ETUDE DU PROFIL DE MUTATION ASSOCIÉE À LA RÉSISTANCE À LA RIFAMPICINE ET À L’ISONIAZIDE DES SOUCHES DE M.TUBERCULOSIS À HÔPITAL MILITAIRE DE OUAKAM

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Caractères biochimiques

Des activités enzymatiques sont retrouvées pour chaque espèce, servant de base aux tests biochimiques. M.tuberculosis a une activité catalasique thermolabile, une activité nitrate réductase et accumule de l’acide nicotinique, ce qui peut être révélé par l’épreuve à la niacine ou test de Konno.
Ces trois caractéristiques sont les trois propriétés biochimiques spécifiques de cette espèce. L’ensemble des produits du métabolisme azoté, carboné est présent, mais la particularité de M. tuberculosis est qu’elle possède plus de 250 enzymes impliquées dans le métabolisme lipidique. Ces enzymes représentent de potentielles cibles thérapeutiques pour le futur développement d’antibiotiques antituberculeux (Christopher M et al 2003).

Métabolisme

M. tuberculosis a le potentiel de synthétiser tous les acides aminés qui lui sont essentiels, des vitamines et des enzymes, bien que quelques-unes des voies impliquées peuvent différer de ceux trouvés dans d’autres bactéries (Christopher M et al 2003).
M. tuberculosis peut métaboliser une variété d’hydrates de carbone, les alcools, les cétones et les acides carboxyliques. Les enzymes nécessaires pour la glycolyse, la voie des pentoses phosphates et l’acide tricarboxylique et des cycles glyoxylate sont tous présents. (Cole ST et al 1998)

Caractères génétiques :

Le génome

La séquence complète du génome de M.tuberculosis H37Rv a été publiée en 1998 par Steward Cole. Le génome a une longueur de 4.411.529 bp, contient environ 4000 gènes, et a une teneur très élevée en GC environ 65% (Cole ST et al. 1998).
Il comprend un nombre important de séquences de désoxyribonucléiques (ADN) répétitifs, parmi les quelles sont retrouvées les séquences d’insertion.
Les séquences d’insertion (IS6110, IS1081) sont utilisées dans les techniques de génotypage moléculaire des isolats cliniques de M. tuberculosis, et représentent le principal élément de variabilité entre les souches.
Un nombre de 3924 cadres de lecture ouverts ont été identifiés dans le génome. Ce qui représente 91% de la capacité de codage potentiel. Au moins deux prophages ont été détectés dans la séquence du génome de M.tuberculosis. Les Prophages phiRv1 et phiRv2 ont de 10 kb de longueur et sont organisés de manière similaire (Cole st et al 1998).
Le cercle extérieur indique l’échelle en Mo, 0 représentant l’origine de réplication. Le premier anneau de l’extérieure présente les positions des gènes de l’ARN stables (ARNt sont bleus, d’autres sont de couleur rose) et la région de répétition directe (cube rose).
Le second anneau montre l’intérieur de la séquence codante par mèche (dans le sens horaire, vert foncé ; le sens antihoraire, vert clair).Le troisième anneau représente ADN répétitif (des séquences d’insertion, orange ; 13E12 famille REP, rose foncé ; prophage, bleu). Le quatrième anneau montre les positions des membres de la famille de PPE (vert).
Une des particularités de M. tuberculosis est qu’il possède tout le matériel génétique nécessaire à sa survie en absence d’oxygène, d’où la persistance de cette bactérie chez l’hôte au sein des lésions granulomateuses (Christopher Met al 2003).

La diversité génétique et la phylogénie de M.tuberculosis :

La diversité génétique de M. tuberculosis est un caractère utilisé pour les études épidémiologiques, comme la transmission, la réinfection et la réactivation permettant de déchiffrer l’évolution de M. tuberculosis.
La variabilité génétique peut être traduit en phénotype différent, telles que la capacité de transmission, la virulence et la pathogénicité qui peut avoir des conséquences épidémiologiques diverses (Smith et al.2009).
En plus de la capacité de transmission, il est aussi actuellement accepté que génétiquement différentes les souches de M. tuberculosis produisent nettement des événements immuno-pathologiques différents. Dans une étude menée chez des patients vietnamiens, une association entre les lignées Euro-Americaines de M. tuberculosis et une tuberculose pulmonaire a été observée plutôt qu’une tuberculose méningée. Ceci suggère que ces souches sont moins capables d’une diffusion extra-pulmonaire que les autres souches de la population d’étude (Caws et al. 2008).

Pathogénecité :

Une fois dans l’organisme, M. tuberculosis ne produit pas de toxine, elle infecte les macrophages de l’hôte.
Il est intéressant de noter que les MCTB ont la même stratégie d’infection de l’hôte en survivant et se multipliant au sein des macrophages. Après la phagocytose, les MCTB inhibent l’acidification et la fusion entre le phagosome et lysosome ce qui leur permet de prospérer à l’intérieur du phagosome. M. tuberculosis survit dans le macrophage grâce à un système de détoxification de radicaux libres et de chélation du fer.
Ce système implique les gènes katG codant pour la catalase peroxydase, le gène furA codant pour une protéine de captation du fer et le gène sodA codant pour la superoxyde dismutase. (Pym AS et al 2001)
D’autre part, M. tuberculosis survie dans le macrophage grâce à son enveloppe cellulaire. Des voies de biosynthèses spécifiques sont impliquées dans la formation de cette enveloppe cellulaire comme celle de l’acide mycolique. La synthèse des acides mycoliques est souvent liée à des gènes déterminants dans la virulence comme fbpA, mmaA4.
Les acides mycoliques jouent un rôle important dans la protection par l’enveloppe cellulaire chez M. tuberculosis. Ils assurent l’intégrité de l’enveloppe et protègent le bacille contre le stress oxydatifs généré par le phagosome (Sirakova TD et al 2003).
La croissance intracellulaire est un moyen efficace d’échapper au système immunitaire. Une fois M.tuberculosis est phagocyté, il peut inhiber la fusion phagosome-lysosome par modification de la membrane du phagosome. Il peut rester dans le phagosome ou échapper au phagosome, dans les deux cas, M.tuberculosis trouve un environnement favorable pour sa croissance dans le macrophage (Natarajan K et al 2011).
Les MCTB interfèrent avec les effets toxiques des réactifs intermédiaires de l’oxygène produits dans le procédé de la phagocytose par trois mécanismes :
1. Les glycolipides, les LAM régulent à la baisse le mécanisme oxydatif cytotoxique.
2. Absorption par les macrophages via les récepteurs du complément
3. Le burs oxydatif peut être contrecarré par la production de catalase et de superoxyde dismutase.

Physiopathologie de l’infection tuberculeuse :

Symptômes :

Les signes cliniques de la maladie sont dominés par une toux persistante notamment pendant des semaines. Elle peut être productive ou non.
Les douleurs thoraciques sont parfois notées. L’altération de l’état général est fréquente lors de la tuberculose. L’asthénie peut persister tout au long du traitement. Une perte de poids qui peut, dans les formes graves, dépasser 10 kg.
La fièvre est généralement peu élevée avec des frissons dans les formes sévères et des sueurs nocturnes.

Transmission :

M. tuberculosis est très contagieux, sa transmission est toujours directe, d’un individu infecté à une personne saine. La transmission de la tuberculose est essentiellement aérienne à l’exception de M. bovis qui peut être transmis par ingestion de produits laitiers contaminés. Lorsque le malade souffrant d’une tuberculose pulmonaire tousse, parle ou éternue, il émet des microgouttelettes de mucus ou gouttelettes de Flugge qui contiennent des bacilles tuberculeux. Les gouttelettes infectieuses restent en suspension dans l’air et la contamination se fait lors par inhalation des particules infectieuses. Ce qui explique qu’environ 80% des cas de TB sont des formes pulmonaires (Pfyffer, G. E et al 2007).
Les gouttelettes ne sont pas éliminées par le tapis muco-ciliaire et traversent l’appareil respiratoire, les bacilles atteignent ainsi l’alvéole pulmonaire où ils seront phagocytés par les macrophages alvéolaires (fig 10).
Les patients au stade de primo-infection ne sont pas contagieux et une personne exposée à un patient tuberculeux n’est pas forcement contaminée. La transmission dépend de trois facteurs :
 le statut bactériologique du malade
Les patients ayant une tuberculose pulmonaire à microscopie positive (TBM+) sont les plus contagieuses.
 la virulence du bacille tuberculeux Certaines souches sont nettement plus contagieuses
 l’environnement dans lequel a lieu l’exposition et la duré.
La proximité entre l’entourage et le malade favorise la transmission de la maladie. Ainsi personnes en contact étroit avec les patients tuberculeux sont les plus a risque d’être infectées. Le plein air et l’ensoleillement sont des conditions dans lesquelles la transmission est moins susceptible de se produire.

Immuno-pathologie de la tuberculose

La tuberculose latente

C’est l’ensemble des manifestations anatomiques, cliniques et biologiques présentés par un organisme après le premier contact infectant avec le BK. Dans la minorité des cas, au cours de l’infection les bacilles atteignent les alvéoles pulmonaires. Ils entrent en contact avec les macrophages alvéolaires qui les phagocytent d’abord, les dégradent puis les éliminent.
Cependant, il arrive que des bacilles survivent dans les macrophages et s’y multiplient si les défenses immunitaires de l’individu sont réduites.
Les macrophages colonisés finissent par éclater et libérer un grand nombre de bacilles capables d’infecter, à leur tour, d’autres macrophages. Ainsi, un foyer infectieux se développe au niveau du poumon et provoque la formation d’une lésion ou « chancre d’inoculation ». (Flei Lui et al, 2014).

La tuberculose active :

Généralement, l’infection par M. tuberculosis est contenue initialement par les défenses de l’hôte, et l’infection reste latente. Cependant, l’infection latente a le potentiel de se développer en maladie active à tout moment.

Réponse immunitaire innée

M.tuberculosis a des mécanismes spéciaux pour l’entrée dans les cellules hôtes (Raja A. et al ,2004).
Dans les alvéoles pulmonaires, M. tuberculosis est principalement reconnu et phagocyté par les macrophages alvéolaires. Plusieurs classes de récepteurs de reconnaissance de forme pattern recognition receptors (PPR) sont impliquées dans la reconnaissance de M. tuberculosis.
Il s’agit des Toll-like récepteurs (TLR), des récepteurs de type C lectine (PLC), des récepteurs de Nod-like (NLR).
Parmi les TLR, on a TLR1, TLR2, TLR4 et TLR6 et leur molécule adaptatrice Myéloid différenciation protein 88 (MyD88) qui jouent un rôle important dans le déclenchement de la réponse immunitaire contre la tuberculose. La reconnaissance par les TLR est cruciale pour l’initiation et la coordination de la réponse immunitaire innée (Schreiber T et al.2009). Les récepteurs TLR ont des voies de signalisation différentes selon le recepteur engagé. Une première dépendant de MyD88 et une seconde voie indépendante de MyD88 (fig 11). Par exemple le TLR2 signale uniquement par la voie utilisant l’adaptateur MyD88, alors que le TLR4 a la fois par la voie MyD88 et par une voie indépendante de MyD88. Pour la voie MyD88, TLR4 utilise des adaptateurs(TIRAP) qui vont recruter des kinases (IRAK1, 4). Ensuite il ya phosphorylation de ces kinases, ce qui aboutit à la phosphorylation et a la dégradation de l’hinibiteur IKB, puis à la libération et à la translocation du facteur de transcription NFKB. Cela conduit à l’expréssion des gènes qui codent pour des citokines (TNF, IL-12) fig 11.

Réponse immunitaire adaptative

Les lymphocytes T reconnaissent les antigènes mycobactériens portés par des cellules présentatrices, telles que les cellules dendritiques. Les peptides antigéniques sont présentés par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de type I et II, tandis que les antigènes lipidiques sont présentés par les molécules de type CD1. Les lymphocytes T CD4, reconnaissant les antigènes présentés par les molécules du CMHII que l’on retrouve au niveau des vacuoles, des phagosomes et des vésicules endocytiques.
Les CD4 sont donc les principaux lymphocytes activés lors de l’infection par M.tuberculosis. Les lymphocytes T CD8 reconnaissent les antigènes présentés par les molécules du CMHI, qui se forment dans le réticulum endoplasmique des cellules, et les lipides présentés par les molécules CD1.
Les cellules présentatrices d’antigènes deviennent apoptiques, et libèrent des vésicules issues de la membrane plasmique. Les lymphocytes T ainsi activés subissent alors une expansion clonale, se différencient en cellules effectrices et migrent vers le site de l’infection. Elles sont guidées par des gradients de chimiokines. Les lymphocytes produisent de l’IFNγ, qui active les propriétés bactéricides des macrophages, du TNFα qui joue un rôle primordial dans la formation du granulome, et des perforines et granzymes qui provoquent la lyse des cellules et la destruction des bactéries intracellulaires ( Hossain MM et al 2013).
Le recrutement successif de neutrophiles, lymphocytes NK, T CD4, T CD8 correspond au début de la formation du granulome. Le granulome caséeux, restreint l’infection efficacement, et évolue en excluant les lymphocytes du centre qui se regroupent en anneau autour des macrophages. On a des cellules épithélioïdes qui sont des macrophages activés qui sécrètent des cytokines et des enzymes, des macrophages différenciés en cellules géantes multinuclées ou cellules de Langhans, qui correspondent à la fusion de cellules épithélioïdes et des macrophages qui sont chargés de vacuoles lipidiques qui sont au bord du foyer de la nécrose caséeuse ( fig 12).
Au centre, M. tuberculosis est soumis à l’hypoxie et la privation en nutriments. (Smith et al, 2009). Il entre alors dans un état de dormance avec une activité métabolique faible et un taux de croissance quasiment nul. L’infection est alors contenue. (Peyron et al. 2008) (fig12).

Diagnostic

Deux composantes essentielles de la lutte contre la tuberculose sont l’identification rapide des nouveaux cas et la mise en œuvre rapide d’un traitement efficace pour interrompre la chaine de transmission. Le diagnostic de la tuberculose peut être réalisé par différents techniques selon la spécialité.

Diagnostic immunologique

Le diagnostic immunologique de la tuberculose est basé sur le principe antigène anticorps.Deux tests sont disponibles pour le diagnostic immunologique : le test cutané à la tuberculine (TCT) et le test de dosage de l’interféron gamma (IGRA).
Ces tests indiquent si une réponse immunitaire à médiation cellulaire est développée par l’hôte. Ainsi on peut savoir s’il ya eu exposition à M. tuberculosis ou non.

l’intradermoréaction (IDR)

Il consiste en l’injection intradermique d’un volume de 0,1ml de tuberculine, dérivé protéinique purifié (PPD), obtenu à partir d’un surnageant de culture de M.tuberculosis. La tuberculine contient plusieurs antigènes communs à de nombreuses espèces mycobactériennes dont M. bovis utilisé pour le vaccin B.C.G et toutes les mycobactéries environnementales ou non tuberculeuses.
Ce test mesure la réponse in vivo de l’hypersensibilité à médiation cellulaire de type retardé (type IV de la classification de Gell et Coombs), après injection intradermique de tuberculine. C’est une réaction inflammatoire locale tardive, de durée prolongée et caractérisée par la migration des cellules immunocompétentes vers les tissus contenant l’antigène : dans les heures suivant l’injection, il se produit un afflux de monocytes-macrophages, la formation de cellules géantes multinucléées et l’afflux d’un grand nombre de lymphocytes T CD4 mémoires spécifiques de la tuberculine.
Chez une personne qui bénéficie d’une immunité à médiation cellulaire contre ces antigènes tuberculiniques, une réaction d’hypersensibilité de type retardé aura lieu dans 48 à 72 h. La réaction causera induration de la peau au site d’injection localisée, et le diamètre transversal est mesuré en millimètres (MadhukarPaiet al. 2014)
Il est important de noter que l’immunité à médiation cellulaire à la tuberculine peut parfois refléter une exposition à M. bovis bacille de Calmette-Guérin (BCG) ou d’une infection précédente qui a été effacé ( MadhukarPaiet al. 2014 ; Tissot Fet al 2005) .

Les tests de détection de l’IFN γ

La réponse cellulaire est la composante majeure de la réponse immunitaire à l’égard de M. tuberculosis. L’IFN γ est produit suite à une stimulation antigénique in vitro de lymphocytes T contenus dans un prélèvement sanguin. L’induction d’une réponse protectrice se traduit par la synthèse de cytokines de type TH1, notamment d’interféron gamma (IFN γ).
Les tests de libération de l’interféron-gamma (IGRA) sont des analyses de sang in vitro de la réponse immunitaire à médiation cellulaire ; ils mesurent la libération par les cellules T de l’interféron (IFN) gamma après stimulation par des antigènes uniques à M. tuberculosis. (Marie-Thérèse Giorgio et al 2015)
Deux test kits sont commercialisés, le test QuantiFERON-TB Gold In-Tube® (Cellestis Limited, Carnegie, Australie) et le T-SPOT-TB assay® (Oxford Immunotec Ltd, Abington, Royaume-Uni). Les deux tests utilisent les antigènes ESAT-6(EarlySecretionAntigen Target 6) et CFP-10(CultureFiltrateProtein 10), codés par la région RD1 du génome de M.tuberculosis absente chez M. bovis et chez les mycobactéries atypiques.
Le QuantiFERON utilise en plus l’antigène TB7.7 (Pai M et al. 2004).
 Test QuantiFERON-TB ®
Le test QuantiFERON-TB ® est un système de dosage sur sang total qui permet de mesurer la libération d’interféron-gamma par ELISA dans le sang en réponse à une stimulation par l’ESAT-6 et CFP-10 qui ne sont pas présents dans les souches vaccinales BCG ou la grande majorité des mycobactéries non tuberculeux.
Le sang est prélevé sur tube hépariné. Les cellules mononucléées du sang périphérique sont incubées avec des protéines de M. tuberculosis. Après incubation pendant la nuit puis centrifugation, le plasma est décanté. L’IFN γ sécrété est quantifié par technique immuno-enzymatique (ELISA).Le résultat est donné en pg/ml d’IFNγ. Le résultat est rendu de façon qualitative : positif, négatif ou indéterminé.
 Test T-SPOT.TB
Dans le test T-SPOT.TB, les cellules T activées par les antigènes ESAT-6 et CFP spécifiques de M. tuberculosis sont mises en utilisant la méthodologie ELISPOT (Enzyme-LinkedImmunospot).
Le test cutané tuberculinique (TCT) et les IGRA (Interferon-Gamma Release Assays) sont actuellement les seuls moyens d’identifier les infections latentes par M. tuberculosis. Au contraire des IGRA, la spécificité du TST est grandement affectée par une vaccination antérieure avec la souche atténuée de M. bovis (vaccin BCG). Par ailleurs, il existe des preuves suggérant que la sensibilité des IGRA est supérieure à celle du TCT, notamment dans la détection de la tuberculose latente chez les individus immunodéprimés (Moran-Mendoza O, et al 2007).
Cependant, ni le TCT ni les IGRA ne permettent de différencier une tuberculose latente d’une tuberculose active. En outre, il n’existe pour l’heure aucun test capable d’identifier si les mycobactéries présentes chez un individu infecté de manière latente sont des germes vivants ou morts et, de détecter qui est à risque de développer une tuberculose active (Pai M et al 2004).

Diagnostic bactériologique

Le diagnostic bactériologique de la tuberculose maladie repose sur la mise en évidence des bacilles de la tuberculose, à savoir M. tuberculosis, M. bovis ou M. africanum, ces 3 espèces sont réunies sous le nom de « complexe tuberculosis».
Les méthodes bactériologiques à mettre en œuvre comprennent la recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) par l’examen microscopique, la mise en culture sur milieux spécifiques.

Examen microscopique

L’examen microscopique du produit pathologique est l’étape initiale, et souvent la seule possibilité dans nos pays en développement, pour effectuer le diagnostic bactériologique de la tuberculose. La qualité de l’examen bactériologique dépend avant tout de la qualité du prélèvement, qui doit être une expectoration en cas de TB pulmonaire ou un tubage gastrique permettant de récupérer les sécrétions bronchiques ingérés durant le sommeil, ou une aspiration bronchique par endoscopie. En cas de TB extra-pulmonaire, les biopsies doivent être privilégiées et envoyées sans produit fixant pour une mise en culture (C. Truffotet al. 2011).
Pour mettre en évidence les bacilles de la tuberculose à l’examen microscopique, on utilise la propriété d’acido-alcoolo-résistance des mycobactéries, après coloration.
L’examen microscopique met donc en évidence des bacilles acido-alcoolo résistants (BAAR) sans faire la distinction entre les MCTB et mycobactéries atypiques. L’examen microscopique est peu sensible. Il n’est positif que lorsque la concentration bacillaire est au moins égale à 103 à 104/mL de produit soumis à l’examen. (Mase S.R et al. 2007)
La probabilité de mettre en évidence des mycobactéries dépend de la qualité et de la répétition des prélèvements ainsi que de leur transport jusqu’au laboratoire de bactériologie.
Deux méthodes de coloration sont applicables en routine, la méthode de Ziehl-Neelsen et la méthode fluorescente avec l’auramine.
 Coloration Ziehl-Neelsen :
Avec la méthode de Ziehl-Neelsen, les frottis sont colorés par la fuchsine phéniquée à chaud, puis, après décoloration par l’acide et l’alcool, contre colorés par le bleu de méthylène. Au microscope optique avec un objectif à immersion (× 100) les bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) apparaissent comme des bâtonnets rouges sur fond bleu.
 Coloration à l’auramine :
Avec la méthode fluorescente, la fuchsine est remplacée par l’auramine, et au microscope à fluorescence sous lumière bleue, les BAAR apparaissent comme des bâtonnets jaunes-verts brillants sur fond sombre.
Nous développerons ce chapitre dans la deuxième partie de notre travail.
Le résultat de l’examen microscopique est exprimé quantitativement : 1 à 9 BAAR pour 100 champs microscopiques, 10 à 99 pour 100 champs,1 à 10 BAAR dans au moins 50 champs et plus de 10 BAAR par champ dans au moins 20 champs.
Malgré ces faiblesses, l’examen microscopique est essentiel car il permet de faire, en quelques heures seulement, un diagnostic très probable des formes de tuberculose les plus contagieuses et donc de prendre très rapidement les mesures de prévention adéquates pour l’entourage.

Culture

La culture permet de faire l’identification de la mycobactérie isolée et de mesurer sa sensibilité aux antituberculeux. Elle est deux fois plus sensible que l’examen microscopique. Elle nécessite des milieux spécifiques, solides, de type Löwenstein-Jensen à base d’oeufs, ou des milieux liquides qui peuvent être automatisables de type MGIT, Bact/Alert MP.
Sur milieu solide, les colonies sont détectées en 3 à 4 semaines. Avec les milieux de culture liquides (milieu MGIT utilisé manuellement ou au sein de l’automate Bactec 960, Becton Dickinson, milieu Bact/Alert MP de l’automate Bact Alert3D BioMérieux), la détection de la multiplication bactérienne se fait au bout d’une semaine en moyenne.
La détection de la multiplication bactérienne est basée sur divers principes physicochimiques dont la consommation d’oxygène qui fait apparaître une fluorescence à partir d’un composé fixé au fond du tube, le métabolisme bactérien qui produit une acidification du milieu avec virage de l’indicateur coloré.
La culture permet de faire l’identification des mycobactéries isolées et de procéder aux tests de sensibilité aux antibiotiques.

Diagnostic moléculaire

Avec les techniques de biologie moléculaire, le diagnostic de la tuberculose peut se faire par : amplification génique (PCR) permettant la détection de séquences nucléiques spécifiques et par hybridation de l’ADN tuberculeux sur des sondes spécifiques (Kim et al.2009)

L’amplification génique

Les tests d’amplification génique (TAG) ont pour finalité d’augmenter le nombre de copies d’un segment cible d’ADN de manière à permettre sa détection. Ce sont des tests puissants dont le seuil théorique de sensibilité est d’une molécule d’ADN ou d’ARN. Ce sont de plus des tests rapides appliqués au diagnostic de la tuberculose. Ils permettent donc théoriquement de détecter rapidement la présence de bacilles du complexe M. tuberculosis dans les prélèvements en cas d’examen microscopique négatif et par conséquent de pallier la lenteur de la culture. La première technique d’amplification employée consistait en une réaction simple de polymérisation en chaîne (PCR) de la séquence d’insertion IS6110 avec détection du fragment amplifié sur gel d’agarose. Elle a été vite remplacée par des techniques standardisées, utilisant des réactifs prêts à l’emploi et basées sur diverses cibles et divers procédés d’amplification : amplification par PCR d’une séquence d’ADN codant l’ARN 16S des mycobactéries (Amplicor, Roche), amplification d’une séquence d’ARN ribosomal via un intermédiaire ADN (AMTDT, Gen Probe) ou encore amplification par déplacement de brin (BD Probe tec, Becton Dickinson).
Aujourd’hui, ces techniques sont devancées par l’automatisation, avec le Cobas Amplicor (Cobas Amplicor MTB Test) et la PCR temps réel. Mais le matériel requis, est sophistiqué très coûteux et n’est pas accessible à tous les laboratoires surtout dans nos pays en développement (Minion J et al. 2009).
 Le GeneXpert MTB / RIF :
Ce test est conçu pour être utilisé sur des échantillons provenant de patients avec des signes évocateurs d’une tuberculose et sans traitement tuberculeux.
Le GeneXpert MTB / RIF dosage (Cepheid, Sunnydale, CA), détecte simultanément la présence des bactéries du complexe tuberculosis et la résistance à la rifampicine directement à partir de spécimens respiratoires. Le test est une PCR semi-quantitative, niché, en temps réel conçu pour amplifier un segment de 192pb du gène rpoB en utilisant cinq sondes. Des travaux ont démontré que le test Xpert MTB affiche des pourcentages élevés de sensibilité et de spécificité pour la détection des Mycobactéries du complexe tuberculosis, en particulier dans les échantillons respiratoires à frottis positif (Catharina C. Boehme et al, 2010). Les sensibilités précédemment rapportés pour les spécimens pulmonaires à frottis positif vont de 95% à 100%.(Miller MB et al, 2011).
La sensibilité au niveau des spécimens pulmonaires à frottis négatif varient entre 55% et 75% (Marlowe E. M. et al. 2011 ; Theron G. et al. 2011).
Ce test est conçu pour être utilisé sur des échantillons provenant de patients avec des signes évocateurs d’une tuberculose et sans traitement tuberculeux (Theron G et al. 2011)

Les tests d’hybridation :

La technique d’hybridation sur bandelettes est simple à mettre en œuvre avec du matériel qui n’est pas très sophistiqué outre que le matériel d’extraction, il faut un thermocycleur et un incubateur. Elle est effectuée en quelques heures seulement (6h). Elle peut être appliquée directement aux échantillons lorsqu’ils sont riches en bacilles acido-alcoolo-résistants avec un resultat de 1 à 3+ à l’examen microscopique.
On peut alors identifier les bacilles vus au microscope comme appartenant au complexe M. tuberculosis et détecter la présence de mutations conférant la résistance à la rifampicine et à l’isoniazide dans les 48 heures qui suivent le prélèvement, ce qui est capital pour la prise en charge des malades.
L’hybridation sur bandelettes consiste à amplifier un fragment de gène, et à l’hybrider sur des sondes fixées sur une bandelette.
Les hybrides sont révélés par l’apparition d’une coloration. Deux bandelettes sont disponibles dans le commerce, la bandelette INNO-LiPARif.TB® (Innogenetics) et la bandelette GenoType®MTBDRplus (Hain Science) (Zhang Y et al 2009).
Le test GenoType®MTBDRplus permet l’identification du complexe M. tuberculosis et les résistances à la rifampicine et/ou à l’isoniazide à partir d’une culture ou de prélèvements pulmonaires présentant un examen direct positif. L’identification de la résistance à la rifampicine est réalisée par la détection des principales mutations au niveau du gène rpoB qui code pour la sous unité ß de l’ARN polymérase.
L’identification de résistances de haut niveau à l’isoniazide est réalisée à travers l’analyse du gène katG qui code pour la péroxydase-catalase. L’identification de résistances de bas niveau à l’isoniazide est réalisée à travers l’analyse du promoteur du gène inhA qui code pour la NADH enoyl ACP reductase (Gupta R et al 2015).
Le test GenoType®MTBDRsl permet de détecter les résistances aux fluoroquinolones et ou aux aminoglycosides et ou à l’éthambutol à partir d’une culture. Le test détecte les mutations dans les gyrA, RRS et les gènes embB et, par conséquent, la résistance aux fluoroquinolones (FQ), l’amikacine (AM)/capréomycine (CM), et l’éthambutol (EMB) (Michael Felkelet al. 2013).

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
Chapitre I : La tuberculose
I.1 Définition
I.2 Histoire de la tuberculose
II Epidémiologie de la TB
III Les Mycobactéries
IV- Physiopathologie de l’infection tuberculeuse :
V Diagnostic
VI-Traitement
VII La résistance aux antituberculeux
DEUXIÈME PARTIE : ETUDE DU PROFIL DE MUTATION ASSOCIÉE À LA RÉSISTANCE À LA RIFAMPICINE ET À L’ISONIAZIDE DES SOUCHES DE M.TUBERCULOSIS À HÔPITAL MILITAIRE DE OUAKAM
I-Contexte
II Objectifs
III Méthodologie
IV- Résultats
V- Discussion
CONCLUSION
REFERENCES

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