Soutenance mémoire
L’articulation arthrosique
L’équilibre et l’homéostasie au niveau des tissus articulaires sont cruciaux pour maintenir une articulation saine. Au moment où cet équilibre est rompu, des changements phénotypiques et morphologiques apparaissent et mènent à une destruction du cartilage articulaire (von der Mark, Gauss et al. 1977; von der Mark K 1986) un remodelage osseux et par la suite une perte de la fonction articulaire normale. Les stress mécaniques, le stress oxydatif, l’âge et plein d’autres facteurs conduisent au déséquilibre entre les fonctions anaboliques et cataboliques, conduisant ainsi à la destruction du cartilage articulaire et à l’apparition d’ostéophytes (Martel- Pelletier, et al., 2008).
Destruction du cartilage articulaire
Les chondrocytes étant le seule type cellulaire existant au niveau du cartilage, ils sont alors les seuls à maintenir l’homéostasie de ce tissu. Malgré leur faible présence ils sont capables de maintenir et régénérer la matrice extracellulaire. Les chondrocytes ont une forte activité métabolique, ils maintiennent l’équilibre entre la synthèse de médiateurs cataboliques tel que les cytokines (IL-1α, β et TNF α) qui induisent la production des métalloprotéases (MMP) responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire ; et la synthèse des médiateurs anaboliques tel que les facteurs de croissances (IGF etTGF β) qui stimulent la production des macromolécules de collagène et de protéoglycans (Westacott and Sharif 1996). Mais quand le diagnostic de l’ostéoarthrose est déclaré, ceci indique que le déséquilibre de cette homéostasie est établi. Dans le cas d’ostéoarthrose précoce, on observe généralement une accumulation d’eau au niveau du cartilage, ce qui mène à l’altération structural du réseau de collagène et ainsi la perte de l’élasticité articulaire. Au cours du développement de la maladie, on a une perte graduelle des protéoglycans et un clivage de la triple hélice de collagène conduisant à la dégradation progressive du cartilage. Les chondrocytes tentent de réparer les dommages causés mais l’équilibre entre la synthèse et la dégradation est rompue favorisant le processus catabolique, en augmentant la synthèse de cytokines pro-inflammatoires et des facteurs cataboliques (Mankin, et al.,1971) (Figure 5).
La figure 5 montre l’effet de différentes cytokines sur la matrice extracellulaire. Les cytokines cataboliques telles que l’IL-1α, β et la TNFα qui induisent la synthèse des métalloprotéases. Et les cytokines anaboliques telles que la TGF β, IGF-1… qui stimule la production du collagène et des protéoglycans.
Le rôle des facteurs inflammatoires et cataboliques dans la pathogenèse de l’arthrose
Au contraire de l’arthrite rhumatoïde, l’arthrose n’est pas considérée comme une maladie inflammatoire primaire, malgré qu’on retrouve au niveau de l’articulation arthrosique des molécules pro-inflammatoires, des cytokines et des facteurs de croissances. Dans le cartilage articulaire et même dans l’os sous-chondral on observe un déséquilibre entre les fonctions anaboliques (la synthèse) et les fonctions cataboliques (la résorption), ce qui mène à une destruction précoce du cartilage, un remodelage osseux et à une perte permanente de la structure et de la fonction articulaire normale. Chez les rats femelles traités de 17 mg Pb/kg dans la nourriture (1 mg Pb/kg/jour) pendant 50 jours, l’étude a montré une diminution dans la croissance du cartilage de l’os (Escribano et al., 1997 ; Gonzalez-Riola et al., 1997).
Les cytokines tel que l’IL-1β et la TNF α sont produites par les synoviocytes, les cellules mononuclées ou par le cartilage articulaire lui-même, ces molécules activent les gènes des métalloprotéases tel que la MMP-13 et empêchent les chondrocytes de réparer la matrice extracellulaire dégradée. De plus ces cytokines sont capables de stimuler la production de la prostaglandine E2 et la libération de l’oxyde nitrique (Haraoui, et al., 1991; Farahat, et al. 1993; Fernandes, et al., 2002; Sofat 2009). (Figures 5)
Le stress oxydatif et arthrose
Les stress oxydatif et les molécules antioxydantes
Toute cellule aérobique subi le stress oxydatif dû à sa respiration. Dans les cellules humaines le stress oxydatif est un processus normal et contrôlable d’où l’existence de deux systèmes antioxydants qui maintiennent l’équilibre. Le premier système est constitué de composés de faibles poids moléculaires qui limitent la propagation des radicaux libres dérivant du stress oxydatif. Une molécule très importante jouant ce rôle est le Glutathion qui est le substrat de deux enzymes le Glutathion peroxydase (GPxs) et le Glutathion S transférase (GST). Ce système est considéré comme la première ligne de défense contre les radicaux libres (Acworth IN 1997). La deuxième ligne de défense sera attribuée aux constituants du deuxième système qui sont les enzymes antioxydantes. Le rôle de ces enzymes est plutôt préventif, parmi ces protéines on a la superoxide dismutase (SOD) qui est une enzyme capable de décomposer les radicaux libres d’oxygène (ROS) prévenant ainsi l’initiation de la peroxydation lipidique et le dommage cellulaire (Awasthi et al. ,1975; Takahashi et al., 1987) (Figure 6). La figure 6 montre Les radicaux libres d’oxygène sont capables d’attaquer la membrane cellulaire et induire la péroxidation lipidique qui aboutira à la production du 4HNE.
L’arthrose et l’apoptose
L’apoptose est un processus de mort cellulaire programmée bénéfique pour le remodelage cartilagineux. Cependant, il existe deux caractéristiques du cartilage qui rendent l’apoptose des chondrocytes néfaste pour ce tissu. Premièrement, l’absence de cellules phagocytaires implique que les cellules mortes ne seront pas phagocytées et demeureront dans la matrice extracellulaire affectant potentiellement la structure de la matrice ainsi que le fonctionnement des chondrocytes viables. De plus, la présence de ces corps apoptotiques pourrait expliquer la calcification anormale du cartilage observée chez les patients OA. En effet, les corps apoptotiques ont la capacité de faire précipiter le calcium (Goggs et al., 2003). Deuxièmement, le cartilage ne contient pas de cellules souches mésenchymateuses et n’est pas vascularisé. Il peut donc difficilement être repeuplé par d’autres cellules. La mort des chondrocytes par apoptose semble jouer un rôle central dans l’altération du cartilage et possiblement dans le développement de l’OA (Lotz et al.,1999). L’apoptose est observée dans le cartilage de patients atteints d’OA et de RA (Yoshimura et al., 2006).
Dans le cartilage OA, il est possible d’observer de la condensation nucléaire, des lacunes vides, la perte d’organelles intracellulaires et une perte de l’intégrité de la matrice (Weiss and Mirow, 1972). Ces observations semblent indiquer la présence d’apoptose.
De plus, la plupart des études portant sur ce sujet voient une augmentation de la mort cellulaire par apoptose dans l’OA. Toutefois, la fréquence des cellules apoptotiques rapportée forme un grand éventail. . La cause exacte de l’apoptose des chondrocytes OA n’est pas parfaitement établi, il semble que plusieurs stimuli pourraient être impliqués.
Le HNE et l’apoptose
Il a été précédemment démontre que le HNE peut induire l’apoptose dans plusieurs types cellulaires. En effet, le HNE conduit à l’apoptose par ses effets sur c-Jun Nterminal protéine kinase (JNK) et sur la caspase-3 (Cheng et al., 2001). Il induit l’apoptose par le relâchement du cytochrome c, l’activation de la P ARP et la fragmentation de l’ADN (Raza and John, 2006). Cette apoptose est couplée à une augmentation de Bax et à une diminution de Bc1-2 (Lee et al., 2004). Dans les cellules PCI2, il a été démontré que le HNE augmente le stress oxydatif induisant ainsi une augmentation de l’expression de la GSTA4-A, du Cytochrome P450 2EI et de la HSP70 (Raza et John, 2006). Dans la lignée cellulaire YPEN-I, le HNE induit la mort cellulaire. Toutefois, cet effet est contré en présence d’antioxydant, le NAC.
Préparation de l’extrait de feuille d’olivier
Les feuilles d’olivier sont collectés dans la région d’Oran (Algerie ) Olea europea au mois de mai 500g feuilles séchées minutieusement au préalable et extraites dans 1,5l d’eau distillée pendant 60mn à 60 °C la solution est filtrée et lyophilisée on a récolté (75g) et conservée à -20 °C.(figure 7 et 8).
Animaux d’expériences
L’étude expérimentale est réalisée sur des jeunes rats Wistar, d’un effectif de 40 rats sevrés âgés d’environ 25 jours et de poids ~70 g. Les animaux ont été élevés à l’animalerie du centre de recherche (hôpital Sacré-Coeur) à une Température de 22 à 25 °C Les animaux ont libre accès à l’eau et à la nourriture et un cycle nycthéméral (lumière / obscurité) de 12 /12 figure 9.
Ces jeunes rats sont répartis au nombre de 2 rats par cage dans des cages en polypropylène. Les animaux sont divisés en trois lots expérimentaux ; un lot témoin et deux lots exposés a l’acétate de Pb. La durée de l’intoxication est de 90 jours ; le mode d’administration est la voie orale.
Le premier lot A : composé d’un effectif de 08 jeune rats qui reçoivent en permanence de l’acétate de plomb dilué dans l’eau de boisson à la dose de (250 mg/l).
-Le deuxième lot B : composé d’un effectif de 08 jeune rats qui reçoivent en permanence de l’acétate de plomb dilué dans l’eau de boisson à la dose de (500mg /l).
Le troisième lot constitue le lot témoin « T » composé de 08 rats qui reçoivent uniquement de l’eau de boisson.
Cependant deux sous groupes exposés au plomb reçoivent l’extrait des feuilles d’olivier à une concentration de 1% durant15 jours par voie orale lot A’ (250mg/l+plante) et le lot B’ (500mg/l+plante) .figure 9 et 10
l’évolution pondérale
Le poids de chaque rat est mesuré à la fin de chaque semaine durant toute la période du traitement. Durant toute la période d’exposition le comportement général des rats, l’état clinique et le taux de mortalité sont pris en considération.
Étude du comportement des rats
Cette étude a porté sur l’évaluation de l’effet du plomb sur l’activité locomotrice, sur les l’état d’anxiété et de résignation (test de test labyrinthe en croix surélevée, test de la nage forcée et saccharose). Ces tests sont réalisés à la fin du traitement.
Mesure de l’activité locomotrice :open field
L’activité locomotrice des rats est caractérisée par l’activité horizontale et verticale des animaux dans la cage d’expérimentation, l’observation des animaux commence quelques secondes après l’introduction des animaux dans la cage d’observation. Ce test analyse le comportement exploratoire du rat dans un espace clos. On l’utilise avant tout pour mesurer ses fonctions motrices, mais aussi, pour évaluer son degré d’anxiété. Un animal anxieux évite le centre du terrain qui est ouvert, et reste au périphérique. Ce test se termine après 15 minutes entre chaque essai on nettoie la cage avec l’éthanol 10% ( Ku¨lli Jaako-Movits a and al 2005).
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Table des matières
ABREVIATION
LISTE DES TABLEAU X et FIGURES
RESUME
ABSTRACT
Introduction
I – REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1-1 Propriétés physico-chimiques du plomb
1-2 -Nocivité
1-3 Sources d’intoxication par le plomb
1-3-1 Milieu aquatique
1-3-2 Atmosphère
1-3-3 Sols
1-3-3-1 Dans les Végétaux
1-3-4 Chaîne alimentaire
1-4-Métabolisme du Plomb
1-4-1 Absorption
1-4-2 Distribution
1-4-3 Excrétion
1-5- Principaux effets toxiques du plomb sur la santé humaine
1-5-1 Intoxication aigue
1-5-2 Intoxication professionnelle
1-5-3 Intoxication chronique
1-5-3-1 Effets hématologiques
1-5-3-2 Effets rénaux
1-5-3-3 Effets sur le système cardio vasculaire
1-5-3-4 Autres effets
1-5-3-5 Effets sur le système nerveux central
1-5-3-6 Effets sur le système nerveux périphérique
1-5-3-7 Changement sur les systèmes de communications nerveuses
1-5-3-7-1 Système glutaminergique
1-5-3-7-2 Système dopaminergique
1-6 Le stress oxydant
1-6-1 Définition
1-6-2 Mécanismes pro oxydants
1-7-Le 4-Hydroxynonenal (4-HNE)
1-7 -1 Effets du 4HNE sur l’os
1-7 -2 Introduction sur l’arthrose
1-7 -2-1 L’articulation arthrosique
1-7-2-2 Destruction du cartilage articulaire
1-7-3-Le rôle des facteurs inflammatoires et cataboliques dans la pathogenèse de l’arthrose
1-8 Le stress oxydatif et arthrose
1-8-1-Les stress oxydatif et les molécules anti oxydantes
1-8-2-L’arthrose et l’apoptose
1-8-3-HNE et l’apoptose
2 – MATERIEL ET METHODES
2-1-Préparation de l’extrait de feuille d’olivier
2-2-Animaux d’expériences
2-2-1 l’évolution pondérale
2-2-3 Étude du comportement des rats
2-2-3-1 Mesure de l’activité locomotrice :openfield
2-2-3-2 Test de stress
2-2- 3-2-1 Test de test labyrinthe en croix surélevée
2-2- 3-2-2 Test de la nage forcée
2-2- 3-2-3 Test d’Anhédonie
2 -3 Analyses biochimiques
2-3-1 Dosage du glucose
2-3-2 Dosage du plomb
2-3-3 Dosage de la dopamine de la sérotonine au niveau cérébrale et sanguin et du glutamate dans le sang
2-3-4 Dosage du glutamate dans le sang
2-3-5 Dosage de la sérotonine
2-3-6 Dosage de la dopamine dans l’hippocampe, et l’amygdale
2-3-7 Mesure de l’activité des enzymes antioxydants
2-3-7-1 Dosage HNE (4 Hydroxynonénal) sérique
2-3-7-2 Quantifications des niveaux de GSH et GSSG
2-3-8 Évaluation l’expression de marqueurs apoptotiques
2-3-8-1 Activité de la Caspase 3
2-3-8-2 Immunohistochimie
2-3-8-3 Fragmentation du DNA
2-4- Traitement statistique des résultats
3- RESULTATS
3-1 Effet du Pb sur l’évolution pondérale
3-2 Effet du Pb sur la prise d’eau
3-3 Mesure de l’activité locomotrice
3-4 Évaluation de l’état dépressif des rats
3-4-1 Test de test labyrinthe en croix sur élevée (Branche ouverte)
3-4- 2 Test de la nage forcée
3-4-3 Test d’Anhédonie (évaluation du volume du saccharose)
3-4-4 Dosage du glucose
3-5 Dosage du plomb sanguin
3-6 Dosage du plomb au niveau cérébral
3-7 Dosage du Glutamate
3-8 Dosage de la sérotonine et dopamine
3-9 Dosage du 4-hydroxynonenal (HNE) et quantification du rapport GSH/GSSG
3-10 Évaluation de l’expression des marqueurs apoptotiques au niveau de l’hippocampe et du cortex préfrontal
4 -DISCUSSION
5- CONCLUSION
6- RÉFÉRENCES IBLIOGRAPHIQUES
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