Evolution du contrôle neuroendocrinien de la reproduction : origine et rôle du système kisspeptine ?

La famille des peptides RFamide

Cette famille regroupe un grand nombre de peptides dont la caractéristique commune est de présenter à leur extrémité carboxy-terminale (C-terminale) une arginine (R) suivie d’une phénylalanine (F) qui présente une fonction amide. Le premier représentant de cette famille, dont la séquence est FMRFamide, a été isolé par Price et Greenberg en 1979 dans un ganglion du mollusque Macrocallista nimbosa (Price and Greenberg, 1977). Ce très court peptide a été identifié comme un excitateur cardiaque chez cette espèce. Depuis, des peptides présentant ce même motif RFamide carboxy-terminal ont été identifiés dans d’autres groupes de métazoaires (pour revue : Walker et al., 2009). Chez les vertébrés, les RFamides sont communément classés en cinq groupes distincts (pour revue : Fukusumi et al., 2006; Tsutsui et al., 2010) (Figure 1) :
– Les GnIH (Gonadotropin Inhibitory Hormone) ont été découverts pour leur rôle inhibiteur de la libération des gonadotropines chez la caille (Coturnix japonica) (Tsutsui et al., 2000). Ils ont été décrits par la suite chez d’autres vertébrés (pour revue : Tsutsui et al., 2010). Bien qu’ils n’aient pas un effet inhibiteur chez toutes les espèces, c’est le nom le plus couramment employé. Toutefois, la nomenclature de ces peptides n’est pas encore homogène et ils peuvent se cacher sous les appellations suivantes : RFRP (RFamide Related Peptide), NPVF (Neuro Peptide VF), fGRP (frog Growth hormone Releasing Peptide). Néanmoins, quelle que soit leur appellation, ils partagent tous le même motif carboxy-terminal LPXRFamide avec X= L ou Q.
– Les NPFF ont été découverts pour leur rôle dans la nociception chez l’humain (Perry et al., 1997). Ils ont par la suite été identifiés chez de nombreux vertébrés (pour revue : Osugi et al., 2006). Ils sont souvent confondus avec les peptides GnIH car très proches structuralement et phylogénétiquement. Tous les peptides NPFF partagent le motif Cterminal PQRFamide (pour revue : Osugi et al., 2006).
– Les 26RFa (peptide RFamide de 26 acides aminés), ont été découverts chez un amphibien, Rana esculenta, pour leur rôle orexigénique (Chartrel et al., 2003). Ces péptides ont également été identifiés chez d’autres vertébrés (pour revue : (Ukena et al., 2011)).
– Les PrRP (Prolactin Releasing Peptide) ont été découverts dans le cerveau humain pour leurs propriétés stimulatrices sur la libération de la prolactine (Hinuma et al., 1998). Ces peptides ont été découverts chez d’autres vertébrés chez lesquels ils pourraient avoir de nombreux rôles (pour revue : Fukusumi et al., 2006).
– Les KISS ou Kisspeptines qui ont fait l’objet de cette thèse seront présentés plus en détail.

Tous ces peptides partagent également la propriété d’être considérés, du moins chez les vertébrés, comme des neuropeptides pouvant agir comme des neuro-hormones. En tant que tels, les membres de cette famille peuvent être impliqués dans toutes les fonctions du vivant, de la perception de stimuli internes ou environnementaux (pour revue : (Greives et al., 2008) à la reproduction (pour revue : (Tsutsui et al., 2010) en passant par l’homéostasie générale de l’organisme comme par exemple le contrôle de la prise alimentaire (pour revue : (Bechtold and Luckman, 2007).

Le système kisspeptine

Les kisspeptines

Découverte et diversité des kisspeptines

En 1996, le groupe de D.R. Welch, implanté à Hershey en Pennsylvanie, rapporte la découverte d’un ARNm surexprimé dans des cellules d’une lignée de mélanome humain présentant une faible capacité métastasique (Lee et al., 1996). Cet ARNm, codant pour un peptide précurseur de 145 acides aminés, a été nommé Kiss en l’honneur de la spécialité de Hershey, les fameux « Hershey Chocolate Kiss ». En 1998, West et collaborateurs identifient et localisent sur le chromosome 1 humain, le gène Kiss1 codant pour l’ARNm Kiss (West et al., 1998). En 2001, trois peptides matures sont identifiés et isolés par HPLC à partir d’extrait de placenta humain: Kp(54) (kisspeptine de 54 a.a.), Kp(14) (kisspeptine de 14 a.a.) et Kp(13) (kisspeptine de 13 a.a.) (Kotani et al., 2001; Ohtaki et al., 2001). Ces peptides matures sont issus du clivage enzymatique du prépro-kisspeptine de 145 a.a. Le plus long des trois peptides (Kp(54)) correspond à la métastine, peptide impliqué dans l’effet anti-métastasique sur les cellules de certains cancers (Ohtaki et al., 2001). De plus, il a été montré, en système hétérologue, que le Kp(10) (kisspeptine de 10 a.a. commun aux Kp(54), Kp(14) et Kp(13)) se lie de manière plus spécifique au récepteur des kisspeptines et entraine une plus forte réponse que les kisspeptines plus longs (Kotani et al., 2001; Ohtaki et al., 2001). Depuis 1996, le gène Kiss1 ou ses produits ont été identifiés chez un grand nombre d’espèces appartenant à différents phyla de mammifères (pour revues : Lee et al., 2009; Tsutsui et al., 2010; Um et al., 2010). Il a fallu attendre 2008 pour que le premier Kiss1 soit identifié chez un vertébré nonmammifère, le poisson zèbre (Danio rerio) (Kanda et al., 2008; van Aerle et al., 2008), marquant ainsi le début de l’étude de ce gène chez des espèces non-mammaliennes (pour revues : Lee et al., 2009; Tena-Sempere et al., 2012; Tsutsui et al., 2010; Um et al., 2010). En 2009, Felip et collaborateurs clonent deux ARNm codant pour deux Kiss différents chez un téléostéen, le loup de mer (Dicentrarchus labrax). L’un des deux ARNm a gardé la dénomination Kiss1 en raison du degré de similarité élevé qui existe entre sa séquence de Kp(10) et celles des séquences de mammifères déjà décrites. Le second ARNm a pris l’appellation de Kiss2. La même année, trois ARNm codant pour trois prépro-kisspeptines différents sont clonés chez le xénope (Xenopus tropicalis : Kiss1a, Kiss1b et Kiss2) (Lee et al., 2009). Jusqu’à maintenant, le xénope était l’espèce présentant la plus grande diversité de Kiss. Toutefois, l’existence de deux gènes codant pour différents kisspeptines a été mise en évidence chez le poisson zèbre (Kitahashi et al., 2009), le médaka (Oryzias latipes) (Kitahashi et al., 2009), le poisson rouge (Carasius auratus) (Li et al., 2009), la chimère (Callorhinchus milii) (Lee et al., 2009), la lamproie marine (Petromyson marinus) (Lee et al., 2009) et l’ornithorynque (Ornithorhynchus anatinus) (Lee et al., 2009). Ce dernier est le seul mammifère chez qui deux gènes ont été identifiés. Certaines espèces comme le lézard (Anolis carolinensis), le fugu (Takifugu rubripes), le poisson globe (Tetraodon nigroviridis) ou l’épinoche (Gasterosteus aculeatus) ne présentent dans leur génome que le Kiss2 (pour revue : Tena-Sempere et al., 2012). A ce jour, aucun Kiss n’a été trouvé dans la lignée des oiseaux (pour revues : Akazome et al., 2010; Lee et al., 2009; Tena-Sempere et al., 2012; Um et al., 2010).

Structure des kisspeptines

Les gènes codant les kisspeptines

Les gènes Kiss partagent la même structure. En effet, leur region codante (CDS) est répartie sur deux exons (Figure 2). Le premier exon code principalement pour le peptide signal alors que le second exon code pour le reste du prépro-kisspeptine incluant la séquence codant pour les différents peptides matures (pour revue : Tena Sempere et al., 2012). Les tailles respectives des deux exons dépendent du type de Kiss et de l’espèce dont ils proviennent, mais généralement le CDS fait entre 300 et 480 nucléotides. Le CDS code donc pour une protéine comprise entre 100 et 160 a.a..

Structure primaire des peptides

Les prépro-kisspeptine-1 partagent, entre les espèces, de 12 à 81% d’identité. Ces pourcentages varient de 9 à 82% d’identité pour les prépro-kisspeptine-2. Quant aux pourcentages d’identité d’un type de prépro-kisspeptine par rapport à l’autre, leurs valeurs s’échelonnent de 7% à 16% (pour revue : Tena-Sempere et al., 2012). Ces faibles pourcentages reflètent l’hypervariabilité interspécifique et intergénique des précurseurs des kisspeptines, à l’exception des séquences codant pour les décapeptides matures, Kp(10). En effet, les Kp1(10) partagent entre eux de 70 à 100% d’identité. Les mêmes pourcentages sont retrouvés entre les Kp2(10). Lorsqu’on compare les Kp1(10) aux Kp2(10), on observe de 60 à 90% d’identité. Les précurseurs des kisspeptines sont maturés par clivages enzymatiques successifs (Figure 2), vraisemblablement réalisés par des prohormones convertases comme par exemple des furines (Kotani et al., 2001) ou les prohormones convertases 1/3 ou 2 (pour revue : Seidah, 2011). En C-terminal juste après le motif RF, ils présentent un site de clivage très conservé chez les neuropeptides de vertébrés, qui est constitué d’une glycine (G) et d’un ou deux acides aminés alcalin, une lysine (K) et/ou bien une arginine (R) (pour revue : Seidah, 2011). Les différents sites de clivage en N terminal sont constitués d’un ou plusieurs acides aminés alcalins (R ou K) (pour revue : Seidah, 2011). Tous les précurseurs de Kiss2 de téléostéens présentent une arginine en position 13 à partir du motif RF-amide, ce qui semble indiquer l’existence d’un peptide mature de 12 a.a., Kp2(12) (Zmora et al., 2012). Chez le xénope, dont le prépro-kisspeptine-2 présente une arginine 13 a.a. en amont de son motif RFamide, un Kp2(12) a été isolé par HPLC (Lee et al., 2009). En ce qui concerne les précurseurs des Kiss1, il y a conservation d’un acide aminé alcalin en position 16 à partir du motif RFamide chez la plupart des mammifères et des téléostéens, ce qui semble indiquer l’existence d’un Kp1(15) chez ces espèces (Zmora et al., 2012). De plus, les Kp1(15) potentiels des mammifères présentent en N-terminal un acide glutamique (E) qui subirait une pyroglutamilation qui augmenterait l’affinité de Kp1(15) pour le récepteur Kissr, comme l’a montré Lee et al (2009). Cependant, la séquence des Kp(10) est considérée comme la séquence naturelle minimale permettant la fixation spécifique au récepteur, GPR54/Kissr (Kotani et al., 2001). Ceci permettrait d’expliquer la haute conservation de ces séquences au travers des vertébrés.

Structure tertiaire du decapeptide Kp(10)

Les études pharmacologiques des kisspeptines se sont principalement focalisées sur l’étude des propriétés d’interaction entre les Kp(10) et leurs récepteurs. La recherche d’agonistes plus puissants aux kisspeptines a mené certaines équipes à substituer aux acides aminés de Kp(10) d’autres acides aminés, position par position (Curtis et al., 2010; GutiérrezPascual et al., 2009; Niida et al., 2006). De cette manière, plusieurs publications ont mis en évidence des acides aminés-clés dans la reconnaissance du peptide par le récepteur (rat, Ratus norvegicus : Gutiérrez Pascual et al., 2009 ; humain, Homo sapiens : Curtis et al., 2010). Ainsi, chez l’humain et le rat, les positions 4, 6 et 10 du Kp(10) semblent jouer un rôle critique dans ce processus. En effet, le Kp(10) présente, du moins chez le rat, une conformation hélicoïdale, mélange entre une hélice-α et une hélice-310 (Gutiérrez Pascual et al., 2009). La substitution des acides aminés aux positions 4, 6 ou 10 entraine une perturbation de cette conformation et le Kp(10) n’est plus reconnu correctement par son récepteur (Gutiérrez-Pascual et al., 2009).

Localisation des kisspeptines

La localisation des produits des gènes codant pour les kisspeptines a été étudiée chez les mammifères, certains téléostéens et le xénope. A l’origine, les produits du gène Kiss1 ont été purifiés par HPLC, à partir d’extraits de placenta humain (Kotani et al., 2001; Ohtaki et al., 2001). De plus, des approches par PCR quantitative ont permis de mesurer l’expression de Kiss1 au niveau du placenta, du petit intestin, des testicules, du pancréas, de la rate, des reins et du foie chez l’humain (Muir et al., 2001; Ohtaki et al., 2001). L’expression du transcrit de Kiss1 au niveau du placenta, des reins et du pancréas a également été confirmée par Western blot (Lee et al., 1996). Chez la souris (Mus musculus), l’expression de Kiss1 à aussi été localisée par hybridation in situ dans les cellules α et β des ilôts de Langerhans (Hauge-Evans et al., 2006). Au niveau cérébral, plusieurs études se sont appliquées à la cartographie précise des noyaux exprimant kisspeptine par des approches d’hybridation in situ et d’immunohistochimie. Chez les mammifères, l’expression de Kiss1 a été détectée dans plusieurs populations de neurones de l’hypothalamus (pour revue : Mikkelsen and Simonneaux, 2009). Néanmoins, les répartitions de ces populations diffèrent en fonction des espèces. Toutes les espèces mammaliennes étudiées jusqu’à maintenant présentent des neurones à Kiss1 dans le noyau arqué (ARC) (Franceschini et al., 2006; Gottsch et al., 2004; Kinoshita et al., 2005; Revel et al., 2006; Rometo et al., 2007; Smith et al., 2006). Chez les rongeurs, des neurones exprimant Kiss1 ont également été localisés dans le noyau antéroventral périventriculaire (AVPV) (Gottsch et al., 2004; Kinoshita et al., 2005; Revel et al., 2006; Smith et al., 2006), alors que chez les primates (Rometo et al., 2007) et le mouton (Ovis aries) (Franceschini et al., 2006), l’expression de Kiss1 dans ce noyau est beaucoup moins fréquente. De plus, des fibres neuronales immunoréactives à Kiss1 ont été localisées dans l’aire pré-optique (POA) à proximité de neurones à GnRH chez le rat (Kinoshita et al., 2005) et la souris (Clarkson and Herbison, 2006). Jusqu’à maintenant, le xénope est le seul amphibien chez qui la distribution tissulaire des Kiss a été réalisée (Lee et al., 2009). Kiss1a, Kiss1b et Kiss2 sont tous les trois exprimés dans le cerveau, les testicules, le cœur, et le foie. Kiss1a et Kiss1b sont également présents dans les poumons, l’intestin et l’œil. Kiss1a et Kiss2 sont également exprimés dans les reins. Chez les téléostéens, les distributions des transcrits des gènes Kiss1 et Kiss2 ont été principalement étudiées par une approche de PCR classique. Globalement, Kiss1 et Kiss2 sont majoritairement exprimés dans le cerveau des différentes espèces étudiées quels que soit le sexe ou le stade des individus considérés (medaka : Felip et al., 2009; Kanda et al., 2008; Kitahashi et al., 2009 ; poisson zèbre : Biran et al., 2008; Felip et al., 2009; Kitahashi et al., 2009; van Aerle et al., 2008 ; loup de mer: Felip et al., 2009). Récemment, plusieurs études ont rapporté la cartographie des neurones exprimant les kisspeptines chez plusieurs espèces des téléostéens (pour revue : Ogawa et Parhar, 2012). Chez le médaka, les neurones exprimant Kiss1 sont localisés dans le noyau ventralis tuberis (NVT), le noyau posterioris periventricularis (NPPv) et l’habenula (Kanda et al., 2008; Kitahashi et al., 2009) alors que les neurones exprimant Kiss2 se retrouvent dans l’hypothalamus périventriculaire (Kitahashi et al., 2009). Chez le poisson zèbre, les neurones exprimant Kiss1 se retrouvent dans l’habenula et le l’hypothalamus périventriculaire alors que les neurones à Kiss2 sont localisés dans le noyau tubérale postérieur, le noyau periventriculaire et la POA (Servili et al., 2011). Chez le loup de mer, les neurones à Kiss1 se répartissent dans l’habenula et dans l’hypothalamus rostral médian alors que les neurones exprimant Kiss2 sont situés dans l’hypothalamus dorsal et la POA (Escobar et al., 2012). Chez le bar rayé (Morone saxatilis), Kiss1 et Kiss2 sont co-exprimés par des neurones du noyau récessus latéral (NRL) (Zmora et al., 2012). Le poisson globe, qui ne possède que le gène de Kiss2, présente des neurones à Kiss2 au niveau de l’hypothalamus périventriculaire et de la POA. L’expression des Kiss à l’échelle neuroanatomique semble donc très variable selon les espèces de téléostéens étudiées. La comparaison des profils d’expression de Kiss1 et Kiss2 dans les organes périphériques chez le poisson zèbre, le medaka et le loup de mer a révélé des profils différents pour les deux Kiss selon l’espèce, le stade et le sexe des individus considérés (Felip et al., 2009). Chez le poisson zèbre, Kiss1 est exprimé au niveau des gonades, de l’intestin, du tissu adipeux et de la peau pour les deux sexes, ainsi qu’au niveau du muscle chez la femelle (Felip et al., 2009; Kitahashi et al., 2009; van Aerle et al., 2008). Chez cette espèce, Kiss2 est quant à lui exprimé dans l’hypophyse, l’intestin et les ovaires (Felip et al., 2009; Kitahashi et al., 2009). Chez le médaka, Kiss1 est exprimé au niveau des gonades, de l’estomac et de l’œil pour les deux sexes, ainsi qu’au niveau de la peau chez le mâle (Felip et al., 2009; Kanda et al., 2008). Chez le médaka mâle, Kiss2 est exprimé dans les intestins, le cœur, l’œil et la peau alors que chez la femelle il est exprimé dans les ovaires et les branchies. Chez le poisson rouge, Kiss1 et Kiss2 s’expriment dans l’hypophyse, les gonades, les reins, les branchies, l’intestin et le tissu adipeux (Li et al., 2009; Yang et al., 2010). Kiss1 s’exprime également dans le foie et la rate (Yang et al., 2010) alors que Kiss2 s’exprime dans le cœur (Li et al., 2009). Chez le loup de mer, Kiss1 et Kiss2 s’expriment au niveau des gonades quel que soit le stade ou le sexe des individus (Felip et al., 2009). Les mâles juvéniles présentent également une forte expression de Kiss1 au niveau du cœur (Felip et al., 2009). Chez le poisson globe qui ne présente que Kiss2, ce gène s’exprime dans l’hypophyse, l’œil, les gonades, le foie, la rate et les reins (Shahjahan et al., 2010). Bien que les différents kisspeptines semblent tous être exprimés dans le cerveau quelque soit l’espèce de vertébré, leurs répartitions dans les noyaux cérébraux ainsi que leurs répartitions dans les organes périphériques sont dépendantes de l’espèce, du sexe et du stade de développement des individus étudiés.

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Table des matières

Chapitre 1 : Introduction générale
1. La famille des peptides RFamide
2. Le système kisspeptine
2.1. Les kisspeptines
2.1.1 Découverte et diversité des kisspeptines
2.1.2. Structure des kisspeptines
a. Les gènes codant les kisspeptines
b. Structure primaire des peptides
c. Structure tertiaire du decapeptide Kp(10)
2.1.3. Localisation des kisspeptines
2.2. Récepteurs aux kisspeptines
2.2.1. Découverte et diversité des récepteurs à la kisspeptine
2.2.2. Structure des récepteurs à la kisspeptine
a. Les gènes codant pour les Kissr
b. Les récepteurs
2.2.3. Localisation des récepteurs à la kisspeptine
3. Rôles du système kisspeptine
3.1. Rôles divers du système kisspeptine
3.1.1. Suppression des métastases
3.1.2. Répression de l’invasion du trophoblaste chez les mammifères
3.1.3. Autres rôles
a. Rôle dans le pancréas
b. Rôle cardiovasculaire
3.2. Rôle dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction
3.2.1. L’axe cerveau-hypophyse-gonade
a. Les GnRH
b. La dopamine
c. Les gonadotropines hypophysaires
d. Les stéroïdes sexuels
3.2.2. Découverte du rôle du système kisspeptine dans la reproduction
3.2.3. Régulations des Kiss et Kissr au cours de la maturation sexuelle
a. Chez les mammifères
b. Chez les téléostéens
3.2.4. Rétrocontrôles des stéroïdes sexuels
a. Chez les mammifères
b. Chez les téléostéens
3.2.5. Effets in vivo de traitements aux kisspeptines
a. Chez les mammifères
a. Chez les téléostéens
3.2.6. Effets in vitro de traitements aux kisspeptines
4. Problématique
4.1. Modèle de l’anguille
4.1.1. Intérêt biologique de l’anguille
a. Le cycle de vie de l’anguille européenne
b. Maturation expérimentale de l’anguille
4.1.2. Intérêt phylogénétique des élopomorphes
4.2. Génomes d’intérêt phylogénétique
4.3. Objectifs de la thèse
Chapitre 2 : Matériel et Méthodes
1. Expérimentations in vivo
1.1. Provenance des animaux
1.2. Traitements gonadotropes
1.3. Prélèvement des organes
2. Expérimentations in vitro
2.1. Provenance des animaux
2.2. Cultures primaires de cellules hypophysaires
2.3. Traitement des cellules
3. Distributions tissulaires
3.1. Provenance des animaux
3.2. Prélèvement des organes
4. Clonages
4.1. Séquençage des ARNm codant Kissr-2, Kiss2 et Kiss1
4.2. Séquençage des ARNm codant Kissr-1 et Kissr-3
5. Dosage par PCR quantitative en temps réel
6. Analyses statistiques
7. Analyse de bases de données moléculaires
8. Analyses phylogénétiques
9. Analyses synténiques
Chapitre 3 : Mise en évidence du système kisspeptine chez l’anguille européenne : caractérisation d’un récepteur aux kisspeptines et étude in vitro de l’effet direct hypophysaire de différents kisspeptines sur l’expression des hormones gonadotropes d’anguille.
1. Introduction de l’article 1
2. Article 1: First evidence for a direct inhibitory effect of kisspeptins on LH expression in the eel, Anguilla Anguilla.
Chapitre 4 : Origine et histoire évolutive des récepteurs aux kisspeptines chez les vertébrés : apports des nouveaux génomes et étude de la conservation des Kissr chez l’anguille par détermination de leur distribution tissulaire et de leur régulation au cours d’une maturation expérimentale.
1. Introduction de l’article 2
2. Article 2: Multiple kisspeptin receptors in early osteichthyans provide new insights into the evolution of this receptor family
Chapitre 5 : Conclusion générale

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