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Réticulation d’objet
Les auto-assemblages simples présentés ci-dessus ont le mérite d’être aisés à fabriquer. Toutefois, ils peuvent présenter dans certains cas une fragilité vis-à-vis des milieux biologiques, ce qui peut conduire au relargage prématuré du principe actif [107-111]. Pour limiter ce phénomène, la réticulation des vecteurs a été étudiée depuis une quinzaine d’années.
Plusieurs stratégies ont été évaluées, à savoir la réticulation de la coque, du coeur ou à l’interface entre les zones hydrophobes / hydrophiles [112, 113]. Même si le sujet a été étudié pendant plus de 15 ans, de nouveaux cas sont encore en cours de publication, avec des méthodes différentes de réticulation, telles que des réactions radicalaires [114-117], des formations de liaisons disulfures réversibles [118-124], ou des réactions de couplage [125-132]. Des approches originales ont utilisé des fragments uracyle [133], l’oxydation de la dopamine en présence d’air [115] ou la dimérisation réversible du cinnamate [134]. Des systèmes plus sophistiqués présentent une réticulation permettant la libération du médicament avec des conditions adéquates physiologiques (présence de dithiothréitol ou de glutathion, différence de pH) [135, 136]. Rajdev a montré que des liaisons hydrogène entre les groupes hydroxyles dans le poly (méthacrylate d’hydroxyéthyle) peuvent être utilisé comme réticulant supramoléculaire [137]. Le même concept pourrait être suggéré pour des micelles présentant une grande quantité de π-stacking [138].
En ce qui concerne l’efficacité thérapeutique, les systèmes réticulés amphiphiles sont le plus souvent testés in vitro sur culture cellulaire 2D. Cela conduit presque toujours à une baisse de l’activité du médicament par rapport à la forme libre ou encapsulée dans un vecteur non réticulé [115-117, 125]. Seuls quelques cas ont des activités de la même gamme ou supérieures [130, 138, 139].
Les PICs ont aussi été réticulés pour limiter leur fragilité aux milieux salins. Pour cela des thiols [140, 141], des amines [142], des imines [143] ou la chimie click [144] ont été utilisés.
Synthèse des Nano-objets polymères
La plupart des micelles de polymères et les polymersomes ne sont pas thermodynamiquement à l’équilibre mais figés cinétiquement lors de leur formation. Ainsi, la méthode de formation influe directement sur la morphologie et la taille des auto-assemblages obtenus. En revanche, une fois créés, ceux-ci n’évoluent pas dans le temps ou lentement malgré leur absence d’équilibre ce qui leur permet de résister à de très fortes dilutions.
Il existe plusieurs méthodes de formation couramment utilisées dans la littérature :
– L’addition de co-solvant [Annexe] consiste à introduire dans l’eau le polymère dans un solvant miscible à l’eau, la fuite de ce solvant permettant la formation des objets. Cette méthode peut être modifiée par l’utilisation de mélanges de solvant ou l’addition de petites molécules modifiant les coefficients de partage des entités [145]. De nombreuses méthodes de micro fluidique essayent d’améliorer encore cette voie.
– L’hydratation de film sec, éventuellement associée à une phase de sonication/extrusion, est la méthode de choix de fabrication des polymersomes [Annexe]. Elle vient de la fabrication de vésicules lipidiques et suit les mêmes idées. Comme pour les vésicules, le mécanisme exact de gonflement du film n’est pas encore parfaitement compris.
– L’électroformation est la troisième des méthodes utilisées, elle vient aussi des vésicules lipidiques et, comme cette dernière, n’est pas maitrisée théoriquement. Cependant elle permet de faire des polymersomes géants, de taille supérieure au micron.
Caractérisations usuelles des nano-vecteurs polymères
Comme nous l’avons vu, un grand nombre d’architecture et de morphologies sont utilisables comme vecteurs polymères. La gamme de taille visée fait que, usuellement et de façon routinière, deux techniques d’analyse sont utilisées : la diffusion dynamique de la lumière (DLS), qui est souvent adjointe à une microscopie électronique à transmission (TEM).
La TEM ne sera pas abordée dans ce chapitre bibliographique car c’est une technique complexe qui induit facilement des erreurs mais qui est souvent réalisée par des techniciens ou ingénieurs spécialisés dans le domaine au vu de la technicité de l’objet.
La DLS à l’opposé est devenue une technique “Presse-bouton” grâce à la société Malvern qui a été très vite suivie par de nombreuses autres compagnies. Ce développement a produit une explosion des articles présentant des analyses DLS, éventuellement associées à des mesures de potentiels zeta. Nous avons donc décidé de prendre le temps de revenir sur ces deux techniques, en y associant la diffusion statique de la lumière.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AsFlFFF)
Ces méthodes de Field Flow Fractionnation ou fractionnement flux force (FFF) sont des méthodes de fractionnement permettant de séparer des objets ou analytes par un écoulement dans un canal en l’absence de phase stationnaire sous l’action d’un champ externe et pour lesquelles la théorie a été principalement explorée en profondeur depuis leur création en 1966.
Pourquoi les méthodes FFF ?
Parmi les dizaines de méthodes d’analyses existantes, les méthodes FFF ont de nombreux avantages :
Les systèmes peuvent être fractionnés suivant différentes caractéristiques physicochimiques (exemple : taille et composition)
Il n’y a pas de phase stationnaire donc pas d’interaction avec celle-ci [165]
la force de cisaillement est minimisée [166-169]
Des méthodes de séparation de 1nm à 100μm [167, 170]
des analytes fragiles comme des agrégats de protéines, des assemblages supramoléculaires ou des cellules sont possibles [1, 26, 171, 172]
Des conditions d’analyse sont facilement modifiables et programmables pour des échantillons différents.
La théorie du fractionnement flux force (FFF)
Fractionnement d’écoulement de champ ou fractionnement par couplage flux-force, voilà les deux noms français qu’on entend pour cette méthode méconnue mais prometteuse [173]. Cette théorie fut développée par le professeur Calvin Giddings en 1966 à l’université d’Utah, à Salt Lake City aux États-Unis [174, 175].
Toutes les FFF fonctionnent sur le même principe (Figure I-15). Un solvant est mis en mouvement dans un canal fin (100 à 600μm). Cet écoulement est laminaire c’est-à-dire que la vitesse est maximale au centre du canal et nulle aux parois. Perpendiculairement à cet écoulement, une force est appliquée. Cette dernière va conduire à un positionnement des analytes dans des vecteurs vitesses différents sur la base de critères physico-chimiques (taille, densité, charge…) et dépendant de la nature de la force appliquée (flux d’éluant, force centrifuge, champ électrique…).
Les cas du (Sy)FlFFF et de l’AsFlFFF
La flow FFF est donc une des « sous » techniques de la FFF ; elle se divise à son tour principalement en deux sous techniques, la FlFFF Symétrique et la FlFFF Asymétrique que M.H. Moon appelle respectivement “with stopflow relaxation” et “with focus relaxation”. Comme pour les méthodes FFF, le schéma de base ne varie pas (Figure I-16): le flux reste linéaire et parabolique, dans une cellule en forme d’hexagone allongé [193, 194].
Le flux, dans cette analyse là, sera donc un flux de liquide, le même éluant que celui qui est utilisé horizontalement, avec une vitesse Vc (comme évoqué dans le Tableau I-3 appelé souvent cross-flow ou flux croisé).
Le mur d’accumulation inférieur quant à lui sera constitué d’une membrane souvent en cellulose régénérée, usuellement entre 1 et 20 kDa, une membrane à plus grand seuil de coupure permettant de réduire la pression dans la cellule et donc de pouvoir utiliser des flux plus importants.
La technique de FlFFF se régule donc par le flux linéaire Vx, le flux d’injection Vinj, le flux croisé directement visible dans λ, Vc, et l’épaisseur de la cellule. Tous ces paramètres font de la FlFFF une méthode versatile pouvant analyser des objets entre 1 nm et 50 μm, qu’il s’agisse de nanoparticules, de colloïdes, de protéines ou encore de polymères [195-197].
La méthode de SyFlFFF conventionnelle possède sur la partie supérieure comme sur la partie inferieure un frité de céramique par lequel va passer le flux croisé. On a de plus le flux Vc entrant qui est égal au flux Vc sortant [198, 199] (Figure I-17 a).
Plus tard la méthode a évolué pour remplacer le frité supérieur par un bloc imperméable [194]. De là est né l’Asymmetricel FlFFF (AsFlFFF) [200] (Figure I-17 b). Dans ce cas, le flux croisé est généré par la partie pompée à travers la membrane inférieure du flux et non par un flux venant réellement du dessus, ainsi il va être inégal sur la longueur de la cellule.
Biologie et modèles de culture
Le cas des cancers
En 2012, le nombre de nouveaux cas de cancers en France métropolitaine était estimé à 365 000 (205 000 chez l’homme et 160 000 chez la femme), les taux standardisés d’incidence (population mondiale) sont de 362,6 pour 100 000 personnes par année chez l’homme et 252,0 chez la femme. Le nombre de décès par cancer en France était estimé à 85 000 chez l’homme et 63 000 chez la femme, soit au total 147 800 décès et des taux standardisés respectivement de 133,6 et 73,2 pour 100 000 personnes par année (Tableau I-4).
En termes de mortalité, le cancer du poumon se situe au 1er rang chez l’homme (21 300 décès estimés en 2012) devant le cancer colorectal (9 200 décès) et le cancer de la prostate (8 900 décès).
Le nombre de nouveaux cas de cancers a considérablement augmenté entre 1980 et 2012 chez l’homme comme chez la femme (respectivement +107,6 % et +111,4 %). Cette hausse est en partie due à l’augmentation et au vieillissement de la population, mais aussi au dépistage qui a augmenté, la majorité des cas survenant chez les sujets âgés. Chez l’homme, cette augmentation se décompose ainsi : 30,8 % sont attribués à l’accroissement de la population, 33,7 % à son vieillissement et 43,1 % à l’augmentation du risque lui-même. Chez la femme, ces chiffres sont respectivement de 33,8 %, 22,5 % et 55,1 %. [208].
Et ces taux et risques ne cessent d’augmenter, c’est donc très couramment que le cancer est classifié par les états comme une cause nationale et que de nombreuses recherches sont faites pour tenter d’y remédier. C’est même selon l’OMS l’une des principales causes de mortalité par maladie dans le monde.
De la 2D à la 3D et choix du modèle
La culture cellulaire en deux dimensions reste largement prédominante dans les études de biologie menées dans le cadre de développement de nanovecteurs. Pourtant, les surfaces rigides et plates sur lesquelles adhèrent les cellules sont loin de représenter l’environnement cellulaire trouvé dans un organisme multicellulaire, et ces modèles ne permettent pas de prendre en compte l’architecture tissulaire, ni les régulations biochimiques, ni la communication cellule‐cellule et cellule‐matrice ni même la diffusion intra et inter cellulaire, très importante dans le cadre de vectorisation.
De nombreuses différences sont donc à noter entre le modèle 2D et les modèles 3D, dont les propriétés sont résumées dans le Tableau I-6. L’un des premiers points importants est par exemple l’impossibilité de stroma (réseau conjonctif) sur les cultures 2D qui dans une tumeur du cancer comme celle du sein compte pour plus de 80% du tissu [219]. On peut aussi parler de l’absence totale d’architecture ou leur plasticité exacerbée [220, 221] ou du fait que toutes les cellules (cancers du sang comme premier exemple) ne sont pas capables de croître sur une surface créée.
En opposition, les modèles 3D permettent de passer outre ces problèmes et peuvent même mener à une culture multicellulaire (donnant accès à d’autres informations telles que les interactions entre les cellules ou leur répartition dans le model [222, 223]), à des interactions cellule-cellule et à l’étude de leurs signaux intrinsèques. On sait de plus que les IC 50 des systèmes 3D sont couramment plus élevés que ceux des systèmes 2D [224].
Enfin l’un des points les plus importants dans le cadre des nano-objets reste la diffusion des nano-objets dans les sphéroides. De nombreuses publications ont traité de ce cas [225, 226] et toutes mettent en avant l’importance de la culture 3D que ce soit pour les protéines ou pour les nano-objets.
Objets de type micellaire
Introduction
Comme il a été précédemment indiqué, de nombreux polymères peuvent servir à la fabrication de micelles, et, même si des screenings commencent à être mis en oeuvre [267], l’utilisation d’une large gamme de polymère reste peu répandue dans les études.
Dans notre cas, le choix a été fait de travailler principalement sur quatre micelles qui, étant donné leurs formules respectives, étaient susceptibles d’avoir un comportement différent. Ainsi, dans le but d’encapsuler du Phéo, nous avons travaillé avec différents polymères (Figure II-2) :
Deux polymères de type polyesters ont tout d’abord été choisis, cette famille étant la plus couramment utilisée en nanomédecine pour la propriété de (bio)dégradabilité. Dans ce travail, le poly(oxyde d’éthylène-b--caprolactone) (PEO-PCL), est utilisé avec deux masses molaires différentes de blocs : 2000-2800 et 5000-4000, chaque nombre représentant la masse molaire du bloc concerné. Ce choix avait pour but d’étudier la différence mise en place par la masse molaire du polymère pour une même nature chimique. Le Poly(oxyde d’éthylène-b-D,L-lactide (noté ici PEO-PLA) a été aussi choisi dans la même famille. Comparé à la PCL semi-cristalline, il est amorphe, et sa vitesse de dégradation est plus élevée.
Enfin, le poly(oxyde d’éthylène-b-styrène) (PEO-PS) est utilisé avec une masse molaire faible de 3100-2300 pour permettre une bonne clairance rénale [268] étant donné que le polystyrène n’est pas dégradable par le corps. Le vecteur formé est très intéressant par sa capacité à générer un champ de π-stacking qui pourrait générer une bonne interaction avec le noyau porphyrinique du Phéophorbide.
Tous ces objets ont été fabriqués via la méthode co-solvant détaillée en annexe.
Etude physicochimique usuelle des objets micellaires
Ces objets de petite taille font entre 8 et 30 nanomètres de diamètre (Tableau II-1)(Photos TEM et DLS en Annexe) quelle que soit la méthode d’analyse utilisée et ont une bonne stabilité de mesure en fonction des méthodes. Ainsi on retrouve classiquement des objets plus petits en analyse TEM à cause du séchage inhérent à la méthode, et, pour la DLS, plus grands lors des analyses en intensité que celles en nombre, phénomène bien connu dû àl’influence de l’intensité de diffusion. Les potentiels zeta quant à eux sont globalement neutres ou très légèrement négatifs, ce qui est expliqué par la présence éventuelle de groupements carboxyliques après hydrolyse partielle des esters.
Polymèresomes
Introduction
Les principaux polymères choisis pour cette étude sont présentés dans le Tableau II-5. Deux types ont été choisis. Le premier est, comme dans le cas des micelles, le poly (oxyde d’éthylène-b-ε-caprolactone) (PEO-PCL) pour sa pertinence relative à l’application visées. Dans cette famille, plusieurs masses molaires ont été examinées, dans le but d’obtenir des polymèresomes de différentes tailles. Ils ont été choisis de manière à avoir un changement de la balance hydrophile/hydrophobe en gardant à l’esprit la règle suggérant que les polymèresomes devraient être obtenus avec une fraction de masse hydrophile préférable près de 35% [267].
L’autre type de polymère qui a été testé est le poly (oxyde d’éthylène-b-méthacrylate de méthyle) (PEO-PMMA) afin d’évaluer l’influence de la structure chimique du vecteur. Un commentaire est nécessaire pour ce polymère. Celui-ci a été acheté, comme tous les autres, à Polymer Source. Il a été inclus dans cette étude car des tests préliminaires avaient montré qu’il conduisait facilement à des assemblages de taille supérieure à 100 nm que l’on supposait être des vésicules. Le contrôle de ce polymère a toutefois montré que la masse molaire annoncée par le fournisseur était complètement fausse, nos mesures (SEC et RMN 1H) évaluant sa composition plutôt vers 1400-5600. Les analyses ont de plus révélé que ce polymère n’était pas pur et comportait une quantité non négligeable d’une entité non identifiable (protons aromatiques entre autres). Les expériences faites avec ce polymère doivent donc être prises avec précaution et nous ont surtout permis de développer les méthodes de caractérisation des objets vésiculaires et de comparer différents systèmes entre eux.
En fonction du polymère et des masses molaires, différentes méthodes de préparation ont été utilisées. La première est basée sur des techniques de formation de liposome et utilise une réhydratation du film de polymère, puis traitement aux ultrasons et extrusion.
Pour PEOPCL 5000-32000, cette méthode ne conduit qu’à des nano-objets peu stables et n’a donc pas été utilisée. Une alternative a été préférée selon une procédure décrite par Sachl et alii [273] (décrite dans la partie matériel et méthode).
Enfin, dans le cas de PEO-PMMA 1400-5600, l’extrusion s’est avérée impossible, les objets étant incapables de passer à travers le filtre. Cela a été attribué à la forte résistance mécanique de la base de PMMA (température de transition vitreuse à 105 ° C), par rapport à la polycaprolactone (température de transition vitreuse à -60 ° C). Dans ce cas, un procédé de nano-précipitation a été utilisé avec de l’acétone comme co-solvant (cf méthodologie).
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Table des matières
Introduction Générale
I. Bibliographie
1. La thérapie photo-dynamique (PDT)
a. Principe
b. PDT et oxygène singulet
c. Les photosensibilisateurs utilisés en PDT
d. Encapsulation des Photosensibilisateur
e. Conclusion
2. Objets auto-assemblés
a. Un domaine fortement utilisé pour la nanomédecine
b. Ciblage
c. Des nanovecteurs polymères
d. Les assemblages amphiphiles
e. Les assemblages poly-ioniques
f. Réticulation d’objet
g. Synthèse des Nano-objets polymères
h. Conclusion
3. Caractérisations usuelles des nano-vecteurs polymères
a. Diffusions statique (SLS) et dynamique (DLS) de la lumière
b. Potentiel Zéta
4. Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AsFlFFF)
a. Pourquoi les méthodes FFF ?
b. La théorie du fractionnement flux force (FFF)
c. Différentes FFF
d. Les cas du (Sy)FlFFF et de l’AsFlFFF
e. Le cas du Frit inlet
f. Conclusion
5. Biologie et modèles de culture
a. Le cas des cancers
b. Différentes lignées cellulaires
c. De la 2D à la 3D et choix du modèle
d. Le Modèle Sphéroïde
e. Analyse des sphéroïdes
f. Conclusion
6. Cadre de l’étude
a. Philosophie
b. Outils
c. Introduction au développement
II. Des vecteurs hydrophobe-hydrophile
1. Introduction
2. Objets de type micellaire
a. Introduction
b. Etude physicochimique usuelle des objets micellaires
c. Analyse DLS/SLS
d. Stabilité dans le temps et délivrance
e. Effet biologique
3. Polymèresomes
a. Introduction
b. Analyse TEM et AFM
c. Analyse DLS/SLS
d. Analyse AsFlFFF
e. Comparaison des méthodes
f. Effet biologique en PDT
4. Conclusion générale
III. Réticulation
1. Introduction
2. Formation des micelles réticulées
3. Analyse des objets
a. Analyse physico-chimique
b. Analyse de stabilité et relargage
4. Comportement biologique
c. En culture 2D
d. En culture 3D ou sphéroïdes
5. Conclusion
IV. Mélanges
1. Introduction
2. Analyse DLS
3. Analyse par AsFlFFF
4. Analyses biologiques et efficacité PDT
5. Conclusion
V. PICs
1. Introduction
2. Analyses classiques et leurs limites
3. Analyse Frit-SyFlFFF à Golden
4. Analyse FI-AsFlFFF à Purpan
a. Recouvrement et différents PICs
b. Caractérisation en présence de Sel
c. Assemblage des PICs en fonction du ratio
d. Etudes FI-AsFlFFF des différentes charges dans les PICs PAPTAC-PNIPAM
5. Etude biologique
6. Conclusion
Conclusion générale
Annexes
Perspectives et ouverture sur une autre thèse
a. Présentation
b. Interactions avec les GUV et effet d’une illumination
c. Effet du vecteur
d. Conclusion
Matériel et méthode :
Produits chimiques
Fonctionnalisation acrylate
Préparation de micelles polymères par addition de solvant
Préparation d’auto-assemblages polymères par réhydratation de film
Réticulations
Chargement des micelles avec Phéo
Expériences de dialyse
Formation des PICs
Suivi de Dialyse PICs en solutions salines
Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
Microscopie électronique à transmission (TEM)
Fractionnement Flux Force (FFF)
Asymetric Flow Field-Flow Fractionnation (AsFlFFF)
Méthode : micelles de 5 à 30nm
Méthode : Polymersomes allongés type PEO-PCL 2000-7000
Méthode : Mélange de micelles et de polymersomes PEO-PCL 5000-11000
Méthode : Polymersomes complexes PEO-PCL 2000-4800
Frit Inlet Symmetrical FFlF (FI-FlFF)
Frit-Inlet (FI) AsFlFFF
Biologie
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