Soutenance mémoire
Extraction des molécules hydrophobes : les terpènes volatils
Préparation et conditionnement du matériel végétal
L’écorce fraîche d’épinette noire nécessaire au projet a été fournie par l’entreprise Boisaco Inc, située à Sacré-Coeur, Québec, Canada. Les essences d’épinette noire proviennent de la côte nord, secteur Labrieville, à environ 140 km de Forestville, Québec, Canada. Les écorces fournies ont été récoltées à partir de l’écorçage de troncs manipulés dans la scierie Boisaco. Au laboratoire, les écorces ont été nettoyées et séparées des restes de bois. Elles doivent être exemptes de signes d’attaques microbiennes ou d’insectes. Deux conditionnements sont appliqués selon le type d’extrait à obtenir. Pour l’extraction à l’eau chaude, les écorces sont séchées à température ambiante pour atteindre environ 7% d’humidité finale. Puis elles sont broyées grossièrement à l’aide d’un broyeur BearCat (grille de sortie à ouverture de 2 cm) puis finement avec un broyeur à marteau. La sciure d’écorce est ensuite tamisée et les particules entre 0,5 et 0,25 mm sont sélectionnées pour l’extraction. Pour l’hydrodistillation, les écorces ne sont pas séchées (environ 60% d’humidité), afin d’éviter la perte des molécules volatiles odorantes et sont conservées à -20 °C. Elles sont broyées grossièrement avec le broyeur BearCat et directement tamisées pour sélectionner une granulométrie entre 1 et 2 mm. Les étapes de broyage/tamisage sont plus complexes pour les écorces fraîches car la matière première à tendance à s’agglomérer dans les petits broyeurs et sur les tamis trop fins.
Les procédés
Hydrodistillation et conception du procédé intégré
Essais préliminaires en laboratoire
Les premiers essais d’hydrodistillation de l’écorce de l’épinette noire ont été effectués en laboratoire afin de déterminer s’il était possible d’en extraire une huile essentielle. Les premiers essais d’entraînement à la vapeur ont été réalisés sur un autoclave de type Presto, avec une source externe de chaleur (chauffe-plat) et connecté à un réfrigérant. 100 à 500 g d’écorce ont été hydrodistillées sur plusieurs essais par une source de vapeur constituée par 4 L d’eau portée et maintenue à ébullition. La formation d’une mince couche d’huile essentielle à la surface de l’eau de distillation (hydrolat) a permis de valider l’hypothèse selon laquelle une huile essentielle pouvait être extraite des écorces. De plus, la présence d’une eau résiduelle de coloration marron en fond de cuve a soulevé l’idée qu’une extraction aqueuse des molécules hydrosolubles pouvait avoir lieu en même temps. Une distillation à l’eau avec immersion totale de la matière première dans l’eau a également été tentée à l’échelle laboratoire avec un montage en verrerie, mais n’a pas apporté de meilleurs résultats quant à la production d’huile essentielle.
Adaptation et amélioration du matériel
Pour augmenter les quantités d’huile essentielle obtenue, deux options ont été envisagées : augmenter les quantités de matière première et améliorer l’efficacité du procédé. Pour ce faire, un extracteur de capacité 20 L avec système de diffusion interne de vapeur a été réadapté dans nos laboratoires. Initialement conçu pour l’entraînement à la vapeur, il possédait toutes les caractéristiques nécessaires pour effectuer une hydrodistillation d’huile essentielle. De plus, la connexion à une source de vapeur externe (vapeur de l’université) présentait un gain considérable d’efficacité comparé à la vapeur générée à l’échelle laboratoire par un chauffe-plat. Pour l’entraînement à la vapeur, le flux de vapeur d’eau était la seule source de chauffage, traversant la matière première et emportant les molécules volatiles, pour ensuite se recondenser dans le réfrigérant. Pour la distillation à l’eau, l’alimentation en vapeur d’eau permettait de chauffer les 15 L d’eau remplissant la cuve, dans lesquels était immergée la matière première, tout en maintenant constant le volume d’eau interne. En conséquence, un réfrigérant adéquat, capable de refroidir de grandes quantités de vapeur, a dû être construit dans nos laboratoires. Le réfrigérant était constitué d’un fût métallique fermé (68 L) avec entrée d’eau en bas et sortie d’eau en haut, et un serpentin en cuivre à l’intérieur dans lequel passait la vapeur. Cette installation a permis d’augmenter les performances de l’hydrodistillation avec notamment un débit de vapeur quadruplé (de 500 mL/h à 2 L/h) (schéma présenté au chapitre 5).Grâce à la présence d’une sortie de drainage de la cuve, il a été possible de récupérer facilement l’extrait aqueux produit simultanément pendant l’hydrodistillation. Cet extrait a donc été appelé « extrait drainé » (drained extract). Pendant l’entraînement à la vapeur, il est formé par la condensation de la vapeur d’eau dans la cuve, qui ensuite imbibe la matière première. Lors de la distillation à l’eau, comme la matière première est immergée, l’extrait aqueux est formé tout au long du processus. Les quantités d’huile essentielle obtenues étant encore trop faibles, l’hexane a été utilisée pour récupérer la couche surnageante de l’eau de distillation.
Conception du plan d’expérience du procédé intégré
Un plan d’expérience a été conçu pour pouvoir comparer de manière optimale les deux types d’hydrodistillation les plus utilisés dans l’industrie : l’entraînement à la vapeur et la distillation à l’eau. Un schéma du plan d’expérience est présenté dans le chapitre 5.Les expériences ont donc été effectuées dans le même appareillage, selon les mêmes paramètres fixes (masse de matière première, débit de vapeur, durée d’extraction…). L’analyse des produits récupérés, l’huile essentielle, l’hydrolat et l’extrait aqueux drainé de la cuve ont permis de comparer les deux procédés.Afin d’évaluer si la matière première a été épuisée de ses molécules hydrosolubles, une extraction à l’eau chaude a été réalisée à partir de l’écorce hydrodistillée. Enfin, la qualité du procédé pour la production d’un extrait aqueux a été comparée à une expérience contrôle d’extraction à l’eau chaude effectuée en parallèle. À chaque étape du procédé, les écorces résiduelles ont été récoltées et testées pour leur pouvoir calorifique.
Optimisation de l’extraction à l’eau chaude
L’extraction à l’eau chaude
L’extraction à l’eau chaude a été choisie préférentiellement pour l’écorce d’épinette noire en raison de la qualité de l’extrait obtenu lors de précédentes études (Garcia-Perez et al., 2010; Royer et al., 2013). Solvant vert par excellence, l’eau présente l’avantage d’être non toxique et donc de répondre aux exigences des industries nutraceutiques et alimentaires aux régulations très strictes.
Les extractions à l’eau chaude ont été effectuées à l’aide d’un montage à reflux classique, composé d’un système de chauffage (chauffe-ballon pour 100 °C ou bain thermostaté pour 80 °C), d’un ballon 250 mL contenant la matière première et l’eau et d’une colonne réfrigérante alimentée en eau de refroidissement.
Le plan d’expérience pour l’optimisation de l’extraction
Afin de maximiser l’efficacité d’une optimisation d’extraction et de minimiser le nombre d’extraction, la mise en place d’un dispositif expérimental suivant un modèle statistique est fortement conseillé. Le plan d’expérience pour l’optimisation de l’extraction à l’eau chaude de l’écorce d’épinette noire a été conçu selon un plan factoriel 3×3×2. Trois paramètres et plusieurs niveaux ont été sélectionnés : la durée d’extraction (60; 90; 120 minutes), le ratio écorce/solvant (200; 100; 50 mg/mL) et la température de chauffage (80; 100 °C), (Tableau 2.1) (Vazquez et al., 2001).Le plan factoriel permet de combiner les différents paramètres et de les étudier individuellement grâce à l’utilisation des répétitions cachées dans le traitement statistique.Les extractions ont été effectuées en duplicata (validé statistiquement par la valeur de l’erreur dans l’ANOVA). Par exemple, il y aura deux extraits «EPN-A», portant les noms de « EPN-A1 » et «EPN-A2».Les variables choisies pour évaluer l’optimisation de l’extraction sont : le rendement, les teneurs en grandes familles phytochimiques (phénols totaux, proanthocyanidines et sucres totaux), le pouvoir antioxydant (test DPPH) et les concentrations en composés phénoliques de petit poids moléculaire. Les données ont ensuite été traitées selon des analyses statistiques : l’analyse de la variance (ANOVA), l’analyse des contrastes et l’analyse en composantes principales (PCA). Les résultats des tests statistiques ont été évalués pour un seuil de significativité à α = 5%.
Méthodes d’analyses chimiques
Analyses chimiques des huiles essentielles et hydrolats
Les huiles essentielles, obtenues en très faible quantité, ont été récupérées dans l’hexane. Les composés organiques de l’hydrolat ont été extraits à l’hexane par partition liquide-liquide dans une ampoule à décanter. Les compositions des huiles essentielles et des hydrolats ont fait l’objet d’un article scientifique présenté dans le chapitre 4. La composition du résinoide d’écorce d’épinette noire est présentée ici en tant que résultat complémentaire.
Chromatographie en phase gazeuse GC et détection FID
La chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique de séparation de composés contenus dans un mélange, permettant leur identification et leur quantification. Ils doivent être suffisamment volatils et thermiquement stables. La détection FID (Flame Ionization Detector) mesure la concentration des composés dans un gaz, l’hydrogène. La quantification par FID est plus précise qu’une quantification en mode SCAN par GC-MS.La séparation a été effectuée sur une colonne Agilent J&W VF-5ms (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm) avec une phase stationnaire apolaire (5%-phényl)-méthylpolysiloxane. Afin d’obtenir une bonne définition des pics, une optimisation du programme de température a été effectuée pour obtenir le gradient suivant : 50 °C à 200 °C à 3 °C/min. Le gaz vecteur entraînant les molécules est l’hélium à raison de 1 mL/min et la flamme est composée d’hydrogène (30 mL/min) et d’air (300 mL/min). Les températures de l’injecteur et du détecteur étaient respectivement de 250 et 285 °C.La quantification des molécules dans le mélange s’effectue grâce à l’aire sous la courbe de chaque pic obtenu. La taille du pic correspond à la quantité du composé dans le mélange étudié. Ainsi l’aire sous la courbe, rapportée à l’aire totale du chromatogramme donne le pourcentage d’un composé dans le mélange.
Méthodes d’identification
Les petits terpènes volatils sont difficiles à identifier car ils possèdent tous sensiblement la même masse moléculaire. Les monoterpènes hydrocarbures par exemple, tous issus de cyclisations et de réarrangement de la même molécule de base, le géranyl diphosphate, ont presque tous la même formule brute et la même masse moléculaire de 136 g/mol. Ceci rend donc complexe leur différenciation. Afin d’identifier les molécules qui composent l’huile essentielle et l’hydrolat de l’écorce d’épinette noire, deux méthodes d’identification sont utilisées : le calcul de l’indice de rétention et l’analyse des spectres de masses. La combinaison des informations de ces deux méthodes, ajoutée à la comparaison avec une molécule standard (lorsque disponible) permet une identification efficace des composés volatils (Zellner et al., 2008).
GC-MS Chromatographie en phase gazeuse et spectroscopie de masse
Le couplage de la GC avec un spectromètre de masse permet d’obtenir pour chaque composé un spectre de masse. Celui-ci présente la fragmentation spécifique du composé ainsi que sa masse moléculaire. L’étude des composés volatils en GC-MS étant très développée, de nombreuses bases de données pour l’analyse de leurs spectres de masse sont disponibles et permettent d’appliquer la déréplication pour l’identification des molécules.Les analyses GC-MS au laboratoire ont été effectuées sur un appareil Varian Saturn 2200 GC/MS/MS. Les conditions de chromatographie en phase gazeuse étaient les mêmes que celle décrites pour l’analyse FID. La source d’ionisation électronique, permet la fragmentation des molécules par la génération d’ions moléculaires par impact électronique à 70 eV. L’acquisition du signal MS était programmée entre 30 et 600 m/z. Les spectres de masse ainsi obtenus ont été comparés à ceux disponibles dans les bases de données NIST 02, Adams et Essentia disponibles dans le logiciel d’analyse MS Workstation Varian.
Indice de rétention
Considérant la phase mobile (le gaz) comme une constante puisque sa vitesse ne change pas, le calcul de l’indice de rétention se base sur le temps de rétention des molécules sur la phase stationnaire de la colonne. La chromatographie en phase gazeuse ségrégue les molécules en fonction de leur volatilité et de leur intéraction avec la phase stationnaire, selon un programme de températures. Ainsi, sur un modèle de colonne donnée (dépendamment de la nature de sa phase stationnaire), leur ordre de sortie sera toujours le même. Basé sur cette supposition, l’utilisation d’un mélange d’alcanes saturés de C7 à C30 permet de créer des échelons sur le chromatogramme. Le calcul de l’indice de Kovats Kramer se base sur le temps de rétention de ces échelons pour standardiser les temps de rétention des molécules dans un mélange complexe. Ainsi l’équation suivante (Équation 1) permet de définir un indice de rétention pour chaque molécule. La comparaison de l’indice calculé avec ceux de la littérature pour le même type de colonne est une méthode précise d’identification (Zellner et al., 2008).
= 100 [ + − ] (Équation 1)− ( +1)
: indice de rétention
: temps de rétention du pic du composé étudié;
: temps de rétention du pic de l’alcane à z atomes de carbone qui précède le composé étudié;
( ): temps de rétention du pic de l’alcane à (z+1) atomes de carbone qui suit le composé +1 étudié;
z : nombre de carbone du pic d’un alcane.
Utilisation des molécules standards
Les molécules standards pures ont été utilisées en GC-FID en tant qu’étalon interne et pour la réalisation d’une courbe étalon d’α-pinène pour une meilleure quantification. En GC-MS, elles ont permis de confirmer l’identification de certaines molécules par comparaison des spectres et en co-élution. Leur temps de rétention ont également été des repères sur le chromatogramme et ont permis la validation des indices de Kovats Kramer. Dix-sept molécules standards ont été utilisées dans cette recherche : α-pinène, β-pinène, limonène, camphre, 4-éthylphénol, bornéol, camphène, sabinène, α-phellandrène, 3-carène, p-cymène, α-terpinéol, verbénone, cis-myrtanol, bornyl acétate, β-caryophyllène, et carvone.
Confirmation de la composition en terpènes volatils par extraction du résinoïde
Afin de confirmer la composition de l’huile essentielle, une extraction à froid avec de l’hexane a été effectuée sur 200 g d’écorce fraiche (soit 76 g d’écorce sèche), pendant 6h sous agitation. Après filtration, l’hexane a été lentement éliminée à l’évaporateur rotatif en dessous de 40 °C. Le résinoïde brut, d’apparence jaune et d’aspect cireux, a été extrait à hauteur de 1,7 g, soit un rendement de 2,24%. La composition du résinoïde a été élucidée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) (Tableau 2.2).
Le résinoïde présente une composition similaire aux huiles essentielles avec notamment une prédominance d’α-pinène (40,8%) et de β-pinène (21,8%). Néanmoins, il contient une proportion plus importante en composés oxygénés (14,6%) que les huiles essentielles (1,1% pour l’entraînement à la vapeur (SD), 6,3% pour la distillation à l’eau (WD)). Lors de la distillation, la majorité des composés oxygénés se retrouve préférentiellement dans l’hydrolat car ils sont plus polaires que les composés hydrocarbures. La partition naturelle des composés qui s’effectue entre la phase polaire (hydrolat) et la phase apolaire (huile essentielle) n’a pas lieu lors de l’extraction à froid à l’hexane, qui récupère ainsi un peu plus de composés oxygénés. Le résinoïde possède également plus de sesquiterpénoïdes (14,2%) que les huiles essentielles (SD 0,8%; WD 2,9%). Les sesquiterpènes, composés à 15 carbones, sont plus lourds que les monoterpènes. Ils sont ainsi moins volatils, avec des points d’ébullition plus élevés, ce qui affecte leur vaporisation lors de l’hydrodistillation des huiles essentielles (Sell, 2010). Lors d’une extraction à l’hexane, la polarité des composés est privilégiée. Ainsi les sesquiterpènes hydrocarbures, très apolaires, auront une très bonne affinité avec l’hexane.L’extraction du résinoïde à partir de l’écorce de l’épinette noire a permis dans un premier temps de valider la composition des écorces en monoterpénoïdes et sesquiterpénoïdes volatils. En effet, les principales différences entre la composition du résinoïde et celles des huiles essentielles résident principalement dans certaines spécificités physico-chimiques inhérentes aux procédés employés. Étant donné le rendement obtenu, il pourrait être intéressant de poursuivre l’étude du résinoïde d’écorce d’épinette noire en produisant l’absolue (extraction spécifique des composés odorants à l’éthanol). Le résinoïde et l’absolue pourraient constituer des produits de parfumerie au même titre que l’huile essentielle.
Analyses chimiques des extraits aqueux
Les résultats des analyses chimiques des extraits aqueux sont présentés dans les chapitre 5 (pour les extraits issus du procédé intégré) et 6 (pour les extraits issus de l’optimisation de l’extraction à l’eau chaude). Des résultats complémentaires au chapitre 5 sont fournis dans cette section à titre de résultats préliminaires non publiés.
Tests colorimétriques
Les tests colorimétriques évaluent les teneurs en famille de composés dans un mélange. Exprimés selon des standards grâce à des courbes de calibration, ils permettent d’avoir un premier aperçu de la composition relative d’un extrait, de faire des screenings et des comparaisons.
Phénols totaux
La teneur en composés phénoliques a été mesurée par le test de Folin-Ciocalteu, selon une méthode adaptée de St-Pierre et al. (2013). Il s’agit d’une réaction d’oxydation des composés phénoliques par le réactif de Folin-Ciocalteu, constitué d’un mélange d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40) et d’acide phosphotungstique (H3PW12O40). L’oxydation des phénols entraine simultanément la réduction du réactif en oxydes de tungstène et de molybdène produisant une coloration bleue mesurable par spectrophotométrie. Le taux de phénol totaux est exprimé en acide gallique équivalent (mg GAE/g d’extrait sec) à l’aide d’une courbe de calibration d’acide gallique.
Tanins condensés (proanthocyanidines totaux)
L’évaluation de la teneur en tanins s’effectue par la quantification des proanthocyanidines obtenue par le test du butanol-acide chlorhydrique décrit par Porter et al. (1985). L’hydrolyse acide fragmente les oligomères et les polymères de tanins en unités monomériques d’anthocyanes qui produisent une coloration mauve par réaction d’oxydation avec un réactif ferrique. Le taux en proanthocyanidines est déterminé par mesure de l’absorbance des solutions à 550 nm par spectrophotométrie et exprimé en cyanidine équivalent (mg CCE/g d’extrait sec) à l’aide d’une courbe de calibration de chlorure de cyanidine.
|
Table des matières
Introduction
Chapitre 1 Revue de littérature
1.1. Les écorces
1.2. Les extractibles forestiers
1.3. Les terpénoïdes
1.3.1. L’oléorésine, la source des terpénoïdes
1.3.2. Voie de biosynthèse
1.3.3. Les monoterpénoïdes
1.3.4. Les sesquiterpénoïdes
1.3.5. Les diterpénoïdes
1.3.6. Les triterpénoïdes et tétraterpénoïdes
1.4. Les composés phénoliques
1.4.1. Voies de biosynthèse
1.4.2. Les phénols et acides phénols
1.4.3. Les stilbènes
1.4.4. Les lignanes et néolignanes
1.4.5. Les flavonoïdes
1.4.6. Les tanins
1.5. Les méthodes d’extraction
1.5.1. Extraction des molécules hydrophobes : les terpènes volatils
1.5.2. Extraction des molécules hydrosolubles : les polyphénols
1.5.3. Paramètres influençant l’extraction
1.6. Les extraits d’épinette noire
1.6.1. Extraits polyphénoliques
1.6.2. Huiles essentielles et extraits lipophiles
1.7. Valorisation de la biomasse forestière
1.8. Objectifs de la recherche
Chapitre 2 Méthodologies
2.1. Préparation et conditionnement du matériel végétal
2.2. Les procédés
2.2.1. Hydrodistillation et conception du procédé intégré
2.2.2. Optimisation de l’extraction à l’eau chaude
2.3. Méthodes d’analyses chimiques
2.3.1. Analyses chimiques des huiles essentielles et hydrolats
2.3.2. Analyses chimiques des extraits aqueux
2.3.3. Mesure de la capacité antioxydante
2.3.4. Pouvoir calorifique supérieur
Chapitre 3 Les résines et huiles essentielles de conifères : composition chimique et applications
Résumé
Abstract
3.1. Introduction
3.2. Oleoresin from conifers of temperate zone
3.2.1. Resins from Pinaceae and Cupressaceae families
3.2.2. Essential oils from Pinaceae and Cupressaceae families
3.3. Uses of conifer resins and essential oils
3.3.1. Therapeutic properties of conifer essential oils
3.3.2. Conifer scent in the perfumer’s palette
3.3.3. Conifer resin in archeological and art objects
3.4. Conclusion
Chapitre 4 Composition chimique de l’huile essentielle et de l’hydrolat des écorces résiduelles de Picea mariana
Résumé
Abstract
4.1. Introduction
4.2. Experimental
4.2.1. Materials
4.2.2. Methods
4.3. Results and discussion
4.3.1. Essential oils composition
4.3.2. Hydrosols composition
4.4. Conclusions
Chapitre 5 Procédé intégré pour la production d’extraits naturels à partir de l’écorce de l’épinette noire
Résumé
Abstract
5.1. Introduction
5.2. Materials and methods
5.2.1. Plant material and chemicals
5.2.2. Protocol and process
5.2.3. Hot water extraction of bark samples
5.2.4. Total phenol and proanthocyanidin contents of bark extracts
5.2.5. DPPH assay for antioxidant capacity of the extracts
5.2.6. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assay
5.2.7. Determination of trans-resveratrol concentration in black spruce bark extracts by UPLC MS/MS
5.2.8. Higher heating value of bark after extraction
5.2.9. Statistical analysis
5.3. Results and discussion
5.3.1. Hot water extracts from the integrated process
5.3.2. Higher heating value of the residual bark
5.3.3. Relevance of the integrated process as a biorefinery concept
5.4. Conclusion
Chapitre 6 Optimisation de l’extraction des polyphénols bioactifs de l’écorce de Picea mariana
Résumé
Abstract
6.1. Introduction
6.2. Materials and methods
6.2.1. Plant material
6.2.2. Factorial design for multiple extraction experiment
6.2.3. Extraction procedure for optimization experiment
6.2.4. Isolation and characterization of the hot water extract constituents
6.2.5. Phytochemicals assessments of the extracts
6.2.6. HPLC-DAD analysis
6.2.7. Chemometric analysis
6.2.8. HRMS and NMR analysis
6.2.9. Statistical analysis
6.3. Results and discussion
6.3.1. Effects of extraction parameters on multiple response factors
6.3.2. HPLC fingerprint and chemometric analysis of black spruce bark extract low molecular weight phenolic compounds
6.3.3. Isolation, identification and quantification of low molecular weight phenolic constituents of black spruce bark extract
6.4. Conclusion
Chapitre 7 Conclusions et perspectives
7.1. Conclusions
7.2. Perspectives
Bibliographie
Annexes
Télécharger le rapport complet
