ccr4 et Pop2 dans le cas d’une demi-vie courte ou longue pour les ARNs (Webster et al., 2018). Cette étude montre que la dé-adénylation des ARNs optimisés pour l’usage de leur codon, traduit efficacement et possédant plus de PABPs sur leur queue poly(A) (Beilharz and Preiss, 2007) utilise préférentiellement la dé-adénylase Ccr4 alors que les ARNs non-optimisés sont dé-adénylés par Pop2. La différence est que Ccr4 doit enlever au fur et à mesure les PABPs ce qui ralenti sa progression et donc ralenti la dégradation alors que Pop2, recruté sur des queues poly(A) pauvres en PABPs, permet une dé-adénylation rapide suivie de la dégradation des ARNs (Figure 3).

Facteurs associés au NMD

    La reconnaissance des PTCs entraîne le recrutement au niveau des ARNs de facteur du NMD qui conduisent à l’inhibition de la traduction et à la dégradation des transcrits (Muhlrad and Parker, 1999b). Les premiers facteurs du NMD ont été identifiés chez la levure S. cerevisiae dans des cribles génétiques cherchant des conditions dans lesquels des codons Stop pouvaient être traversés par les ribosomes à une plus grande fréquence (Culbertson et al., 1980). Les mutations upf (up-frameshift) identifiées ont été caractérisées plus tard et les gènes correspondant ont été nommés UPF1, UPF2 et UPF3 (Cui et al., 1995; Leeds et al., 1991, 1992). Six autres facteurs critiques pour le NMD ont été identifiés chez le ver Caenorhabditis elegans (C. elegans) dans des cribles de suppression de mutations variées (Hodgkin et al., 1989). Les mutations suppressives smg (suppressors with morphogenic effect on genitalia) entraînaient par ailleurs des malformations des appareils génitaux d’où leur nom. Ces mutations ont ensuite été caractérisées et les gènes correspondant ont été nommés SMG1 à 7 (Cali et al., 1999; Hodgkin et al., 1989; Pulak and Anderson, 1993). UPF1, UPF2 et UPF3 sont les seuls facteurs conservés chez tous les eucaryotes y compris certains groupes très anciens ; ils sont les facteurs cœur du NMD (Behm-Ansmant et al., 2007b; Chen et al., 2008; Culbertson and Leeds, 2003; Kadlec et al., 2006). Parmi les gènes SMGs, SMG2-3-4 sont respectivement les homologues d’UPF1-2-3 (Aronoff et al., 2001; Page et al., 1999). Les autres SMGs n’ont pas d’équivalent évident chez la levure S. cerevisiae. Seul SMG7 pourrait avoir un orthologue nommé EBS1 (Luke et al., 2007). Chez les mammifères, les facteurs impliqués dans le NMD ont été retrouvés par analyse in silico, par homologie de séquence avec les facteurs UPFs et/ou SMGs. Tous les SMGs ont des orthologues chez les mammifères (Applequist et al., 1997; Chiu et al., 2003; Denning et al., 2001; Lykke-Andersen et al., 2000; Mendell et al., 2000; Perlick et al., 1996; Yamashita et al., 2001). En outre, beaucoup d’autres gènes ont été identifiés comme ayant un rôle dans le NMD, SMG8, SMG9, PNRC2, MOV10, NMD4, DBP2, DHX34, RUVBL1/2, GNL2, etc. (Casadio et al., 2015; Cho et al., 2009; Gregersen et al., 2014; He and Jacobson, 1995; Hug and Cáceres, 2014; Izumi et al., 2010; Longman et al., 2013; Yamashita et al., 2009). Les rôles de certains de ces facteurs dans le NMD seront détaillés dans les paragraphes suivants, pour les autres leurs fonctions dans le NMD sont encore très peu claires.

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Table des matières

Introduction
I. Importance des contrôles pour l’expression des gènes
II. La dégradation cytoplasmique des ARNs
1. Dé-adénylation
2. Dégradation 5’ vers 3’
3. Dégradation 3’ vers 5’
4. Régulation des voies de dégradation des ARNs
III. Dégradation des ARNs aberrants
1. Mécanisme de la traduction
2. Contrôles dépendant de la traduction
3. Activation du NMD au niveau de ses substrats
4. Facteurs associés au NMD
5. Upf1, facteur majeur du NMD
6. Upf2, plateforme pour des interactions protéiques
7. Upf3
8. Le cycle de phosphorylation d’Upf1
9. Le recrutement de Smg5, Smg6 et Smg7 déclenche la dégradation des ARNs
10. Modèle EJC-dépendant du NMD : SURF-DECID
11. Modèle EJC-indépendant du NMD
IV. Fonctions physiologiques et patho-physiologiques du NMD et de ses facteurs
Objectifs de la thèse
Développement technologique
Analyse des données de spectrométrie de masse
Résultats
I. Recrutement d’Upf1 au niveau des ARNs cibles
1. Upf1 interagit avec les 3’-UTR de centaines d’ARNs
2. Les mutations du domaine hélicase d’Upf1 n’affectent pas ses interactions avec les autres partenaires
II. Complexes protéiques impliqués dans le NMD et leur dynamique
1. Stratégie utilisée et introduction aux résultats
2. Article de thèse
Abstract
Introduction
Results
Quantitative mass spectrometry reveals the global composition of Upf1 associated complexes
Upf1-associated proteins are grouped in two mutually exclusive complexes
The Upf1 cysteine-histidine rich N-terminal domain is an interaction « hub » in vivo
Nmd4 and Ebs1 are tightly associated with Upf1-HD-Cter
Potential Smg5-6-7 homologs can be essential for NMD efficiency under limiting conditions
Detector forms by binding of a Upf2/Upf3 heterodimer to Upf1 in vivo
Binding of Effector to NMD substrates depends on Upf2
Discussion
Affinity purification strategies for NMD
Detector formation is both similar and distinct from SURF/DECID
The importance of the C-terminal Upf1 domain in yeast and mammalian NMD
A molecular switch around Upf1 for the Detector to Effector transition
Conclusion
Materials and Methods
Yeast and bacterial strains
Plasmids construction for yeast experiments
Plasmids construction for in vitro interaction studies
TAP affinity purifications
Mass spectrometry, sample preparation, acquisition and data analysis
Reverse transcription and quantitative PCR
NMD efficiency calculation
Polysome fractionation
Acknowledgments
Author Contributions
Conflict of interest
References
Expanded view Figure
Appendix Material and Methods
Appendix Figures
Appendix Tables
Discussion générale et perspectives
I. Résumé des résultats
II. Discussion et perspectives
1. Ubr1 est associé spécifiquement à Upf2
2. Le complexe CK2, responsable de la phosphorylation de Upf2 ?
3. Hrr25 fait partie de l’effecteur
4. Plusieurs hypothèses existent pour le switch
4.1. Échange des deux complexes ou échanges des facteurs autour de Upf1 ?
4.2. Dimérisation de Upf1
4.3. Rôle de la phosphorylation d’Upf2
4.4. Ebs1 comme intermédiaire entre le Détecteur et l’Effecteur
4.5. Perspectives pour une meilleure compréhension du switch
5. Quelle est la fonction de l’Effecteur non fixé aux ARNs ?
6. Lsm1-7 et Pat1 sont présents sur les mêmes ARNs que Upf1
7. La question récurrente du lien entre les p-bodies et le NMD
8. Nmd4, régulateur de l’association d’Upf1 à l’ARN
Conclusion
Références
Annexes
Liste des abréviations
Table des Figures
Table des tableaux
Résumé
Abstract

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