Etudes chimique et biologique d’une plante médicinale : Dilobeia thouarsii (PROTEACEAE)

LES PLANTES MEDICINALES ET LES MALADIES INFECTIEUSES A MADAGASCAR

                    A Madagascar, 81% des décès néonatals sont d’origine infectieuse [Andriamady et al., 1999]. Les données statistiques sanitaires auprès des 11 postes sentinelles de surveillance épidémiologique des maladies transmissibles, répartis sur l’ensemble du territoire national Malgache montrent que la cause de morbidité des malgaches est due aux maladies infectieuses (12,5%) après le paludisme (30 à 40 %) [Ratsimbason, 2002; Rivière et al., 2005].Ces données sont en accord avec le rapport de l’O.M.S. sur la santé dans le monde (1997) selon lequel les maladies infectieuses et parasitaires font partie du groupe de maladies le plus meurtrier dans les pays pauvres. L’utilisation des antibiotiques de synthèse n’est pas à la portée des bourses des ménages malgaches [Rasamoelisoa et al., 1999]. Les patients malgaches se tournent vers les plantes anti-infectieuses. Citons par exemple :
• Cinnamosma fragrans (Cannelaceae) ou Mandravasarotra. Elle est couramment utilisée dans le Nord –Ouest de Madagascar pour traiter des plaies et des abcès. Elle a un effet anti-infectieux puissant sur Staphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella typhi, Neissseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Listeria sp, Streptococcus sp, Shigellasp, Pasteurella sp [Randrianarivelo et al., 2009].
• Helichrysum gymnocephalum (Asteraceae) ou Rambiazina dont les feuilles broyées sont employées sur les hauts plateaux pour leurs propriétés antiseptiques et désinfectantes [Boîteau, 1986].
• Buddleja madagascariensis (Buddlejacées) ou Seva est un excellent désinfectant et antibiotique naturel [Boîteau, 1986].
Bien que l’utilisation des plantes en médecine traditionnelle soit importante à Madagascar, nombreuses sont les plantes qui n’ont pas encore fait l’objet d’étude. On peut citer parmi tant d’autres, Dilobeia thouarsii Roemer and Schulte (Proteaceae), qui constitue le matériel de la présente étude. Elle est réputée pour ses effets anti-infectieux. Comme nous l’avions déjà signalé plus haut, cette plante n’a pas encore été étudiée ni sur le plan chimique, ni sur le plan pharmacologique. Par ailleurs, elle est bien connue et relativement abondante dans la région de Mandraka où nous avions mené nos enquêtes et effectué nos récoltes.

Biosynthèse des molécules phénoliques

                   Les molécules phénoliques ou polyphénols regroupent un vaste ensemble de plus de 8000 molécules [Urquiaga et Leighton, 2000], divisées en une dizaine de classes chimiques, qui présentent toutes un point commun : la présence dans leur structure d’au moins un cycle aromatique à 6 carbones, lui-même porteur d’un nombre variable de fonctions hydroxyles (-OH) [Bravo, 1998]. Les représentants les plus nombreux (plus de 5000 molécules isolées) et les plus connus en sont les flavonoïdes, les anthocyanes, un groupe de tanins, et les proanthocyanidines. Néanmoins, de nombreuses autres structures existent, tels que les acides phénols (dérivés de l’acide cinnamique, par exemple), les tanins hydrolysables, les coumarines, les lignanes, les quinones et autres phloroglucinols. Les composés phénoliques participent activement aux interactions de la plante avec son environnement en jouant soit le rôle de signaux de reconnaissance entre les plantes (Allélopathie), entre les plantes et les symbioses, ou bien permettant à la plante de résister aux diverses agressions d’ organismes pathogènes. Ils participent de manière très efficace à la tolérance des végétaux à des stress variés, donc ces composés jouent un rôle essentiel dans l’équilibre et l’adaptation de la plante au sein de son milieu naturel [Macheix et al, 2005]. D’un point de vue appliqué, ces molécules constituent la base des principes actifs que l’on trouve chez les plantes médicinales. Chez l’homme, elles jouent un rôle important en diminuant le risque de survenue d’un certain nombre de pathologies, en particulier celles liées au vieillissement et aux lésions oxydatives (cancers, maladies cardiovasculaires ou neuro dégénératives) [Cook et Samman1996 ; Hennebelle et al., 2004; Menvielle, 2005]. La plus grande partie des molécules phénoliques dérive de la voie des phénylpropanoïdes qui fait suite à la voie de l’acide shikimique aboutissant à la formation des acides aminés aromatiques [Hopkins et Evrard, 2003].

Propriétés antimicrobiennes

a) Activités antibactériennes : L’extrait brut des feuilles et des racines de Toronia toru est actif contre les bactéries Gram+ (Bacillus subtilis, Dermatophilus congolensis, et Staphylococcus aureus) et les bactéries Gram-(Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa) [Perry et Brennan, 1997]. Le Lapachol, un naphtoquinone isolé de Conospermum teretifolium R. Br. a montré une activité bactéricide [Hussain et al., 2007]. Le 5-n- alkylresocinol, isolé de Hakea trifurcata, est un agent antibactérien intéressant [Parikka, 2007]. Le 4-hydroxyphenyl 6-O-[(3R)-3,4-dihydroxy-2- methylenebutanoyl]-β-Dglucopyranoside, isolé du croisement de Persoonia linearis et P.pinifolia a un effet antibactérien sur les souches Bacillus subtilis et Escherichia coli [MacLeod et al., 1997].
b) Activités antifongiques : Il a été montré que l’extrait brut de Toronia toru a une activité antifongique contre le dermatophyte Trichophyton mentagrophytes [Perry et Brennan, 1997]. L’extrait acétate d’éthyle et méthanolique d’un hybride de Persoonia linearis et P.pinifolia a une activité antifongique contre le Phytophthora cinnamomi [MacLeod et al., 1997].

Flavonoïdes

              La méthode employée est celle de Shibata ou réaction à la cyanidine. Quelques mg de résidu d’évaporation à sec de l’extrait aqueux à étudier sont dissous dans du méthanol 50%. Puis, un fragment de tournure de magnésium y est ajouté avec quelques gouttes d’acide chlorhydrique (HCl) concentré. Il se produit une réaction exothermique mousseuse. A la fin d’une réaction positive il apparaît :
– une coloration rouge indiquant la présence des flavonols aglycones ou
– une coloration orange indiquant la présence des flavonones aglycones.

Chromatographie sur couche mince (CCM)

                   Cette méthode est employée pour suivre la purification des fractions analysées. Par ailleurs, elle donne une idée sur la polarité des différents composés. L’échantillon à étudier migre par capillarité sur une plaque de silice (phase stationnaire) avec un indicateur de fluorescence (Si02 60 F254 MERCK) à l’aide de différents mélanges de solvants (phase mobile). Le comportement de chaque molécule sur la plaque dépend des interactions existant entre soluté, phase mobile et phase stationnaire. Cette technique permet d’avoir une idée sur le nombre de produits dans un mélange et de définir le système de solvants le mieux adapté à la purification à effectuer. Elle permet également de vérifier la présence et le degré de pureté des produits étudiés. Par cette technique on peut connaître le Rf (Référence frontale) de chaque composé, qui est le rapport de la distance parcourue par cette molécule sur celle parcourue par la phase mobile (front du solvant) et qui peut donc être compris entre 0 et 1. Les chromatogrammes sont analysés en lumière visible et sous UV (254 et 356 nm), avant et après révélation par les réactifs appropriés. Plusieurs réactifs ont été utilisés :
– L’acide phosphomolybdique (révélateur universel) : Une solution de 5 à 5% dans EtOH. Chauffage à 110°C jusqu’à la formation optimale des tâches.
– La vanilline sulfurique (révélateur universel) : C’est un réactif à large spectre qui permet de détecter les sucres, les flavonoïdes, les terpenoïdes et les phénols. Une solution de 10 g de vanilline dans 100 ml d’éthanol et 1ml d’acide sulfurique est vaporisée sur la plaque CCM, puis celle-ci est chauffée à 110 C pendant quelques min. jusqu’à apparition des taches.
– L’anisaldéhyde : Ce révélateur est utilisé spécifiquement pour révéler les sucres, les stéroïdes et les terpènes. Il est obtenu en dissolvant 0,5 g de para-anisaldéhyde, 0,5 d’acide sulfurique, 0,1 ml d’acide acétique glacial dans 9 ml d’éthanol à 95 %. Après pulvérisation, la plaque CCM est chauffée à 110 °C pendant 5 min. environ pour faire apparaître différentes colorations en fonction du type de composés.
– Le réactif de Liebermann Burchard : Ce révélateur est spécifique des terpènes et stérols. Il est préparé en mélangeant à volume égal 5 ml d’acide sulfurique et d’anhydride acétique. Le mélange est ensuite refroidi dans un bain de glace. Après pulvérisation, la plaque est chauffée à 110°C pendant 5 min environ.

ACTIVITES ANTIFONGIQUES

                La méthode décrite au paragraphe précédent a été utilisée (cf. : 2.3.2.1). Seulement, la suspension microbienne a été composée de 105 conidies/ml de spore pour les champignons et 106 cellules /ml pour les levures. Le «Potato Dextrose Agar » (PDA) a été le milieu de culture utilisé. Les boîtes de Pétri ont été ensuite incubées à 27°C. Le diamètre de la zone d’inhibition (mm) autour de chaque disque a été mesuré toutes les 24h pendant 72 h pour les champignons et 48 h pour les levures. Les antifongiques de référence, nystatine et ketoconasole, sont utilisées comme témoins positifs.

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Chapitre 1: ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Les plantes médicinales à Madagascar
1.2. Les plantes médicinales et les maladies infectieuses à Madagascar
1.3. Données sur la famille des Proteaceae
1.3.1. Historique
1.3.2. Généralités sur la famille
1.3.3. Description botanique
1.3.4. Données ethnopharmacologiques et ethnobotaniques
1.3.4.1. Utilisations des Proteaceae dans le monde
1.3.4.2. Intérêts économiques
1.3.4.3. Utilisation traditionnelle à Madagascar
1.3.5. Travaux phytochimiques et pharmacologiques antérieurs sur les Proteaceae
1.3.5.1. Etudes phytochimiques antérieures
1.3.5.1.1. Biosynthèse des molécules phénoliques
a) voie de l’acide shikimique
b) Voie des phénylpropanoides
c) Les flavonoïdes
c.1. Les flavonols
c.2. Les flavanonols
d) Autres composés phénoliques chez les Proteaceae
1.3.5.1.2. Les naphtoquinones
1.3.5.1.3. Les alcaloïdes
1.3.5.2. Etudes pharmacologiques
1.3.5.2.1. Propriétés antimicrobiennes
a) Activités antibactériennes
b) Activités antifongiques
1.3.5.2.2. Activités cytotoxiques
1.3.5.2.3. Activités antioxydantes
1.3.5.2.4. Activités antiparasitaires
1.3.5.2.5 Activités anti-inflammatoires
1.4. Données sur le genre Dilobeia et l’espèce thouarsii Roem. & Schult
1.4.1. Enquêtes ethnobotaniques
1.4.2. Intérêts économiques
1.4.3. Classification botanique
1.4.4. Description botanique
1.4.5. Distribution géographique
Chapitre 2: MATERIELS ET METHODES
2.1. COLLECTE ET PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL
2.2. MATERIELS ET METHODES UTILISES POUR L’ETUDE CHIMIQUE
2.2.1. Criblages chimiques
2.2.1.1. Caractérisation des saponosides
2.2.1.2. Caractérisation des alcaloïdes
2.2.1.3. Caractérisation des flavonoïdes et des leucoanthocyanes
2.2.1.3.1. Flavonoïdes
2.2.1.3.2. Leucoanthocyanes
2.2.1.4. Caractérisation des tanins et polyphénols
2.2.1.5. Caractérisation des stéroïdes et triterpènes
2.2.1.6. Caractérisation des hétérosides
2.2.1.7. Caractérisation des anthraquinones
2.2.1.8. Caractérisation des désoxyoses
2.2.1.9. Caractérisation des iridoïdes
2.2.2. Chimie extractive
2.2.2.1. Chromatographie analytique
2.2.2.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
2.2.2.2. Chromatographie préparative
2.2.2.2.1. Chromatographie sur colonne ouverte à basse pression
a) Chromatographie d’adsorption
b) Chromatographie d’exclusion
2.2.2.2.2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC)
2.2.3. Chimie analytique et structurale
2.2.3.1. Activité optique
2.2.3.2. Spectrométrie de Masse (SM)
2.2.3.3. Spectrométrie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
2.2.4. Extraction, fractionnement et purification
2.2.4.1. Extractions
2.2.4.1.1 Extraction à chaud au soxhlet
2.2.4.1.2. Extraction à froid par lixiviation
2.2.4.2. Fractionnement et purification
2.3. MATERIELS ET METHODES UTILISES POUR L’ETUDE BIOLOGIQUE
2.3.1. Test antibactérien préliminaire
2.3.2. Détermination des activités antibactériennes et antifongiques
2.3.2.1. Spectre d’activité antibactérienne
2.3.2.1.1 Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et de
la Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
2.3.2.2. Activités antifongiques
2.3.3. Evaluation de l’activité anti-oxydante
2.3.3.1. Dosage des polyphénols totaux
2.3.3.2. Mesure de l’activité antioxydante par la méthode de DPPH
2.3.4. Evaluation de l’activité cytotoxique
2.3.4.1. Lignée cellulaire
2.3.4.2 Préparation du milieu de culture
2.3.4.2.1. Le Sérum de Bovin Fœtal
2.3.4.2.2. Le β-mercaptoéthanol
2.3.4.2.3. Le milieu de culture
2.3.4.3. Préparation de différents réactifs
2.3.4.3.1. Le Rouge Neutre
2.3.4.3.2. Le Lauryl Sulfate
2.3.4.4. Mise en culture des cellules P388
2.3.4.4.1. Numération cellulaire: Principe de comptage
2.3.4.5. Tests de cytotoxicité
2.3.4.5.1. Préparation des solutions mères d’extraits bruts et des produits isolés
2.3.4.5.2. Préparation des solutions filles d’extraits bruts et des produits isolés
2.3.4.5.3. Criblage préliminaire
2.3.4.5.4. Évaluation de la viabilité cellulaire
2.3.4.5.5. Détermination de la Concentration Inhibitrice à 50%
2.3.4.5.6 Expression des résultats
2.3.5. Activite antiplasmodiale in vitro
Chapitre 3 : ETUDES PRELIMINAIRES
3.1. Introduction
3.1.1. Choix de la période de récolte
3.1.2. Choix de la partie de plante et l’extrait à étudier
3.1.3. Criblage phytochimique
3.2. Conclusion
Chapitre 4 : ETUDE CHIMIQUE DE L’EXTRAIT ACETATE D’ETHYLE DE FEUILLE DE Dilobeia thouarsii
4.1 Extractions
4.2 Investigations phytochimiques sur l’extrait AcOEt de feuille de Dilobeia thouarsii
4.2.1. Purification et isolement des constituants de l’extrait AcOEt obtenu au soxhlet
4.2.2. Détermination structurale des composés P1 et P2
4.2.2.1 Structure du composé P1: 4- aminophénol
4.2.2.2 Structure du composé P2: 4-hydroxybenzaldéhyde
4.2.3. Purification et isolement des constituants de l’extrait AcOEt obtenu par lixiviation
4.2.4. Détermination structurale des composés P3 à P9
4.2.4.1. Diprényl-dihydroquercetols
4.2.4.1.1. Structure du composé P3: Dilobenol A
4.2.4.1.2. Structure du composé P6: Dilobenol C
4.2.4.1.3. Structure du composé P7: Dilobenol F
4.2.4.1.4. Structure du composé P8: Dilobenol E
4.2.4.2. Diprényl-dihydrokaempférols
4.2.4.2.1. Structure du composé P5: Dilobenol D
4.2.4.2.2. Structure du composé P9: Dilobenol G
4.2.4.2.3. Structure du composé P4: Dilobenol B
Chapitre 5 : ETUDE BIOLOGIQUE DES EXTRAITS DE FEUILLE, D’ECORCE ET DES COMPOSES ISOLES
5.1. Etude des propriétés biologiques des extraits bruts
5.1.1. Evaluation des activités antioxydantes
5.1.1.1 Dosage des polyphénols totaux
5.1.1.2. Activités antioxydantes
5.1.2. Evaluation des activités cytotoxiques
5.2. Etude des propriétés biologiques des composés isolés
5.2.1. Activités antimicrobiennes
5.2.1.1. Activités antibactériennes
5.2.1.2. Activités antifongiques
5.2.2. Activités cytotoxiques de P1 et P2
5.2.3. Activités antiplasmodiales in vitro
DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE –PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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