Etude des effets du toluène chez la rate gestante

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Administration du toluène

L’administration du toluène à été réalisée par voie IP à la dose de 332 mg/ kg de poids corporel correspondant au ¼ de la DL50 établie par IUCLID (IUCLID, 1998).
Le traitement, qui a duré 10 jours, a été effectué entre le 4ème et le 14ème jour, à raison d’une injection quotidienne de 2 ml d’une solution renfermant 41.5g de toluène/l d’huile d’olive. Les lots témoins et gestantes non traitées recevaient selon le même protocole, une injection de 2 ml d’huile d’olive.

Tests comportementaux

Test de la nage forcée

Nous supposons que la grossesse semble jouer un effet modérateur sur la nocivité et la neurotoxicité du toluène, en protégeant la route GABAergique. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé le test de Porsolt ou Test de la nage forcée.
Chez le rat, certains changements de comportement qui se produisent peuvent être analysés au cours du test de la nage forcée (FST), qui est conçu pour tester le profil antidépresseur des médicaments. La présente étude vise à analyser, chez les rattes gestantes après la mise bas, l’efficacité d’un agoniste GABAergique, le Clonazépam ; ces changements de comportement sont affichés dans la FST (Porsolt R.D et al.,1978 ;Porsolt R.D et al.,1977). Cette approche peut nous confirmer si la voie GABAergique est altérée chez les quatre lots expérimentaux. Les rattes ont été placées dans un aquarium dont l’eau est maintenue à 21-22 °C, d’une profondeur de 35 cm, pour un pré-test de 15 min. Des injections (solution saline ou Clonazépam) sont faites à 24 heure, 5 heure et 1 heure avant un test de 5 min. La profondeur de l’eau de 35 cm pousse les rats à nager ou à flotter. Le Clonazépam est administré par voie sous cutanée dans un volume équivalent à 2 ml / kg à une dose de 0.25 mg / ml (Porsolt R.D et al., 1978 ; Frih H et al., 2010). La solution saline (0.9%) a également été administrée par voie sous cutanée dans un volume équivalent à 2 ml / kg. La séance quotidienne de nage a été filmée pour l’analyse comportementale. Les temps d’immobilité, de nage et d’escalade sont calculés.

Prélèvements

Prélèvements sanguins

Le prélèvement se fait à partir de la veine lacrymale au 7ème, 14ème jour et après la mise bas (ApMB). Les échantillons sanguins sont recueillis dans les tubes héparinés puis centrifugés à 5000 tr/min et le plasma est mis au congélateur pour le dosage de la LH et de la progestérone plasmatiques.
La LH et la progestérone sont dosées par la méthode conventionnelle ELISA kit BIOTECH.
La mesure se fait à l’aide d’un lecteur ELISA TECAN Magellan muni d’un logiciel informatique qui calcule automatiquement la gamme étalon et nous donne directement la valeur de la LH à l’unité désirée.

Dissection et prélèvement des organes

Après sacrifice, l’animal est fixé en décubitus dorsal, une incision est pratiquée depuis l’orifice urogénital jusqu’au manubrium sternal. Les ovaires, les surrénales, le cerveau ont été rapidement prélevés sous glace à l’aide de pinces fines et pesés au moyen d’une balance de précision [Scaltec Instruments, Germany].

Analyse statistique des résultats

Les résultats sont présentés sous forme de moyennes ± SEM. Un test ANOVA à deux critères de classification pour la comparaison multiples des moyennes a été utilisé, suivi d’un test de Newman et Keuls, en cas de différence significative entre les différents lots. Les résultats des tests de liaison ont été analysés par le test t de Student. Ils sont considérés comme étant significatifs à p <0.05.

Caractérisation des paramètres de la gestation

Les paramètres de la gestion sont estimés par la durée de gestation (j), le gain de poids des rattes gestantes du 4ème au 20ème jour de la gestation (% et g), la mortalité néonatale (Totale), le nombre moyen de petits par portée, le poids moyen des petits (g) et le pourcentage des petits mâles (Tableau. 1).
Pour ce qui est du gain du poids, on constate qu’il est plus important chez les femelles gestantes non traitées au toluène (TG : 29.1 ± 7.7 vs Tol : 24 .5 ± 6.5). Le nombre moyen de petits par portée est plus élevé chez les témoins que chez les femelles gestantes traitées au toluène (TG : 10.5 ± 0.5 vs TolG : 6.66 ± 1.05). La même constatation est relevée pour le poids moyen des petits (TG : 7 ± 0.12 vs TolG : 5.8 ± 0.09). Le pourcentage des petits mâles est relativement faible chez les rattes traitées au toluène (TG : 42.8 ± 22 vs TolG : 36.2 ± 13).

Variation des paramètres hormonaux

Variation du taux de LH plasmatique (mUI/ml)

L’appréciation du niveau de la LH a été effectuée au cours du 7ème et 14ème jour de la gestation et 2 jours après la mise bas (ApMB) (Fig. 2).
Au 7ème jour du prélèvement (qui correspond au 7ème jour de la gestation pour les femelles gestantes et au 3ème jour du traitement au toluène pour tous les animaux), le traitement au toluène seul (sans gestation), a provoqué une augmentation très hautement significative des taux de LH plasmatique par rapport aux animaux témoins (Tol, 7ème : 1.838 ± 0.094 vs Basale, 7ème : 1.18 ± 0,095). Ce taux s’effondre au 14ème jour (Tol, 7ème : 1.838 ± 0.094 vs Tol, 14ème : 0.55 ± 0.02), avant de redevenir normal 10 jours après l’arrêt du traitement (Basale, ApMB : 1.02 ± 0.047 vs Tol, ApMB : 0.944 ± 0.22). La gestation seule a provoqué une augmentation significative du taux de LH au 14ème jour (TG, 14ème : 1.34 ± 0.17vs Basale, 14ème : 1.07 ± 0.063).
Associé à la gestation, le traitement au toluène ne semble pas affecter les taux de LH plasmatique et aucune différence significative n’a été enregistrée après la mise bas.

Matériel et méthode

Matériels Biologiques

Vingt six (treize femelles et 13 mâles) rats blancs provenant de l’institut pasteur d’Alger (Couba). Pesant entre 150-250g ont été choisis pour notre étude. Le Rattus norvegicus ou norvégien est une espèce génétiquement sélectionnée, issue par croisement, de race albinos (Festing, M.F.W., 1979). C’est un rongeur nocturne, omnivore et coprophage. Il possède une large tête, de petites oreilles des yeux rouges globuleux et une petite queue. Il se reproduit pendant toute l’année et la gestation dure 21 jours.
Les animaux sont hébergés par cage de six, dans des conditions standards (température 22 ± 1°C, cycle normal lumière-obscurité 12h :12h avec début de nuit à 19h). Les cages utilisées sont en plastique ayant un couvercle en acier inoxydable, munies de biberons. Une épaisse couche de sciure est déposée au fond des cages et renouvelée tous les 3 à 4 jours. Les rats Wistar sont nourris quotidiennement par un aliment, sous forme de bâtonnet d’origine commerciale, », constituée de pellettes à base de maïs, son, remoulage, soja et complément minéral vitaminé (CMV) (Sarl la production locale d’aliment pour souris et rats Bouzaréah- Alger) et reçoivent de l’eau « ad libitum
Après deux semaines d’adaptation, les femelles et les males sont mis en accouplement, deux par cage, le jour d’insémination est considéré le jour 0 de gestation (DG0). La mis bas se manifeste à terme de 21 jour, le jour de naissance est le jour postnatal 0 (PN0). Les animaux ont été soumis à différentes séries d’étude, toutes les procédures appliquées ont été approuvées par le comité scientifique de l’université.
Les animaux sont répartis aléatoirement en deux lots, lot traité au toluène (lot Tol) et le lot control (lot Cont) c’est le lot témoin.

Effet sur le développement physique des nouveaux nés

Parmi les indicateurs du développement physique, nous avons réalisé la mesure des 3 paramètres les plus importants (Roberts et al., 1997 ; Da-Silva et al., 1990) : 1998).
Ces trois paramètres constituent de bons indicateurs du développement physique de la descendance

Effet sur les paramètres Neuromoteurs des ratons

Test de retournement

Il est réalisé le 3éme jour du post natal (PN 3) ; Au cours de ce test le rat est déposé sur le dos et tente ensuite de revenir à la position dorso-ventral. Le but est de mesurer la maturation neuro-musculaire par le calcule du temps nécessaire à effectuer un retournement.

Test d’agrippement

Il s’effectue le 4éme jour du post natal (PN 4) ; ce test sert à mesurer la force musculaire des membres antérieurs. Le dispositif est composé d’un plateau en bois couvert par une grille en plastique, , fixé sur un support en bois et menu d’un rapporteur. Le rat est déposé au milieu, s’agrippe sur la grille une fois le plateau est mis en rotation. La variable mesurée est l’angle atteint par rapport à l’horizontale quand le jeune rat cesse décroche et tombe. La mesure de l’angle et exprimée en degré (ETAP, 2001).

Test de réaction antigravitaire

Il s’effectue le jour 9 du poste natal (PN 9) dans le but de mesurer l’équilibration et la maturation du cervelet et des canaux semi-circulaires de l’oreille interne. On place le jeune raton « la tête vers le bas » sur un plan incliné à 20° ; l’animal doit pivoter pour se retrouver « la tête vers le haut » ; on mesure le temps nécessaire pour que l’animal effectue un demi-tour complet de 180° (Etap, 2001).
a- L’évolution pondérale des jeunes est réalisée pendant les jours : J2 ; J5 ; J9 ; J12 ; J15 et J18, à l’aide d’une balance de précision (BIO BLOCK Scientific).
b- Les dates de percée des incisives : cette mesure s’effectue entre le 8éme et le 11éme jour après la naissance par simple appréciation visuelle (Thiel et al., 1997).
c- La vérification de l’ouverture des yeux : elle s’effectue entre le 12éme et le 16éme jour après la mise bas à partir de l’observation des ratons (Sorige et al.,

Test de suspension

Ce test est réalisé le jour 12 du post natal (PN 12) pour la mesure de la force musculaire et de la fatigabilité du raton. Le mécanisme employé est formé d’un fil en coton tendu entre deux supports en bois. Les pattes antérieures du jeune rat sont amenés au contacte du fil à 40 cm du sol, cette stimulation déclenche une réaction d’agrippement et l’animal se suspend au fil pendant un laps de temps puis lâche prise à cause de la fatigue. La variable mesurée est la durée de suspension (temps en seconde) à l’aide d’un chronomètre (Etap, 2001).

Effet sur le développement comportemental et cognitif des jeunes

Test des champs ouverts (PN45)

Ce test permet d’évaluer sur des sessions de test de 5 minutes, les troubles de l’activité locomotrice, du comportement exploratoire et de l’état émotionnel des animaux
Le dispositif utilisé est une enceinte carrée en plexiglas de 70 cm de long et de 50 cm de haut. Il est divisé en 7 parties de même superficie : 1 partie centrale et 6 parties périphériques. La partie centrale sert de point de départ aux animaux à chaque test.
Les variables étudiées sont le nombre des cases traversées, le nombre de redressement (activité locomotrice et exploratrice) et le nombre de passage dans la case centrale du dispositif (critère d’anxiété).

Test de Morris

Le dispositif employé est un bassin de 150 m de diamètre remplis d’eau. Le rat à l’intérieur nage pour fuir le milieu aquatique aversif. Le test ce déroule en deux sessions de 5 essais par jour. le PN50 le rejeton apprend à situer l’emplacement d’une plate forme immergée à 2mm à la surface de l’eau et s’y réfugier, la deuxième session le PN51 comporte deux essais au cours des quels la plateforme est retirée et le comportement du rat est filmé pendant 60 seconde (s). Entre chaque essai le rongeur est laissé 30 s de repos sur la plateforme pour lui permettre de prendre des repères spatiaux, indispensable à son orientation dans le dispositif.

Effet du traitement sur le développement cognitif et comportemental des ratons à l’âge adulte

Matériel biologiques

Cinquante six ratons pesant en moyenne 200 g , Agé de 70 jours dont 30 issues de mère traitées au toluène (lot Tol) et 26 descendant de mère contrôles (lot Cont ).
Les animaux de sexe différent sont séparés au sevrage et sont logés dans des cages de six dans des conditions standards (température 22 ± 1°C, cycle normal lumière-obscurité 12h :12h avec début de nuit à 19h). (Fig.9).

Méthodes

Les animaux subissent une série de tests d’exploration comportementale, endocrinienne et immunologique dans le but d’étudier l’effet du toluène sur le développement et l’évolution des ratons à l’âge adulte.

Test de freinage à la dexaméthasone (DEX) (Yehuda et al., 2002)

Corticoïde de synthèse dérivé de cortisone, la dexaméthasone a un effet glucocorticoïde puissant et minéralocorticoide extrêmement faible. Ils ont un pouvoir freinateur sur la sécrétion de l’ACTH hypophysaire. Elle est administrée par voie intra-péritonéale au volume de 0,2ml par rat (Déxaméthasone Phosphate Sodique, 4mg/ml, Groupe SAIDAL)
Les prélèvements sanguins sont obtenus, à la même heure, avant et après traitement à la Dxm. : – Le premier prélèvement sanguin réalisé avant le traitement à la Dxm, est symbolisé (Pré-DEX) ;
– Le second sanguin obtenu, le lendemain à la même heure, est symbolisé (Post-DEX).

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1: Etude des effets du toluène chez la rate gestante: Aspect neuro-comportemental et physiologique
Résumé
Abstract
1. Introduction
2. Matériels et Méthodes
2.1. Matériel biologique
2.1.1. Détermination de la réceptivité sexuelle
2.2 .Administration du toluène
2.3. Tests comportementaux
2.3.1. Test de la nage forcée
2.4 .Prélèvements
2.4.1. Prélèvements sanguins
2.4.2. Dissection et prélèvement des organes
2.5. Analyse statistique des résultats
3. Résultats
3.1. Caractérisation des paramètres de la gestation
3.2. Variation des paramètres hormonaux
3.2.1. Variation du taux de LH plasmatique (mUI/ml)
3.2.2 .Variation du taux de la progestérone plasmatique (ng/ml)
3.3. Variation des paramètres de la nage forcée
3.4. Variation du poids relatif des ovaires, surrénales et cerveau
4. Discussion
CHAPITRE 2 : Effets du stress prénatal au toluène sur le développement de la progéniture des rats Wistar : Aspect neuro-comportemental et physiologique
Résumé
Abstract
1. introduction
2. Matériels et Méthodes
2.1 Matériel biologique
2.2 Effet sur le développement physique des nouveaux nés
2.3 Effet sur les paramètres Neuromoteurs des ratons
2.3.1. Test de retournement
2.3.2. Test d’agrippement
2.3.3. Test de réaction antigravitaire
2.3.4. Test de suspension
2.4. Effet sur le développement comportemental et cognitif des jeunes
2.4.1. Test des champs ouverts (PN45)
2.4.2. Test de Morris
2.5. Effet du traitement sur le développement cognitif et comportemental des ratons à l’âge adulte
2.5.1. Matériel biologiques
2.5.2. Méthodes
2.5.2.1. Test de freinage à la dexaméthasone
2.5.2.2. Prélèvement
2.5.3. Etude comportementale
2.5.3.1. Procédure de la nage forcée (Forced Swimming Test)
b- Variables mesurées
2.5.3.2. Procédure du labyrinthe en croix surélevée (Plus Maze Test)
a- Description du test
b- Dispositif utilisé
c- Variables mesurées
2.5.3.3. Procédure des champs ouverts (Open Field Test)
a. Description du test
b. Dispositif utilisé
c. Variables mesurées
2.5.3.4. Procédure de Labyrinthe aquatique de Morris (Morris water Maze Test)
a. Dispositif expérimental
b. Protocole et variables mesurés
2.5.4. Dosage des paramètres immunitaires
2.5.4.1. Dosage des immunoglobulines
2.5.4.1.1. Principe de test
2.5.4.1.2. Prélèvement et préparation des échantillons
2.5.4.1.3. Réactifs -Composition et concentrations
2.5.4.1.4. Conservation et stabilité
2.5.4.1.5. Calcule de résultats
2.6 Analyses statistiques
3. Résultats
3.1 Effet du traitement sur la taille de la portée et sex-ratio à la naissance
3.1.1 Sex ratio des ratons
3.1.2 Taille des portées ratons
3.2.1 Evolution pondérale (J2 J5 J9 J12 J15 et J18)
3.2.2 Age de percée d’incisive
3.2.3 Age d’ouverture des yeux
3.3. Effet du traitement au toluène sur le développement neuro-moteur des jeunes
3.3.1 Test de retournement
3.3.2. Test d’agrippement
3.3.3. Test de réaction antigravitaire
3.3.4. Test de suspension
3.4. Effet sur le développement comportemental et cognitif des jeunes
3.4.1. Test des champs ouverts
3.4.2. Test de Morris
3.5. Résultats des tests comportementaux chez les ratons à l’âge adulte
3.5.1. Effets du stress prénatal au toluène sur le comportement des ratons dans le Test des champs ouverts à l’âge adulte
3.5.2. Effets du stress prénatal au toluène sur le comportement des ratons dans le Test du labyrinthe en croix surélevée à l’âge adulte
3.5.3. L’effet du stress prénatal au toluène sur les résultats de la nage forcée à l’âge adulte
3.6. Résultats des paramètres immunologiques chez les ratons à l’âge adulte (70 jours)
3.6.1. Variations des populations leucocytaires et des immunoglobulines G chez les rats mâles adultes (70jours) issus des mères contrôles et traitées au toluène chez les rattes femelles adultes (70jours) issus des mères contrôles et traitées au toluène
3.6.3. Variations des paramètres immunitaires chez les rats mâles adultes (70jours) issus des mères contrôles et traitées au toluène après traitement à la dexaméthasone
3.6.4. Variations des paramètres immunitaires chez les rattes femelles adultes (70jours) issues des mères contrôles et traitées au toluène après traitement à la dexaméthasone
4. Discussion
5. Conclusion
CONCLUSION GENERALE
REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE

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