Soutenance mémoire
Mémoire pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) de Biochimie
Option : Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales
Modes opératoires
Les alcaloïdes
La méthode de détection des alcaloïdes consiste en leur précipitation par des réactifs d’une assez grande spécificité. Ces réactions de précipitation sont fondées sur la capacité qu’ont les alcaloïdes à se combiner avec des métaux et des métalloïdes : bismuth, mercure, tungstène, iode… (BRUNETON, 1993).
La manipulation nécessite quatre tubes à essai contenant chacun 1ml d’extrait acide.
Le premier tube sert de témoin tandis que les trois autres sont utilisés pour les tests, respectivement à l’aide des réactifs de MAYER, de DRAGENDORFF et de WAGNER. Les compositions des réactifs sont données en annexe II.
Test de MAYER
Le second tube contenant l’extrait acide est additionné de 4 à 5 gouttes de réactif de MAYER. L’apparition d’un précipité ou d’une floculation indique la présence d’alcaloïdes.
Test de DRAGENDORFF
Dans le troisième tube sont ajoutées 4 à 5 gouttes de réactif de DRAGENDORFF. Si des alcaloïdes sont présents dans l’extrait, une floculation apparait.
Test de WAGNER
La formation d’un précipité dans le dernier tube, après ajout de 4 à 5 gouttes de réactif de WAGNER, confirme la présence d’alcaloïdes.
Les réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF donnent des précipités avec les alcaloïdes, mais la réaction n’est pas spécifique. Diverses substances azotées non alcaloïdiques précipitent également. Pour distinguer ces deux catégories de composés, on complète le contenu des tubes avec de l’éthanol à 95 %. Si le précipité ne se dissout pas, il est dû à des substances non alcaloïdiques. Si le liquide redevient limpide (précipité redissous), on se trouve en présence d’alcaloïdes.
Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
L’extrait hydroéthanolique est utilisé pour détection des flavonoïdes et leucoanthocyanes.
Les flavonoïdes (Test de WILSTATER)
La réaction colorée, dite de la cyanidine, permet de mettre en évidence les flavones, flavonols et flavanones par traitement avec du magnésium en milieu chlorhydrique (BRUNETON, 1987).
Deux tests sont effectués :
Pour le premier, 3 ml d’extrait hydroéthanolique sont additionnés de 0,5 ml de HCl 12,07 N et de deux tournures de magnésium.
La même opération est répétée pour le second test, mais le mélange est additionné de 1ml d’eau distillée et de 1 ml d’alcool isoamylique. Le changement de coloration est noté après 10 min. Le virage au rouge indique la présence de flavones, au rouge-pourpre celle des flavonols et au rouge-violacé celle des flavonones et des flavanols.
– Les leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)
En milieu très acide, la forme cationique des anthocyanes colorées en rouge est stable (BRUNETON, 1993).
A 3 ml d’extrait hydroéthanolique est ajouté 0,5 ml de HCl 12,07 N. La solution acide est chauffée au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge-violet suggère la présence de leucoanthocyanes.
Les stéroïdes et triterpènes
Les stéroïdes et triterpènes constituent généralement les génines des saponosides(BRUNETON, 1987).
L’extrait chloroformique est utilisé pour les tests. La solution chloroformique est répartie dans trois tubes à essai dont le premier sert de témoin, les deux autres étant destinés aux tests ci-dessous.
Test de LIEBERMANN-BURCHARD
Dans le 2ème tube, un volume de 1 ml d’extrait chloroformique est additionné de 3 gouttes d’anhydride acétique. Après une légère agitation, 2 gouttes d’acide sulfurique (H2SO4 36,76N) sont versées le long de la paroi du tube incliné contenant le mélange. Le changement de coloration est observé pendant 1h. L’apparition d’une coloration bleu-vert indique la présence de stéroïdes tandis qu’une coloration rouge, violette ou rose confirme celle des terpènes.
Test de SALKOWSKI
Dans le troisième tube, 1 ml de H2SO4 36,76 N est versé le long de la paroi du tube à essai incliné contenant 1 ml d’extrait chloroformique. Si des stérols saturés sont présents dans le milieu, un anneau rouge apparait à l’interface du mélange.
Les saponines
Les saponosides se dissolvent dans l’eau en formant des solutions moussantes par agitation (BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1993).
Un volume de 1 ml d’extrait aqueux est utilisé. Après une agitation énergique pendant 30 s, la formation de mousse alvéolée est observée : si celle-ci atteint une hauteur de 3 cm et persiste pendant au moins 30 min, l’extrait contient des saponines.
Les tanins
Les tanins réagissent avec le chlorure ferrique et sont précipités de leurs solutions aqueuses par la gélatine (BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1993).
L’extrait aqueux est utilisé pour les trois tests suivants :
Test à la gélatine
A 0,5ml d’extrait aqueux sont ajoutées 4 à 5 gouttes de gélatine 1%. La formation d’un précipité blanc indique la présence de tanins.
Test à la gélatine salée
A 0,5 ml d’extrait à tester sont ajoutées 4 à 5 gouttes de gélatine salée (gélatine 1% mélangée à une solution de NaCl 10%). La présence de tanins est vérifiée par l’apparition de précipité.
Test au chlorure ferrique
Après addition de 4 à 5 gouttes de chlorure ferrique (en solution méthanolique) à 0,5 ml d’extrait à étudier, les tanins catéchiques sont mis en évidence par la formation d’une coloration bleu-vert ou vert-noir alors que des tanins galliques sont présents s’il apparaît une coloration bleu-noir.
Les anthraquinones (Test de BORNTRÄGER)
Le test met en jeu une réaction colorée mettant les quinones en évidence, par leur solubilisation en milieu alcalin (BRUNETON, 1987).
Un volume de 0,5 ml d’extrait aqueux est mélangé avec 1ml de benzène dans une ampoule à décanter. Après décantation, la phase organique est recueillie dans un tube à essai et additionnée de 5 gouttes de NH4OH 25%. Après agitation, un virage au rouge de la phase alcaline (phase inférieure) indique la présence d’anthraquinones.
Les désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)
A 0,5 ml d’extrait aqueux sont ajoutés successivement 0,5ml de chlorure ferrique 10% et 0,5ml d’acide acétique glacial. Le tout est agité. 0,3ml de H2SO4 36,76N est versé le long de la paroi du tube incliné de 45°. La formation d’un anneau pourpre suggère la présence des désoxyoses.
Les irridoïdes
En milieu acide, les irridoïdes donnent des colorations caractéristiques servant à leur identification (BRUNETON, 1987).
L’extrait aqueux de volume égal à 0,5ml est ajouté de 3 gouttes de HCl 12,07N.
L’apparition d’une coloration bleue après ébullition pendant 30 min témoigne de la présence d’irridoïdes.
Principe
Il s’agit d’une méthode d’analyse immédiate basée sur deux mécanismes fondamentaux : l’adsorption et le partage. Elle utilise un support ou adsorbant (phase stationnaire) qui d’une part, fixe les molécules à analyser par des liaisons non covalentes, et d’autre part, retient un premier solvant tel que l’eau, non miscible à un second solvant. La séparation des substances se fait en fonction de leur affinité pour l’adsorbant d’une part et de leur solubilité dans les solvants utilisés (phase mobile) d’autre part. Les substances à séparer vont alors se partager entre les deux phases.
Mode opératoire
Dépôt des échantillons
Les extraits à analyser sont déposés à l’aide d’un capillaire sous forme de tirets de 7 mm disposés sur une ligne horizontale à 1,5 cm du bord inférieur. Les tirets sont espacés de 6 mm. Les tirets qui se trouvent aux deux extrémités de la ligne sont placés à 1,3 cm des bords latéraux de la plaque. Les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main.
Développement du chromatogramme
La plaque préparée est introduite dans une cuve à chromatographie au fond de laquelle se trouve le solvant de migration et dont l’atmosphère a été préalablement saturée par les vapeurs dudit solvant. Il s’agit d’un mélange constitué par 60 parties de n-butanol, 20 parties d’acide acétique et 20 parties d’eau distillée en poids (B/A/E, 60/20/20, p/p/p).
Le développement est assuré par migration du solvant par capillarité. La chromatographie est arrêtée lorsque le front du solvant se trouve à 0,5cm du bord supérieur de la plaque. Cette dernière est ensuite retirée de la cuve et le solvant est aussitôt évaporé par un courant d’air chaud.
Révélation du chromatogramme
Les substances incolores exigent des méthodes particulières de détection :
Examen sous lampe ultraviolette
De nombreux produits deviennent visibles grâce à l’absorption de la lumière ultraviolette. A des longueurs d’onde caractéristiques 254 nm et 366 nm, certaines substances apparaissent sous forme de taches sombres là où la fluorescence est éteinte.
Réactions colorées
Certains composés peuvent être révélés au moyen de réactifs très généraux dont le réactif à la vanilline sulfurique (composition en annexe I). Celui-ci est pulvérisé sur la surface du chromatogramme ; les substances apparaissent ainsi sous forme de taches colorées pouvant être très faibles, d’où la nécessité de chauffer la plaque à 100°C. On obtient des taches noires.
RESULTATS
EXTRACTION
Deux types d’extraction à froid ont été réalisés : l’une aqueuse et l’autre par des épuisements successifs à l’aide des solvants de polarité croissante qui sont dans l’ordre : l’hexane, l’acétate d’éthyle et le méthanol.
EXTRACTION AQUEUSE A FROID
Cinq grammes de poudre de feuilles séchées sont délayés dans 50 ml (rapport 1/10 ; p/v) d’eau distillée et l’extraction se poursuit selon la méthode décrite au § II-1-1-a (p. 19). Le surnageant obtenu après centrifugation est évaporé jusqu’à un volume final de 5 ml (rapport 1/1, p/v). L’apparition d’un précipité au cours de l’évaporation de l’extrait rend nécessaire la réalisation d’une nouvelle centrifugation à 16000 x g pendant 15 min. Le dernier surnageant limpide, de couleur rouge brique, toxique sur souris, constitue l’extrait brut (EB).
EXTRACTION PAR EPUISEMENTS
Cent grammes de poudre de feuilles séchées sont d’abord épuisés dans 1000 ml d’hexane selon la méthode décrite au § II-1-1-b (p. 20). L’opération est ensuite répétée sur le marc avec l’acétate d’éthyle, puis avec le méthanol.
A la fin de l’extraction, trois extraits secs sont obtenus : extrait hexane (EB1), extrait acétate d’éthyle (EB2) et extrait méthanol (EB3). Les caractéristiques de ces extraits obtenus sont résumées dans le tableau 8 et l’extraction est récapitulée sur la figure 3(p. 30).
RENDEMENT
Les résidus d’évaporation à sec de EB3 et de EP pèsent respectivement 6,549g et 1,004g. Par conséquent, le rendement de EP calculé par rapport au matériel de départ (100 g de poudre de feuilles d’Albizia arenicola), est de l’ordre de 1,004%, et le rendement de purification par rapport à EB3 est d’environ 28,68%.
DEGRE D’HOMOGENEITE DES PRODUITS
L’évolution de l’homogénéité des extraits aux cours des différentes étapes de purification a été suivie par CCM, en utilisant le système de solvants : butanol/acide acétique/eau B/A/E (60/20/20, p/p) (voir méthode au §II-5-2, p. 26).
La révélation à l’aide du réactif à la vanilline sulfurique (figure 5), permet d’observer que EB comporte 9 bandes, EB3 5 bandes majeures et EP 4 bandes majeures. Ce chromatogramme permet de constater que EB3 est déjà purifié par rapport à EB qui est l’extrait aqueux à froid. En outre, EP est plus toxique que EB3 car des alcaloïdes et une bande majeure ont été éliminés au cours de la purification.
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Table des matières
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
PRINCIPES ACTIFS ISOLES DU GENRE ALBIZIA
ACTIVITES BIOLOGIQUES
ALBIZIA ETUDIEES AU LABASM
ETUDES SUR Alibizia arenicola
I-1- Etude sur les graines en 1996
I-2- Etude sur les graines en 2003
II- ETUDE SUR LES TEGUMENTS DE GRAINES
Première partie :ETUDE CHIMIQUE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
I- MATERIELS
I-1- MATERIEL VEGETAL
I-1-1- CLASSIFICATION DE LA PLANTE
I-1-2- DESCRIPTION BOTANIQUE
a)- Généralités sur le genre Albizia
b)-Description botanique de l’espèce Albizia arenicola
c)-Répartition géographique de l’espèce
d)- Date et lieu de récolte
e)-Préparation et mode de conservation du matériel
I-1-2- LES PRODUITS CHIMIQUES
II- METHODES
II-1- METHODES D’EXTRACTION
II-1-1- EXTRACTION AQUEUSE A FROID
II-1-2-EXTRACTION PAR EPUISEMENTS PAR DES SOLVANTS ORGANIQUES
II-2- METHODES DE PURIFICATION
II-2-1- PARTITION PAR L’ACETATE D’ETHYLE ET LE DICHLOROMETHANE
II-2-2- FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL
a) –Principe
b) -Mode opératoire
II-3-METHODE DE CONCENTRATION
II-4- CALCUL DU RENDEMENT
II-5-METHODES D’ANALYSE
II-5-1- CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
a)-Préparation des extraits à tester
a1)- Extrait aqueux
a2)- Extrait hydroéthanolique
a3)- Extrait acide
a4)- Extrait chloroformique
b)- Modes opératoires
b1)- Les alcaloïdes
– Test de MAYER
– Test de DRAGENDORFF
– Test de WAGNER
b2)- Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
– Les flavonoïdes (WILSTATER)
– Les leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)
b3)- Les stéroïdes et triterpènes
– Test de LIEBERMANN-BURCHARD
– Test de SALKOWSKI
b4)- Les saponines
b5)- Les tanins
– Test à la gélatine
– Test à la gélatine salée
– Test au chlorure ferrique
b6)- Les anthraquinones (Test de BORNTRÄGER)
b7)- Les désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)
b8)- Les irridoïdes
II-5-2- CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
a)- Principe
b)- Mode opératoire
– Dépôt des échantillons
– Développement du chromatogramme
– Révélation du chromatogramme
– Examen sous lampe ultraviolette
– Réactions colorées
III- RESULTATS
III-1- EXTRACTION
III-1-1- EXTRACTION AQUEUSE A FROID
III-1-2-EXTRACTION PAR EPUISEMENTS
III-2- PURIFICATION
III-2-1- PARTITION PAR LE DICHLOROMETHANE
III-2-2- FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL
III-2-3-RENDEMENT
III-2-4- DEGRE D’HOMOGENEITE DES PRODUITS
III-3- PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
III-4- NATURE CHIMIQUE
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
I- MATERIELS
I-1- LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
I-1-1-LES ANIMAUX A SANG CHAUD : LES SOURIS
I-1-2-LES ANIMAUX A SANG FROID
a)- Les têtards
b)- Les larves de moustique
I-2- LES PLANTES D’EXPERIMENTATION
I-3- LES MICROORGANISMES
I-3-1-LES SOUCHES
I-4-LES MILIEUX DE CULTURE
II- METHODES
II-1- METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX
II-1-1- ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
a)- Etude de la toxicité sur souris
a1)- Estimation de la toxicitéaiguë
a2)- Détermination de la DL50 (24h)
II-1-2- EVALUATION DE LA TOXICITE SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
a)- Mode opératoire
b)- Détermination de la concentration létale 50% 24h (CL50)
b1)- Test sur les têtards
b2)- Test sur les larves de moustique
II-2-METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
II-2-1- METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LE POUVOIR GERMINATIF
II-2-2- METHODES D’EVALUATION DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES
II-3-METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
II-3-1- STERILISATION
II-3-2- TESTS SUR LES MICROORGANISMES
a)- Etude de l’activité antimicrobienne en milieu solid
a1)- Principe
a2)- Mode opératoire
b)- Détermination de la CMI
Détermination de la CMI en milieu liquide par observation macroscopique
b1)- Principe
b2)- Mode opératoire
Repiquage de la souche bactérienne
Préparation de l’inoculum
Préparation de la gamme de concentrations de l’extrait
Inoculation
RESULTATS
I-EFFETS SUR LES ANIMAUX
I-1- EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
I-1-1- EFFETS DE L’EXTRAIT SUR LA SOURIS
a)- Description des symptômes d’intoxication
b)- Détermination de la DL50 (24h)
c)- Effets de l’administration par voie orale
I-2-EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
I-2-1- EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT EB3 SUR LES TETARDS DE GRENOUILLE
I-2-2-EFFETS DE L’EXTRAIT SEMI-PURIFIE EP SUR LES TETARDS DE GRENOUILLE
I-2-3- EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES LARVES DE MOUSTIQUE
II- EFFETS SUR LES VEGETAUX
II-1- EFFETS SUR LE POUVOIR GERMINATIF
II-2-EFFETS SUR LE DEVELOPPEMENT DU BOURGEONS AXILLAIRES
III- EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
II-1- SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS
II-2- CMI EN MILIEU LIQUIDE DE L’EXTRAIT SEMI-PURIFIE
DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME
Mots-clés : Albizia arenicola, Fabaceae, saponosides, toxique, propriété antimicrobienne
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