Soutenance mémoire
Fibrine Riche en Plaquette
Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM)
Définitions Il existe plusieurs types de cellules souches :
-Les cellules souches totipotentes peuvent donner tout type cellulaire et reconstituer un organisme entier ;
-les cellules souches pluripotentes peuvent donner tout type cellulaire des 3 lignées somatiques qui peuvent elle-même donner tout type cellulaire sauf les annexes embryonnaires.
Ces 2 types cités proviennent de cellules souches embryonnaires.
-Enfin, les cellules souches multipotentes sont des cellules souches adultes et qui peuvent donner différents types cellulaires mais spécifiques d’un lignage cellulaire donné. Au sein de cellules souches multipotentes on trouve les cellules souches hématopoïétiques, neuronales et mésenchymateuses. Ces dernières sont compétentes pour suivre une différenciation du mésoderme (cartilage, os, muscle, tendon et graisse).
Pour le traitement des lésions musculo-squelettiques, les cellules souches mésenchymateuses (CMS) sont utilisées. Leurs origines est triple : la moelle osseuse, la graisse et le cordon ombilical.
Chez le cheval, la moelle osseuse est prélevée au sternum ou à l’ilium, le tissu adipeux à la base de la queue et le prélèvement de cordon ombilical s’effectue au moment du poulinage (Cousty, 2013).
A partir des CMS de la moelle osseuse, il est possible de produire in vitro du tissu adipeux, tendineux, cartilagineux ou osseux. Même si les CSM dérivées de la graisse ont montré leur capacité à se différencier en cellules de tissu musculo-squelettique, il semblerait que leurs capacités de différenciation soient inférieures à celles des CSM dérivées de moelle osseuse si l’on se base sur les critères de différenciation que l’on connaît actuellement (Frisbie& Smith,2010). Pour ces raisons, les CSM issues de la moelle osseuse sont privilégiées dans le traitement des affections musculo-squelettiques.
La comparaison de la sénescence des CSM issues de la moelle osseuse, de la graisse et du cordon ombilical a démontré que celles provenant de la graisse et du cordon ombilical se conservent plus facilement et qu’elles devraient être privilégiées pour la réalisation de banques (Vidal et al. 2012).
Essais cliniques chez le cheval A-Réparation osseuse et cartilagineuse En raison de la capacité des CSM à réaliser une différenciation chondrogénique, de nombreuses études ont été conduites ces dernières années afin de les utiliser pour potentialiser la réparation cartilagineuse. Les CSM sont douées d’affinité pour les tissus des articulations lésés, et des études récentes ont confirmé leur capacité à se localiser et à participer à la réparation de structures articulaires comme les ligaments croisés, les ménisques ou le cartilage (Frisbie& Smith, 2010).
Dans l’expérience menée par Wilke et al. 2007, des lésions cartilagineuses ont été créées dans les articulations fémoro-patellaires de chevaux et ont été traitées avec une injection de fibrine contenant des CSM ou uniquement de la fibrine seule. Il en résulte que les scores arthroscopiques à 30 jours étaient significativement meilleurs lors d’une implantation avec les CSM. En revanche, l’évaluation à long terme (8 mois) n’a pas montré de différences significatives entre les défauts traités avec les CSM et ceux traités avec la fibrine seule. En résumé, les CSM ont amélioré la cicatrisation initiale, mais n’ont pas modifié significativement l’apparence histologique et biochimique du cartilage à long terme.
En 2011, une étude (McIlwraith et al. 2011) a évalué l’effet de l’injection intra articulaire de CSM dérivées de moelle osseuse sur la qualité de la cicatrisation lors de microfractures de l’os sous chondral. Un mois après la création de défauts sur les condyles fémoraux médiaux de chevaux sous arthroscopie, des injections intra articulaire contenant 20 millions de CSM et 22mg d’acide hyaluronique ou des injections contenant l’acide hyaluronique seul sont réalisées. Bien qu’il n’y ait pas d’amélioration clinique évidente pour les articulations traitées avec les CSM, l’arthroscopie de contrôle et l’évaluation macroscopique à 6mois ont montré une densité augmentée de tissu de réparation et une tendance à une meilleure qualité du tissu de réparation dans les articulations qui ont reçu des CSM. L’analyse immunohistochimique à 12 mois a révélé une plus grande quantité d’aggrécanes (protéoglycanne matriciel le plus abondant) dans le tissu de réparation sur les articulations traitées avec les CSM.
L’utilisation de CSM a été étudiée dans le traitement de l’arthropathie dégénérative. Dans une expérience de Frisbie et al. 2009, une arthropathie dégénérative a été induite en créant des débris cartilagineux. La déstabilisation de l’articulation était minimale, et l’utilisation de CSM dans ce cas n’a pas démontré d’effet clinique, radiographique, histologique ou biochimique significatif. Seule une diminution de la PGE2 (cytokine pro-inflammatoire) a pu être notée dans les articulations traitées avec CSM. Dans une autre étude (Mokbel et al. 2011), une arthrose expérimentale a été créée dans des articulations d’ânes à l’aide d’une injection d’amphotéricine qui induit une synovite et une capsulite, deux lésions qui sont responsables d’instabilité articulaire. Dans cette expérience, l’effet bénéfique clinique et radiologique est marqué pour les groupes traités avec les CSM comparé au groupe contrôle. De plus, l’examen microscopique en fluorescence de sections histologiques a montré que les CSM marquées participaient au processus de réparation du cartilage endommagé et ont intégré le cartilage existant. Il semble admis par les scientifiques que la thérapie par les CSM apporte une amélioration lors d’arthropathie dégénérative particulièrement lors d’instabilité articulaire.
Réparations tendineuses L’utilisation principale des CSM reste le traitement des tendinites. Lors de la réparation naturelle du tendon, un tissu de cicatrisation se forme dont la fonctionnalité est déficiente en comparaison au tendon d’origine. Cette perte de fonctionnalité s’explique en partie par le fait que la réparation tendineuse produit du collagène de type III (20 à 30% de présence dans un tendon cicatriciel) alors que c’est du collagène de type I que l’on retrouve en plus grande quantité dans les tendons sains (le collagène de type III compose moins de 1% du tendon sain). Le collagène de type III est de qualité inférieure par rapport au collagène de type I. Cela a pour conséquence une réduction des performances du cheval et un risque très augmenté de récidive de la tendinite. L’objectif principal recherché avec les CSM est de favoriser la mise en place d’un tissu cicatriciel à la structure proche de celle du tendon sain en stimulant la collagenèse et la néoformation de fibres tendineuses, et de limiter la formation d’une cicatrice fibreuse et la détérioration des caractéristiques biomécaniques du tendon (Richardson et al. 2007).
La lésion tendineuse du cheval se prête particulièrement bien à la thérapie par les cellules car c’est généralement une lésion qui se situe dans le corps du tendon et non en périphérie et elle est souvent bien circonscrite. Cette lésion va rapidement se combler avec un tissu de granulation qui jouera un rôle nutritif de par sa vascularisation importante et de support mécanique pour les CSM. La localisation intra-tendineuse de la lésion permet la présence de cytokines et d’un environnement mécanique particulier qui stimulent la différenciation des CSM en ténoblastes. Richardson (Richarson et al. 2007) énonce la fonction de « scaffold » joué par ce tissu de granulation, une notion que l’on définira dans la partie IV de ce développement. L’injection de cellules souches devra donc être parfaitement intra-tendineuse et intra-lésionnelle pour permettre aux CSM de jouer pleinement leurs rôles. C’est pour cette raison que les lésions excentriques ne sont pas considérées comme les candidates idéales à la thérapie par les CSM (Verwilghen et al. 2010b).
Le traitement des tendinites par les CSM permet aux chevaux de revenir en compétition plus rapidement après une remise au travail progressive et ce avec un taux de récidive plus faible (taux de 18 à 27% selon les études alors que le taux de rechute est autour de 55% avec des traitements plus conventionnels (Cuevas& Décory, 2013 ; Frisbie& Smith, 2010)).
Au niveau histologique, on reconnaît un tissu cicatriciel par l’alignement des fibres tendineuses qui fait défaut. En effet, on observe une matrice désorganisée avec une augmentation de la cellularité et de la vascularisation au sein d’un tendon cicatriciel (Cf Figure 8). L’utilisation de CSM dans les lésions tendineuses améliorerait le score histologique des tissus d’après les études avec des modèles de tendinite à collagénase
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Fibrine Riche en Plaquette |
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Table des matières
LISTE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
Partie I : Les thérapeutiques régénératives dans l’espèce équine : étude bibliographique des concentrés plaquettaires et particulièrement de la Fibrine Riche en Plaquette ainsi que des Cellules Souches Mésenchymateuses
I-Définitions
1-Fibrine et inflammation
2-Les cytokines
II-Fibrine Riche en Plaquette (« Platelet rich fibrin » ou PRF)
1-Principes généraux de formation des concentrés plaquettaires
A-Historique des concentrés plaquettaires
B-Protocole de réalisation des PRP
C-Composition et usage des PRP
2-Un concentré plaquettaire original : le PRF ou Fibrine Riche en Plaquette
3-Importance de la centrifugation
4-Une composition originale en fibrine et en glycosaminoglycane
5-Structure et propriétés mécaniques des membranes de PRF
6-Une composition originale en plaquettes, cytokines et leucocytes
7-Capacités de cicatrisation du PRF
8-Applications cliniques
III-Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM)
1-Définitions
2-Essais cliniques chez le cheval
A-Réparation osseuse et cartilagineuse
B-Réparations tendineuses
3-Mode de culture
A- Les CSM dérivées de moelle osseuse
B- Les CSM dérivées du tissu adipeux
4-Mode de réimplantation
IV- Notion de « Scaffold »
Partie II : Evaluation expérimentale de la migration de Cellule Souche Mésenchymateuse équine au sein de Fibrine Riche en Plaquette
I-Récolte des CSM
II- Mise en culture des CSM
III- Réalisation du PRF
IV- Mise en culture d’une suspension de CSM avec du PRF
1-Protocole général
2-Mise en culture de CSM (quantité= 30×10^4 cellules) et du PRF avec récolte à J3, J8 et J15
4-Recoupe des échantillons congelés à J3, J8 et J15 et lecture de lame sous microscopie à fluorescence
5-Mise en culture des CSM (quantité= 30×10^4 cellules) et du PRF recoupé avec récolte à J5
V-Discussion
1-Protocole
A-Qualité des PRF
B-Récolte des CSM
C-Paramètres fixés pour la culture de CSM au sein des puits contenant du PRF
2-Interprétation des résultats
A-Qualité des observations
B-Migration des CSM dans la fibrine et ses conséquences
C-Coloration et marquage des CSM
D-Perspectives d’utilisation
CONCLUSION
ANNEXES
Annexe 1 : Liste des différents PRP utilisables dans le commerce d’après Smets et al. 2012
Annexe 2 : Protocole de changement de milieu
Annexe 3 : Protocole de réensemencement des CSM avec trypsination
Annexe 4 : Protocole de coloration des puits de p6 au Giemsa
Annexe 5 : Protocole de coloration des lames au DAPI et à la Rhodamine
Annexe 6 : Poster présenté au congrès annuel du Collège Européen de Chirurgie
BIBLIOGRAPHIE
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