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Biosynthèse des ARNt
La biosynthèse d’un ARNt est un processus complexe, qui implique plusieurs étapes (Phizicky and Hopper, 2010). Les ARNt sont synthétisés dans la cellule à partir de séquences codantes de l’ADN sous forme de transcrits primaires (pré-ARNt), par une ARN polymérase. Ces précurseurs subissent ensuite une maturation importante, pour former l’ARNt fonctionnel. Lors de la maturation, l’extrémité 5’ est clivée par la ribonucléase P (RNase P) et l’extrémité 3’ par des endoribonucléases (RNase Z) ou des exonucléases universelle (Vogel et al., 2005; Walker and Engelke, 2006; Wellner et al., 2018). Puis dans le cas des eucaryotes et archées, la séquence CCA nécessaire à l’aminoacylation est ajoutée par une ARNt nucléotidyltransférase, qui utilise des molécules de CTP et ATP comme substrats (Xiong and Steitz, 2006).
La maturation des ARNt inclut aussi la modification chimique de bases ou du ribose et l’épissage d’introns dans certains ARNt d’eucaryotes ou d’archées (Marck, 2003; Yoshihisa et al., 2003). Sur 272 gènes d’ARNt chez la levure, 59 présentent des séquences introniques d’une taille comprise entre 14 et 60 nucléotides. Ces introns sont très souvent situés au niveau de la boucle de l’anticodon, entre les nucléotides 37 et 38, mais chez les archées, ils peuvent être aussi présents dans la boucle D. Leur excision est alors assurée par trois enzymes : une endoribonucléase, une ARNt ligase et une 2’phosphatase NAD-dépendante (Abelson et al., 1998). L’excision d’introns a lieu le plus souvent au niveau du noyau. Cependant, chez la levure, l’activité ARNt endonucléase a été détectée au niveau de la membrane externe des mitochondries, ce qui localiserait cette étape d’épissage dans le cytoplasme (Yoshihisa et al., 2007). Chez les eucaryotes, après la maturation des pré-ARNt dans le noyau, les ARNt matures sont transportés dans le cytoplasme ou la mitochondrie à travers les pores nucléaires pour intervenir dans la machinerie traductionnelle (Grosshans et al., 2000; Kapushoc et al., 2002).
De plus, ils peuvent être réimportés dans le noyau. La fonction des ARNt nucléaires n’est pas bien comprise, mais il a été proposé qu’ils puissent être utilisés par la machinerie de traduction dans le noyeau pour assurer le contrôle qualité de certains ARNm ou qu’ils servent de réservoir d’ARNt non acylés pour maintenir le rapport adéquat d’ARNt acylés/déacylés dans le cytoplasme. Une autre possibilité est que le va et vient entre le noyau et le cytoplasme permet de contrôler l’intégrité des ARNt, qui sont réparés ou dégradés après réimportation dans le noyau ou qu’il sert à relayer l’information concernant le niveau d’acylation des ARNt cytoplasmiques vers le noyau (Yoshihisa, 2006) Figure 4.
LES MODIFICATIONS POST-TRANSCRIPTIONNELLES DES ARN DE TRANSFERT
Les ARNt fonctionnels contiennent une grande variété de nucléotides modifiés de façon post- transcriptionnelle. La nature de ces modifications chimiques varie selon la complexité et la fréquence d’apparition sur un nucléotide d’un ARNt, dépend de l’organisme et de la position sur l’ARNt.
Diversité des modifications chimiques des nucléotides
Les modifications post-transcriptionnelles des ARNt ont été observées dans les trois domaines de vie. A ce jour, 163 nucléotides modifiés ont été identifiés dans les différents types d’ARN, dont plus de 100 dans les seuls ARNt, ce qui en fait le type d’ARNt présentant la plus forte aa 5’P CCA 3’OH 5’P 3’OH 5’P CCA 3’OH diversité de modifications. Certaines sont présentes dans les trois domaines de vie (Boccaletto et al., 2018; Carell et al., 2012; Grosjean, 2015; Grosjean et al., 1995; Jackman and Alfonzo, 2013; Machnicka et al., 2014) Figure 5. Les méthylations et pseudouridynations sont les modifications les plus fréquentes dans tous les types d’ARN.
Environ 17% et jusqu’à 25 % (chez les eucaryotes) de la séquence totale des ARNt est chimiquement modifiée au niveau de différents atomes des bases et/ou sur le ribose (très souvent sur l’hydroxyle 2’). Certaines modifications sont communes à tous les organismes, telles que les méthylations, D, et s2U, ce qui suggère l’existence de cette modification dans un ancêtre commun universel. D’autres modifications sont spécifiques seulement à certains organismes, telle que la wybutosine (yW) qui est spécifique des eucaryotes, mais dont un précurseur est présent chez les archées Figure 5. Le nombre de modifications diffère aussi selonla localisation de l’ARNt. Chez les eucaryotes, les ARNt cytoplasmiques sont beaucoup plus modifiés que les ARNt mitochondriaux (mtARNt) (Suzuki and Suzuki, 2014). De plus, le type et degré de modifications dépend également de l’état physiologique cellulaire (§II-3-d).
Les modifications chimiques dans les ARNt sont indiquées par différentes couleurs, selon le domaine de vie. Les modifications retrouvées dans des bactéries et les organelles, d’eucaryotes sont encadrées. La nomenclature communément utilisée pour nommer les modifications est la suivante : mb m le type de modification chimique sur la base du nucléotide, exemple : m pour méthylation, b la position de la modification sur la base, n le nombre de modifications sur la base, X le nucléotide, r la modification sur le ribose du nucléotide. Il est à noter que certaines modifications sont notées par une lettre individuelle (I : inosine ou D : dihydrouriddine) (Carell et al., 2012; Jackman and Alfonzo, 2013).
Ces nucléotides modifiés peuvent être classés en deux catégories suivant la nature chimique de la modification. D’une part, les modifications dites simples, qui sont les plus fréquentes, impliquent généralement l’action d’une seule enzyme pour leur synthèse Figure 6a : par exemple la pseudouridine () qui est la première modification à avoir été détectée, la méthylation de la base ou du ribose (s2C ou Am), la thiolation de la cytosine ou encore la réduction de l’uridine (dihydrouridine) (Carell et al., 2012; Grosjean et al., 1995; Jackman and Alfonzo, 2013).
Localisation et fréquence des nucléotides modifiés dans les ARNt
Il est possible de produire des schémas montrant la distribution et la localisation des nucléotides modifiés dans les ARNt selon le domaine de vie (répertoriés dans la base de données MODOMICS) en utilisant le serveur tRNAmodviz (Machnicka et al., 2014)Figure 7. Cette distribution est liée à la fonction et au rôle précis que ces modifications jouent au sein de ces ARNt. dans les ARNt provenant des trois domaines de vie. Pour les eucaryotes, seuls les ARNt cytosoliques sont pris en compte. Les données ont été générées avec le server tRNAmodiz (Machnicka et al., 2014).
Ces différentes représentations (sous forme de camemberts) permettent de mettre en évidence que les modifications post-transcriptionnelles ont lieu, chez tous les organismes, principalement au niveau des boucles D et T et dans la boucle de l’anticodon. Les positions 34 (position wobble de l’anticodon) et 37 (position adjacente en 3’ de l’anticodon) sont les deux positions présentant la plus grande diversité de modifications chimiques donc souvent des modifications complexes. Les modifications dites simples sont très souvent localisées dans les boucles D et T des ARNt (Grosjean et al., 1995), m5U54 et dans la boucle T et D (dihydrouridine) à différentes positions de la boucle D sont présentes dans presque tous les ARNt, ce qui a conduit à l’appellation de ces boucles.
Enfin, la distribution des nucléotides modifiés chez les archées et les eucaryotes est similaire. II-3) Rôles physiologiques des modifications post-transcriptionnelles Les modifications dites complexes, qui sont le plus présentes au niveau de la boucle de l’anticodon ont un rôle important dans la fidélité et l’efficacité de la traduction. La majorité des études sur les modifications dans les ARNt ont cherché à définir la fonction d’une seule modification. Cependant, il a été montré que l’absence d’une seule modification n’a généralement pas de conséquence visible et que l’apparition d’un phénotype advient seulement lors de la suppression de plusieurs modifications (Alexandrov et al., 2006; Björk, 1995). II-3-a) Rôle des nucléotides modifiés dans le repliement et la stabilité des ARNt Les modifications dites simples qui sont très souvent localisées au coeur de la structure des ARNt et principalement pour rôle de stabiliser le repliement et la structure des ARNt. Les ARNt participent à de multiples interactions avec leurs différents partenaires cellulaires lors de la biosynthèse des protéines (ARNr, aminoacyl-ARNt synthétases). Pour affiner ces interactions, les ARNt ont besoin de variation de leur structure tertiaire en forme de L pour leur apporter de la flexibilité et de la dynamique (Byrne et al., 2010; Derrick and Horowitz, 1993; Helm, 2006; Kowalak, 1994; Motorin and Helm, 2010).
La différence structurale entre un ARNt natif modifié et un ARNt non modifié (synthétisé in vitro) a été explorée en comparant leur stabilité thermique en présence ou non de cations divalents (Mg2+). Pour cela, leur spectre d’absorption a été mesuré à différentes températures et leur profil de digestion par différentes nucléases clivant des ARNt simple et double brins a été examiné (Derrick and Horowitz, 1993). Il a été montré qu’un transcrit in vitro possède une température de fusion, plus faible que celle d’un ARNt natif et qu’il est plus sensible à des attaques par des nucléases, particulièrement au niveau des boucles D et T (Derrick and Horowitz, 1993). De plus, des études de dynamique et de stabilité structurale des ARNt par RMN et cristallographie ont montré que la structure globale des ARNt reste inchangée, mais natifs de levure (jaune PDB 1EHZ et rouge PDB 4TRA). Les ARNt possèdent 63% d’identité de séquence (Byrne et al., 2010).
Ces expériences ont aussi montré que la présence d’ions magnésium est cruciale pour le bon repliement des ARNt. En effet, le squelette phosphate, hautement négatif des ARNt nécessite la présence d’ions positifs pour compenser ces charges négatives (Chen et al., 1993; Nobles et al., 2002; Xu et al., 2016b).
Les ARNt modifiés ou non adoptent leur repliement en forme de L seulement en présence de Mg2+. Cependant, un ARNt transcrit in vitro possède une affinité plus faible pour les ions magnésium qu’un ARNt natif et requiert donc une concentration plus élevée en Mg2+ pour être stable et bien replié (Nobles et al., 2002). Dans l’ARNtPhe de levure, il a été montré que la modification m5C40 permet une forte interaction de l’ARNt avec des ions magnésium, qui se fixent à un site distant de m5C. Ainsi, les nucléotides modifiés peuvent être impliqués dans la coordination site-spécifique du Mg2+ au sein des ARNt (Chen et al., 1993). De plus la coordination de molécules d’eau par le nucléotide modifié en position 38, 39 et en 5’ suggère un rôle possible de la pseudouridinylation dans la stabilisation de la structure des ARNt (Arnez and Steitz, 1994). Il a été proposé que, chez la levure, la fixation d’une molécule d’eau restreint la conformation du ribose de et réduit sa mobilité, ce qui a pour conséquence de rigidifier localement l’ARNt Figure 9 (Arnez and Steitz, 1994; Lorenz et al., 2017).
Fonction des modifications dans l’efficacité et la fidélité de la traduction
Les études menées sur les nucléotides modifiés au niveau de la boucle de l’anticodon chez différents organismes appartenant aux trois domaines de vie, ont permis de mieux comprendre les règles d’appariement codon-anticodon et la stratégie de décodage des codons synonymes (§I-2). Le décodage du codon AUG3 est réalisé par deux types d’ARNt, portant l’anticodon C34AU: l’ARNteMet est utilisé pour incorporer la méthionine et l’ARNtiMet, pour initier la traduction (Grosjean et al., 2010; Marck and Grosjean, 2002). Pour lire ce codon, le C34 de l’anticodon est enzymatiquement modifié en différents dérivés C34, selon l’organisme. Chez la bactérie, C34 est modifié en N4-acétylcytosine (ac4C34), alors que chez certains eucaryotes, il est modifié en 2’- O-méthylribose cytosine (Cm34) (Chimnaronk et al., 2009; Kumbhar et al., 2013). Il a été montré que, la modification ac4C34 stabilise la conformation C3’-endo du ribose et renforce les interactions C34-G3, favorisant ainsi le décodage précis du codon AUG3 (Met) en empêchant la mauvaise lecture du codon AUA (Ile). De façon intrigante , dans les mitochondries de vertébrés et d’insectes, le C34 de l’anticodon de l’mtARNtMet est modifié en 5-formylcytidine (f5C34) (Takemoto et al., 2009). Mais cette modification permet le décodage en Met des deux codons AUG3 et AUA3.
Le décodage des codons Ile-AUU3/AUC3 dans les ARNt cytoplasmiques est réalisé par l’ARNIle contenant C34 chez les eubactéries et les archées ou I34 (inosine 34) chez tous les eucaryotes (Boccaletto et al., 2018; Grosjean et al., 2010). De plus, pour pouvoir différencier le troisième codon Ile-AUA3 du codon Met-AUG3, différentes stratégies ont émergé durant l’évolution, selon les organismes. Chez les eucaryotes, un second ARNtIle (anticodon XAU) portant un nucléotide modifié en position 34 est utilisé. En plus de 34, il possède 36 C34 la modification lysidine (k2C34) (Muramatsu et al., 1988; Yokoyama et al., 1989) et chez les archées, il contient la modification agmatidine (agm2C34) (Voorhees et al., 2013) Figure 11.
Pour éviter un décalage du cadre de lecture, la position 37 est aussi hypermodifiée. Les modifications en position 37 telles que la wybutosine (yW), m1G, ms2i6A (2-méthylthio-N6- isopentényladénosine) et t6A (thréonylcarbamoyladénosine), empêchent le décalage du cadre de lecture +1 et -1 dû à un glissement du peptidyl-ARNt au site P du ribosome (Björk et al., 1999; Urbonavicius, Qian, et al., 2001). Les modifications telle que la ms2i6A (2-méthylthio-N6-isopentényladénosine) en position 37 augmentent aussi la vitesse d’association de l’ARNt au site A du ribosome. Le rôle structurale de cette modification a été visualisé très récemment grâce à la résolution de la structure cristallographique du ribosome (à 3,1 Å de résolution) en complexe avec un ARNm et un ARNt modifié (Jenner et al., 2010). Cette structure met en évidence des interactions d’empilement entre l’atome de soufre en position 2 de ms2i6A et la base du premier nucléotide du codon aux sites A, P et E, ainsi que la liaison d’un ion Mg2+ par le soufre du nucléotide modifié pour l’ARNt dans le site P Figure 12.
Fonction des modifications dans la reconnaissance des partenaires cellulaires
Malgré leur structure tertiaire canonique, les ARNt sont reconnus spécifiquement par leurs partenaires cellulaires grâce aux nucléotides modifiés. Pour qu’une aaRS (aminoacyl ARNt synthéthase) reconnaisse de façon spécifique son ARNt cible, celui-ci doit présenter dans sa séquence des éléments d’identité qui lui sont propres. Généralement, ce sont les nucléotides de la boucle de l’anticodon (34, 35 et 36) ou le résidu en 5’ de la queue CCA (discriminateur) (Giegé, 2006). Dans la grande majorité des cas, l’absence de nucléotides modifiés dans un ARNt n’empêche pas son aminoacylation. Mais dans certains cas, l’absence de certaines modifications peut influer sur la reconnaissance spécifique de l’ARNt par l’aaRS, ainsi que sur l’efficacité d’aminoacylation (Giegé et al., 1993).
Nous avons vu que, la lysidine en position C34 (k2C34) des ARNt reconnaissant le codon AUA est un antidéterminant de la Met-RS (codon AUG) et un déterminant vis-à-vis de l’Ile-RS (codon AUA) (Muramatsu et al., 1988; Nureki et al., 1994; Yokoyama et al., 1989) Figure 11.
Il a été montré que l’ARNtAsp de levure est arginilé par l’Arg-RS, lorsqu’il n’est pas modifié et de même que la seule présence de la modification 1-méthylguanosine en position 37 (m1G37) empêche cette réaction non spécifique (Pütz et al., 1994).
Chez certains eucaryotes, la discrimination entre l’ARNtiMet et l’ARNteMet cytoplasmique se fait par la seule présence de la modification 2’-phosphoribosyl en position 64 des ARNt initiateurs. L’absence de cette modification entraine une discrimination négative envers le facteur d’élongation eEF-1, ce qui empêche l’ARNtiMet d’entrer en cycle d’élongation de la traduction (Foürster et al., 1993).
Chez le virus HIV, la transcription inverse de l’ARN viral utilise l’ARNt3 lys comme amorce, et certains nucléotides modifiés portés par cet ARNt jouent un rôle important dans cette étape d’initiation de la transcription. Par exemple, la présence de s2U en position 34 de l’ARNtlys augmente l’efficacité d’hybridation de l’ARN viral du HIV avec l’ARNt3 lys, rendant l’initiation de la transcription inverse plus efficace (Tisné et al., 2000). Enfin, l’activité de certaines enzymes de modification des ARNt dépend de la présence préalable d’autres modifications. Par exemple, la dihydrouridine synthase 2 de levure est 600 fois moins active sur un transcrit d’ARNt in vitro que sur un ARNt natif (Rider et al., 2009).
De la même manière, la délétion du gène codant pour l’ARNt-m7G46 méthyltransféranse entraîne un défault sévère de croissance à haute température, ainsi qu’une diminution des nucléotides modifiés Gm18 et m1G37. Enfin, la délétion du gène de la m5U54 méthyltransférase chez la bactérie thermophile thermus thermophilus, entraine une diminution de la modification m1A58 dans les ARNt, mais l’augmentation de la modification Gm18 (Tomikawa et al., 2010; Yamagami et al., 2016). Cette notion de « réseau de modification » reste très peu caractérisée. II-3-d) Les nucléotides modifiés et l’adaptation aux changements environnementaux Même si les modifications de l’ARN ont été longtemps considérées comme étant constitutives, de nombreux travaux récents ont montré que le degré de modification des ARNt change en réponse aux différentes conditions environnementales (ARN épigénétique) (He, 2010). Le contrôle du processus de traduction des protéines lors d’un stress cellulaire entraîne la reprogrammation des modifications des ARNt (Chan et al., 2012). Chez la levure, l’exposition au peroxyde d’hydrogène (H2O2) conduit à une augmentation de m5C34 dans les ARNt, qui entraîne la traduction sélective d’ARNm provenant de gènes riches en codon TTG dont celui codant pour la protéine ribosomique RPL22A (Chan et al., 2012). Chez Arabidopsis thaliana et d’autres plantes, des nucléotides modifiés (Am, Cm, m1A et m7G) ont été identifiés comme réponse à des stress biotique (facteurs écologiques) et abiotique (facteurs physico-chimiques), tandis que d’autres (Gm, m5U et m5C) sont impliquées dans le développement de ces plantes (Wang et al., 2017).
Chez la bactérie Pseudomonas aeruginosa, la méthyltransférase TrmJ responsable de la formation de Cm, Um et Am en position 32, confère une résistance aux stress (Jaroensuk et al., 2016). III) LE SOUFRE III-A) Le soufre et son importance en biologie Le soufre est l’un des éléments ubiquitaires parmi les plus abondants sous sa forme organique, c’est un constituant essentiel de la plupart des protéines ( au travers des acides aminés méthionine, homocystéine, cystéine et taurine), de l’ARNt, de cofacteurs (biotine, thiamine) de sucres ou d’antibiotiques (pénicilline) (Kessler, 2006). Il est aussi présent sous sa forme inorganique (centre fer-soufre). La présence de ces molécules soufrées dans différents métabolismes cellulaires laisse à penser que le soufre est arrivé très tôt dans la vie. L’oxygène et le soufre possèdent des propriétés chimiques similaires, mais des réactivités différentes. Le soufre est moins électronégatif que l’oxygène et possède d’avantage d’états d’oxydation. Par exemple, les cystéines peuvent s’oxyder pour former des ponts disulfure alors que les sérines, qui diffèrent des cystéines par la substitution du soufre par l’oxygène, ne forment pas de pont dioxide. La différence provient du fait que les thiols sont de meilleurs nucléophiles que les alcools. La présence d’un soufre dans le cofacteur S-adenosylméthionine (SAM) produit un agent méthylant puissant, qui joue un rôle très important dans le transfert de groupement méthyle à différentes molécules biologiques (protéines, ARN, ADN…). Au sein des protéines, les ponts disulfure (RS-SR) ont certainement été favorisés au cours de l’évolution parce qu’ils sont plus stables que les liaisons peroxydes (RO-OR) (Brosnan and Brosnan, 2006; Palego et al., 2015). Le métabolisme du soufre chez les procaryotes est complexe et comprend plus de 100 gènes impliqués dans la régulation de molécules contenant du soufre ou la synthèse de coenzymes. Différents intermédiaires oxydés du soufre existent (sulfite (SO3 2-), thiosulfate (S2O3 2-), sulfinates (RSO(OH)) ou sulfonates (RSO3-)). Des systèmes d’oxydo-réduction complexes permettent d’atteindre l’état réduit ultime du soufre, le sulfure d’hydrogène (H2S). En condition aérobie, chez certains organismes, l’incorporation du soufre (par exemple de sulfate (SO4 2-)) dans la cellule où le potentiel est fortement négatif (-70 mV), conduit à la réduction du soufre (Sekowska et al., 2000). La première étape consiste en l’assimilation de la molécule soufrée sous forme d’adénosine phosphosulfate (APS) par une ATP sulfurylase, puis l’APS devient un substrat de l’APS kinase dans une réaction qui forme la 3’phosphoadénosine phosphosulfate (PAPS). Le PAPS est ensuite réduit pour former du sulfite (SO3 2-) par l’enzyme PAPS réductase, dépendante de la thioredoxine. Enfin, l’ion sulfite formé est à son tour réduit par la NADPH-sulfite réductase ([FeS] dépendante), pour former le sulfure ou sulfure d’hydrogène (S2-/HS-), qui est assez réactif et toxique pour la cellule à forte concentration (Sekowska et al., 2000). Dans les organismes vivants, la concentration en sulfure (S2-/HS-) est estimée entre 20 et 160 M et peut varier jusqu’à 20 mM pour les organismes vivants dans un milieu riche en sulfure comme l’archée Méthanococcus jannachii (Theissen, 2003; Wang, 2002). Le sulfure peut servir de substrat aux enzymes O-acétylsérine sulfhydrases en présence de O-acétyl sérine pour entrer dans la biosynthèse de la cystéine, puis de la méthionine, pour enfin former une molécule de SAM (Kessler, 2006; Sekowska et al., 2000) Figure 13.
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Table des matières
I) LES ACIDES RIBONUCLEIQUES DE TRANSFERT (ARNT)
I-1) Caractéristiques structurales des ARNt
I-2) Fonction des ARNt
I-3) Biosynthèse des ARNt
II) LES MODIFICATIONS POST-TRANSCRIPTIONNELLES DES ARN DE TRANSFERT
II-1) Diversité des modifications chimiques des nucléotides
II-2) Localisation et fréquence des nucléotides modifiés dans les ARNt
II-3) Rôles physiologiques des modifications post-transcriptionnelles
II-3-a) Rôle des nucléotides modifiés dans le repliement et la stabilité des ARNt
II-3-b) Fonction des modifications dans l’efficacité et la fidélité de la traduction
II-3-c) Fonction des modifications dans la reconnaissance des partenaires cellulaires
II-3-d) Les nucléotides modifiés et l’adaptation aux changements environnementaux
III) LE SOUFRE
III-A) Le soufre et son importance en biologie
III-B) La L-cystéine comme donneur de soufre
III-B-1) Cas de la L-cystéine désulfurase
III-B-2) Cas de la cystéine lyase et la cystéine désulfidase
III-B-3) Les centres [Fe-S]
III-B-4) Les transferts de soufre par persulfuration de cystéines dans la voie de biosynthèse des ARNt modifiés
III-B-4-a) Cas du relais de transfert de soufre Tus
III-B-4-b) Cas du relais de transfert de soufre de type ubiquitination
i. La voie de transfert de soufre de type ubiquitination dans le cytoplasme
ii. La voie des TtuABCD
III-C) Le soufre dans les thionucléotides
III-C-1) Les thionucléotides dans les ARNt
III-C-2) Les enzymes de thiolation des ARNt et leur mécanisme réactionnel
III-C-2-a) La simple substitution d’un atome d’oxygène par un soufre utilisant la chimie des persulfures
i. U34-ARNt 2-sulfurtransférase MnmA
ii. U8-ARNt 4-sulfuretransférase (ThiI)
III-C-2-b) L’activation du nucléotide cible par les enzymes à radicale SAM : l’ARNt méthylthiotransférase
OBJECTIF DE THÈSE
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I: BIOSYNTHESE DE LA 2-THIOCYTIDINE : C32-ANRt-2- SULFURTRANSFERASE (TTCA)
A. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
B. RESULTAT ET DISCUSSION
B-I) ANALYSE DE LA PROTÉOLYSE NATURELLE DE TTCA D’E. COLI
B-II) PRODUCTION ET PURIFICATION DES MUTANTS DE LA PROTÉINE TTCA D’E. COLI
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE II: BIOSYNTHESE DE LA 5-METHYL-2-THIOURIDINE: M5U54-ARNT-2- SULFURTRANSFERASE (TTUA)
A. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
B. ETUDE DU MECANISME DE THIOLATION NON-REDOX DES ARN DE TRANSFERT PAR ACTIVATION VIA UN CENTRE [4FE-4S]
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE III : BIOSYNTHESE DE LA 2-THIOURIDINE: U34-ARNT-2- SULFURTRANSFERASE
A. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
A-1) Importance des modifications en U34, pour la reconnaissance du codon
A-2) Les modifications sur U34 permettent de réguler finement la traduction génétique
A-3) Absence de la modification sur U34 et maladies
A-4) Les enzymes responsables de la thiolation en position U34
B. UN CENTRE [4FE-4S] EST UTILISE POUR LA THIOLATION DE L’URIDINE 34 DANS LES ARNT CHEZ LES ARCHEES, UNE MODIFICATION IMPORTANTE POUR LE DECODAGE PRECIS DE L’INFORMATION GENETIQUE.
B-I) EXPRESSION, PRODUCTION, PURIFICATION DE CTU1 ET/OU CTU2 HUMAINE
B-II) PRODUCTION, PURIFICATION ET RECONSTITUTION DU CENTRE [FE-S] PRÉSENT DANS LA PROTÉINE NCSA DE M. MARIPALUDIS (MM NCSA)
B-III) STRUCTURE CRISTALLINE DE NCSA DE METHANOCCOCCUS MARIPALUDIS
B-IV) TEST D’ACTIVITÉ IN VITRO DE NCSA DE M. MARIPALUDIS
B-V) ETAT DU CENTRE [4FE-4S] AU COURS DE LA RÉACTION
C. DISCUSSION ET PERSPECTIVES
MATERIELS ET METHODES
A. MATÉRIELS ET MÉTHODES
A-I) MATÉRIEL BIOLOGIQUE ET MILIEUX DE CULTURE
Souches bactériennes utilisées.
A-I-1-a) E. coli DH5 (DE3)
A-I-1-b) E. coli BL21 (DE3)
A-I-1-c) E. coli BL21 (DE3) star codon plus
A-I-2) Les vecteurs utilisés
A-I-2-a) pGEX-6p-2
A-I-2-b) pBG102 (Center for Structural Biology, Vanderbilt university)
A-I-3) Milieux de culture
A-I-4) Solutions à usage courant
A-II) BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
A-II-1) Les vecteurs utilisés
A-II-2) Mutagenèse dirigée
B. METHODES BIOCHIMIQUES
B-I) PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES RECOMBINANTES
B-I-1) Production des protéines recombinantes
B-I-1-a) Production et purification de TtcA d’E. coli, ses mutants et de NcsA de M. maripaludis
ii. Production de NcsA de M. maripaludis
B-I-1-b) Lyse cellulaire
B-I-2) Purification des protéines recombinantes
B-I-2-a) Première étape de purification des protéines : chromatographie d’affinité
i. Chromatographie d’affinité à la glutathion-S-transférase (GSTRAP): purification de la protéine GST-TtcA sauvage et GST-TtcA 1-291
ii. Chromatographie d’affinité aux ions nickel (Ni-NTA) : 6His-SUMO-TtcA 14-289 d’E. coli et 6His- SUMO-NcsA de M. maripaludis
B-I-2-b) Clivage de la protéine de fusion GST ou 6His-SUMO par la protéase 3C du rhinovirus humain (PreScision)
B-I-2-c) Deuxième étape de purification : chromatographie d’affinité inverse ou chromatographie d’échange de cations
i. Chromatographie d’affinité à la glutathion-S-transférase inverse: purification de la protéine TtcA sauvage et TtcA 1-291 (GSTRAP inverse)
ii. Chromatographie échangeuse de cations (MonoS): purification de la protéine TtcA 14-289 et NcsA
B-I-2-d) Troisième étape de purification : chromatographie d’exclusion stérique
B-I-3) Détermination de la concentration des protéines
B-II) RECONSTITUTION DU CENTRE [4FE-4S] DES PROTÉINES EN BOÎTE À GANTS
B-II-1) Préparation de l’apoprotéine NcsA
B-II-2) Reconstitution du centre [FeS]
B-II-3) Quantification du centre [Fe-S]
B-II-3a) Dosage des atomes de Fer
B-II-3b) Dosage des atomes de soufre
B-III) PRODUCTION, EXTRACTION ET PURIFICATION D’ARN DE TRANSFERT SUBSTRAT DE MMNCSA
B-III-1) Extraction et purification des ARNt totaux de la souche mnmA- d’E. coli
B-III-2) Transcription in vitro et purification de l’ARNtlysUUU de M. maribaludis
B-IV) TEST D’ACTIVITÉ IN VITRO DE L’HOLO-NCSA
B-IV-1) Conditions expérimentales
B-IV-2) Visualisation des produits d’ARNt thiolés : gel retard d’APM en condition dénaturante
B-IV-3) Digestion des ARNt et analyse des nucléotides modifiés
B-V) CARACTÉRISATION SPECTROSCOPIQUE DU CENTRE [FE-S]
B-VI) CRISTALLISATION, COLLECTE DES DONNÉES DE DIFFRACTION AUX RAYONS X ET DÉTERMINATION DE LA STRUCTURE DES PROTÉINES
B-VI-1) Cristallogenèse des protéines
B-VI-1-a) Principe et technique de la cristallisation
i. Principe de la cristallisation
ii. Technique utilisée : diffusion en phase vapeur
B-VI-1-b) Recherche et amélioration des conditions de cristallisation
B-VI-1-c) Optimisation des cristaux de MmNcsA
B-VI-2) Congélation, enregistrement et traitement des données de diffraction aux rayons X
B-VI-2-a) Congélation des cristaux
B-VI-2-b) Enregistrement des données de diffraction
B-VI-2-c) Traitement des données de diffraction aux rayons X
i. Détermination des paramètres de maille ainsi que le réseau de Bravais
ii. Intégration des données et mise à l’échelle
iii. Contenu de l’unité asymétrique et coefficient de MatthewsContenu de l’unité asymétrique et coefficient de Matthews
B-VI-3) Phasage et affinement de la structure de l’holo-NcsA
B-VI-3-a) Phasage par remplacement moléculaire
i. Le remplacement moléculaire
ii. La diffusion anomale
B-VI-3-b) Construction du modèle et affinement de la structure
i. Construction du modèle de l’holo-NcsA
ii. Affinement des facteurs de structure
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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