Soutenance mémoire
En cette fin de vingtième siècle, on assiste à l’ émergence, aussi bien dans le domaine de la recherche que celui de l’industrie, d’une discipline pluridisciplinaire connue sous le nom de biotechnologie. Sous cette appellation, on regroupe les secteurs de l’agronomie (modifications génétiques des aliments), des contrôles vétérinaires aux frontières (prévention des épidémies), de la dissuasion militaire en matière d’armes bactériologiques, de la surveillance de l’environnement (contrôles anti-pollution) et bien entendu du secteur medico-pharmaceutique, sous le forme de diagnostics cliniques, de suivis thérapeutiques et de recherches sur de nouveaux médicaments génétiques. Tous ces secteurs sont soumis aux mêmes besoins qui résident principalement dans la détection de la présence de molécules au sein d’un échantillon (sang, noyau cellulaire, air) et dans la compréhension des mécanismes d’interactions moléculaires. Bien qu’il existe dans certains des secteurs précités des dispositifs commercialisés et tout à fait opérationnels, nous allons tenter dans ce rapport de thèse, d’apporter de nouvelles réponses aux utilisateurs de biocapteurs.
Les biocapteurs procèdent la plupart du temps de 1′ association de deux entités moléculaires biologiques, dont l’une est immobilisée en phase solide, tandis que l’autre provient d’échantillons à tester. Le cahier des charges sur lequel nous allons nous appuyer pour réaliser notre biocapteur optique a pour grandes lignes :
-une grande spécificité
-une sensibilité adaptée à la molécule à détecter
-une réponse en temps réel
-une lecture directe de 1′ interaction moléculaire sans aide de marqueurs.
-une analyse en parallèle de plusieurs types de molécules
-un faible coût
C’est en 1960 que fut mis au point le premier dosage immunologique basé à la fois sur la spécificité de reconnaissance en utilisant un couple anticorps-antigène et sur la sensibilité, en greffant un marqueur radioactif sur l’anticorps (Berson & Yalov 1960). Le biocapteur était ainsi inventé, mais l’utilisation de radio-marqueurs posait déjà des problèmes de sécurité et de manipulations à résultats différés. Depuis cette époque, on a vu émerger quantité de nouvelles techniques destinées à optimiser les six critères précités. On substitua, par exemple, des marqueurs enzymatiques ou fluorescents aux anciens marqueurs radioactifs. On développa également l’ingénierie biomoléculaire pour isoler des nouvelles molécules biologiques. Ces techniques, malgré leur fiabilité et leur sensibilité, restaient longues et coûteuses aussi bien en main d’oeuvre qu’en terme de coût. C’est en partie grâce à la rencontre fortuite des biotechnologies et de certaines disciplines physiques, comme l’optique ou la micro électronique que de nouvelles méthodes d’analyses en temps réel et sans marqueurs sont apparues. Ces capteurs biologiques sont constitués d’une couche immunosensible ou biorécepteur et d’un dispositif de transduction du signal,convertissant en temps réel l’interaction biomoléculaire en un signal physique détectable. Cependant l’aspect temps réel n’était pas toujours compatible avec la détection en parallèle de plusieurs interactions, qui elles-mêmes, d’un autre côté, nécessitaient des marqueurs pour avoir accès aux résultats de leurs expériences. L’objet de ce travail de thèse pluridisciplinaire a consisté en la réalisation d’un biocapteur optique procédant de phénomènes connus comme la propagation d’ondes électromagnétiques de surface et d’ondes guidées, et adapté à l’analyse directe de plusieurs espèces à la fois. Pour ce faire, nous avons fait l’image du biorécepteur sur lequel les molécules avaient été immobilisées par un procédé électrochimique. Nous avons principalement axé nos recherches sur trois critères parmi les six présentés plus haut : la spécificité associée à la qualité du biorécepteur, la sensibilité de détection et la détection multiparamétrique. De par la nature pluridisciplinaire du sujet, le manuscrit se découpe en trois parties distinctes. La première partie traitera des aspects physiques et optiques associés à la réalisation du biocapteur. Nous présenterons dans la deuxième partie les différents types de molécules que nous avons étudiées ainsi que leurs modes d’interactions. Enfin, dans la troisième partie, nous nous concentrerons sur la validité expérimentale du biocapteur optique en réalisant des expériences de reconnaissances moléculaires débouchant sur une application : la détection de mutations ponctuelles au sein de fragments d’ADN synthétiques. Nous conclurons en abordant l’aspect du développement à apporter à notre dispositif et les perspectives envisagées.
Approche théorique de la transduction optique
Pour un capteur biologique, la transduction est le phénomène physique qui permet de suivre in vitro l’évolution d’une réaction biologique et de mesurer le nombre de molécules qui y a pris part. Cette notion détermine toutes les propriétés d’un biocapteur, à savoir la spécificité, la sensibilité de détection, la reproductibilité des résultats, etc … Nous posons alors les bases d’un cahier des charges auxquelles devront se plier les dispositifs de transduction étudiés. Nous consacrons en conséquence une partie importante de ce mémoire de thèse à l’étude particulière des transducteurs optiques utilisés durant nos expériences, en analysant leur fonctionnement propre et les sensibilités relatives à leur mode d’utilisation. Pour l’un des deux transducteurs optiques, nous présentons une méthode pour améliorer la sensibilité de détection en utilisant les résultats de l’étude analytique, alors que pour l’autre, nous développons un système d’imagerie nous donnant la possibilité de traiter les réactions biologiques en parallèle.
Etat de l’art des biocapteurs
Nous allons dresser dans cette partie une liste non-exhaustive des biocapteurs (puisque nous ne nous intéresserons qu’aux capteurs biologiques dont l’une des espèces est immobilisée en phase solide) et de leur principe tout en cernant leurs applications, leur sensibilité analytique, leur fonctionnalisation de surface permettant l’immobilisation de molécules spécifiques à la reconnaissance d’une molécule en particulier, leur régénérabilité et enfin, la possibilité pour chacun de réaliser plusieurs types de reconnaissance à la fois. Nous passerons en revue les biocapteurs basés sur une révélation enzymatique ou radioactive, ceux qui sont basés sur la détection de signaux électriques, les capteurs acoustiques et enfin les capteurs optiques, que nous aurons l’occasion de développer dans les parties I-B-4- 1 et I-B-4-2.
Les tests immunologiques
Par le terme « tests immunologiques », nous désignons les tests radio-immunologiques (RIA pour Radio-Immuno Assay) et les tests immuno-enzymatiques (ElA pour EnzymaticImmuno Assay) couramment pratiqués dans les laboratoires d’immunologie et quasiment sous la même forme dans les laboratoires axés sur la génétique moléculaire. Ces tests firent leur apparition il y a plusieurs décennies dans le but de doser la concentration en solution d’hormones et d’antigènes. Ils sont tous les deux basés sur une détection indirecte d’un marqueur couplé soit à l’analyte dans le cadre du test en compétition, soit à l’anticorps secondaire dans le cas du test en sandwich. Ces tests peuvent être utilisés suivant deux protocoles (Figure I-1): tout d’abord, le test en compétition, où le complexe antigène-anticorps est immobilisé en phase solide (avec l’antigène marqué) et un antigène non marqué ayant un site de reconnaissance compatible avec l’anticorps est ensuite mis en présence du complexe, et va prendre petit à petit la place de l’antigène marqué. Dans ce cas, le signal radioactif va décroître avec le temps. Vient ensuite le « test sandwich », qui comme son nom l’indique procède de la reconnaissance du complexe immun (où aucun des protagonistes n’est marqué) par un anticorps secondaire marqué ayant un site de reconnaissance dirigé contre un autre épitope de l’antigène (le premier épitope étant déjà reconnu par l’anticorps primaire), le signal, cette fois-ci est proportionnel à la concentration d’antigène.
Les tests radio-immunologiques (RIA:RadiolmmunoAssay)
Ce type de test RIA (pour Radio Immune Assay) a initialement été développé pour doser des hormones en solution à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques. L’hormone dans ce cas était radio marquée, généralement par un isotope de 1 ‘iode. On élargit peu à peu ce test à l’ensemble des protéines, voire aux acides aminés, avec des résultats très fiables et très reproductibles. En outre, la quantification de l’espèce à doser est possible par cette méthode et sa sensibilité analytique est très bonne puisque la RIA assure des reconnaissances à des concentrations de l’ordre du pg/rnl. La détection s’effectue à l’aide d’un compteur Geiger, ayant un bruit très faible. La régénération n’est pas possible pour ce test, qui ne possède en général aucune fonctionnalisation de surface et l’analyse en parallèle de plusieurs réactions demeure impossible de par l’isotropie de l’émission radioactive qui parasiterait la détection des espèces voisines. Cette méthode reste toujours en usage dans les laboratoires, mais principalement pour détecter la présence d’une séquence d’ADN et de moins en moins pour les protéines. En effet, le radio marquage n’est pas possible pour toutes les protéines et représente un coût supplémentaire et bien sûr un risque d’irradiation pour les manipulateurs. C’est pourquoi on s’est dirigé vers une méthode offrant les mêmes avantages pour beaucoup moins d’inconvénients :le test immune-enzymatique.
Les tests immuno-enzymatiques (ElA: Enzymatic Immuno Assay)
Parmi les tests ElA (pour Enzymatic Immune Assay), le plus utilisé demeure le test ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assay) se prése~?-tant sous la forme d’une plaque sur laquelle se trouvent 96 puits. De fait, l’analyse en parallèle se pratique de manière courante et la sensibilité analytique est comparable à celle des tests RIA. La principale différence réside dans le choix du marqueur qui dans ce cas se trouve être une enzyme. Les plus utilisées sont la peroxydase et la phosphatase alcaline, dont l’activité est révélée après la réaction immunologique lors d’une incubation à même le substrat conduisant à une réaction colorée [1].
La plaque ELISA est réalisée en polymère plastifié dérivé du polystyrène et est utilisée en général sans fonctionnalisation de surface, c’est-à-dire que l’une des deux espèces intervenant dans la réaction est adsorbée passivement à même la plaque. Certains utilisateurs pourtant ont envisagé l’optimisation de ce test en fonctionnalisant les plaques ELISA [2] et ainsi gagner en rendement de signal. L’intérêt des 96 puits est d’étalonner la reconnaissance de plusieurs espèces (en ligne) en divisant la concentration du ligand par 10 pour chaque espèce (en colonne). On peut ainsi mesurer certaines constantes d’interaction comme la constante d’affinité, explicitée dans la partie I-C-2-1-2. Les biomolécules marquées par une enzyme, dont l’activité est révélée par un chromophore, sont principalement utilisées en immunologie mais également en histochimie et en cytochimie afin de visualiser, à l’aide d’un microscope, la présence d’antigènes sur des tissus cellulaires. il est à noter que l’on peut remplacer le chromophore par un fluorophore (I-C).
Bilan des tests immunologiques
Les deux types de tests immunologiques dont nous venons de faire une brève présentation, offrent des avantages de choix en matière de sensibilité et de fiabilité, mais requièrent l’utilisation de marqueurs et l’analyse en parallèle n’est possible que pour la méthode ELISA. L’aspect temporel pose problème, puisqu’il faut environ une douzaine d’heures pour l’obtention des résultats sur ELISA (encore utilisée pour le dépistage du virus du SIDA), et seulement une à deux heures pour les méthodes RIA. Cet aspect temporel est si important que les biocapteurs ont presque tous évolués dans l’objectif de parvenir à des résultats en temps réel, mais nous allons voir par la suite que ce n’est pas le seul paramètre que l’on a cherché à optimiser.
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Table des matières
Introduction
Approche théorique de la transduction optique
Introduction
l-A-Etat de l’art des biocapteurs
1-A-1-Les tests immunologiques
1-A-1-1-Les tests radio-immunologiques
1-A-1-2-Les tests immuno-enzymatiques
1-A-1-3-Bilan des tests immunologiques
1-A-2-Les capteurs électriques
1-A-2-1-Les trois modes de transductions électriques
1-A-3-Les capteurs acoustiques
1-A-4-Les capteurs optiques
1-A-4-1-Biocapteurs basés sur l’ellipsométrie et la réfractométrie
1-A-4-2-Biocapteurs basés sur l’optique intégrée et
1 ‘interférométrie
1-A-4-3-Biocapteurs basés sur les plasmons de surface
1-A-4-4-Biocapteurs basés sur une détection optique indirecte
l-A-S-Conclusion
1-B-Principes du biocapteur optique
1-B-1-Introduction
1-B-2-Les difficultés de mesures
1-B-3-Introduction des ondes de surface
1-B-3-1-Choix de transducteurs pour le biocapteur optique
B-3-1-1-Rappel de la réflexion totale et de 1′ onde évanescente
B-3-1-2-0ndes électromagnétiques de surface ou plasmons de surface
B-3-1-3-Les ondes guidées
1-B-4-Analyse de la réflectivité et de la sensibilité des deux transducteurs
1-B-4-1-Étude de la sensibilité de la Résonance des Plasmons de Surface (RPS)
B-4-1-1-Introduction
B-4-1-2-Analyse de la réflectivité dans le cadre de la RPS
B-4-1-3-Analyse de la sensibilité de la RPS
B-4-1-3-1-Sensibilité liée à la résonance de RPS
B-4-1-3-2-Détection limite de la variation d’indice extérieur
B-4-1-3-3-Détection limite de la couche adsorbée
B-4-1-4-Conclusion
1-B-4-2-Étude de la sensibilité associée au miroir résonant
B-4-2-1-Principe
B-4-2-1-1-lnfluence de l’absorption sur la réflectivité
B-4-2-1-2-lnfluence des paramètres constituant le MR
B-4-2-2-Détermination de l’épaisseur optimale du guide et du milieu espaceur
B-4-2-2-1-Détermination de 1’ épaisseur optimale du guide
B-4-2-2-2-Détermination de l’épaisseur du milieu espaceur
B-4-2-2-3-Calcul de la sensibilité liée à la résonance
B-4-2-2-4-Calcul de la sensibilité liée à la variation d’indice du milieu couvrant
B-4-2-2-5-Limite de détection de la couche biologique
B-4-2-3-Conclusion
1-B-4-3-Conclusion de l’étude théorique
B-4-3-1-Comparaison des deux transducteurs
B-4-3-1-1-Points communs
B-4-3-1-2-Principales différences
B-4-3-2-Conclusion
1 -C-Protocoles expérimentaux et méthodes de quantification
1-C-1- Introduction aux dispositifs expérimentaux
1-C-1-1-Principe du montage
1-C-1-2-Particularités propres aux configurations
1-C-2-Méthodes de quantification
1-C-2-1-Quantification à partir des courbes de réflectivité
C-2-1-1-Détermination des paramètres optiques
C-2-1-1-1-Caractérisation du dispositif optique de la RPS
C-2-1-1-2-Caractérisation du dispositif optique du MR
C-2-1-1-3-Définition du taux de recouvrement
C-2-1-2-Modèles d’ajustement des cinétiques de fixation
C-1-2-1-Modèles théoriques hors équilibre
C-1-2-2-Détermination des constantes d’interactions
C-2-1-3-Estimation de l’incertitude des calculs
1-C-2-2-Quantification à partir d’une succession d’images
C-2-2-1-Réglage de la position angulaire de référence
C-2-2-2-Calcul de l’épaisseur optique moléculaire
C-2-2-3-Estimation de l’incertitude des calculs
1-C-2-3-Conclusion
Références bibliographiques du chapitre 1
II-Le matériel biologique
II-A-La reconnaissance antigène-anticorps
II-A-l-Structure de l’anticorps
11-A-2-Structure du paratope
II-A-3-Interactions impliquées dans la reconnaissance antigène-anticorps
II-A-4-Valence et affinité des anticorps
II-A-S-Anticorps monoclonaux
11-A-6-Conclusion
II-B-Les interactions entre acides nucléiques
II-B-I-Structure de l’ADN
B-1-1-La double hélice
B-1-2-L’appariement des bases
B-1-3-Les oligonucléotides
II-B-2-Hybridation et dénaturation
B-2-1-L’hybridation
B-2-2-La dénaturation
B-2-2-1-Dénaturation thermique
B-2-2-2-Dénaturation par variation de pH
II-B-3-Recherche de mutations ponctuelles
B-3-1-Méthodes de discrimination d’une mutation ponctuelle
B-3-1-1-Discrimination par comparaison de la constante d’affinité
B-3-1-2-Discrimination par variation de température
B-3-1-3-Discrimination par variation de pH
B-3-2-Méthode de localisation d’une mutation ponctuelle
II-B -4-Conclusion
II-C-Présentation des biomolécules étudiées
II-C-l-Hormones et protéines
C-I-l-L’hormone chorionique gonadotropine humaine
C-1-2-L’hormone thyroglobuline
C-1-3-L’ alpha-foetoprotéine
C-1-4-Le système avidine-biotine
C-1-5-L’albumine sérique bovine
II-C-2-Séquences oligonucléotidiques et leurs caractéristiques
II-D-Les différentes voies d’immobilisation
II-D-l-L’adsorption passive
II-D-2-Immobilisation covalente d’anticorps à l’aide d’un ancrage chimique
II-D-3-Le système avidine-biotine
II-D-4-Immobilisation covalente d’oligonucléotides à l’aide d’un polymère conducteur
II-E-Conclusion
Références bibliographiques du chapitre II
III-Validations expérimentales de l’intérêt des biocapteurs optiques en immunologie et en biologie moléculaire
III-A-Etude expérimentale comparant la sensibilité analytique du MR et de la RPS : Le capteur à un paramètre
III-A-l-Reconnaissance de l’hCG par la méthode de la RPS
111-A-1-1-Expériences menées au laboratoire
A-l-I-l-Protocole des expériences
A-1-1-2-0uantification et interprétation des expériences
111-A-1-2-Expériences menées sur le Biacore
A-1-2-1-Protocole des expériences
A-1-2-2-Quantification et interprétation des résultats
111-A-1-3-Conclusion
111-A-2-Reconnaissance de l’bCG par la méthode du MR
111-A-2-1-Protocole expérimental
111-A-2-2-Quantification et interprétation des résultats
111-A-3-Conclusion
111-B-Vers le capteur multiparamétrique
111-B-1-Immobilisation des anticorps
111-B-1-1-Préparation du capteur
111-B-1-2-Quantification de l’adsorption des anticorps
111-B-2-Reconnaissance spécifique des antigènes
111-B-3-Discussion
111-B-4-Conclusion
111-C-Etude des voies d’immobilisation de brins d’ADN: Vers l’hybridation en parallèle
III-C-l-Immobilisation d’ADN via le système avidine-biotine
111-C-1-1-Préparation du capteur
C-l-I-l-Adsorption passive de l’ avidine
C-1-1-2-Fixation covalente de l’avidine
111-C-1-2-Hybridation d’oligonucléotides
C-1-2-1-Cas de l’adsorption passive d’avidine
C-1-2-2-Cas de la fixation covalente de l’avidine
111-C-2-Immobilisation d’ADN à l’aide de polypyrrole
111-C-2-1-Caractérisation optique du polypyrrole
C-2-1-1-Détermination de l’indice de réfraction du polypyrrole
C-2-1-2-Analyse de l’homogénéité du polypyrrole
111-C-2-2-0ptimisation de l’immobilisation de brins d’ADN
C-2-2-1-0ptirnisation de 1 ‘épaisseur du co polymère
C-2-2-1-1-Lirnitation de l’épaisseur des plots due à l’absorption du polypyrrole
C-2-2-1-2-Choix de l’épaisseur optimisant le signal d’hybridation
C-2-2-3-0ptimisation de la densité de surface des sondes d’ADN
C-2-2-3-1-Etablissement des facteurs limitants 1’ hybridation
C-2-2-3-2-Choix du ratio optimisant le signal d’hybridation
C-2-2-4-Conclusion
111-C-2-3-Vers l’hybridation en parallèle
C-2-3-1-La spécificité du capteur
C-2-3-2-Régénération du capteur
C-2-3-3-Sensibilité analytique du capteur
111-C-2-4-Conclusion
III-D-Détection de mutations ponctuelles
III-D-l-Détection de mutations sur des 15-mers synthétiques
111-D-1-1-Préparation des capteurs à plusieurs paramètres
111-D-1-2-Discrimination des mutations par détermination des constantes d’affinité
D-2-1-Détections multiparamétriques d’interactions spécifiques et croisées
111-D-1-3-Conclusion
Références bibliographiques du chapitre III
Conclusion générale
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