ETUDE DE L’ACTIVITE DES INVERTASES ACIDES 

ETUDE DE L’ACTIVITE DES INVERTASES ACIDES 

REPARTITION DES CARBOHYDRATES ET ACTIVITES INVERTASES EN FONCTION DE L’INTENSITE DU STRESS HYDRIQUE

CONDITIONS DE CULTURE ET METHODES GENERALES

L’étude est réalisée sur deux génotypes de riz en phase végétative : IR64 et Azucéna cultivés en serre (Annexe 6). L’expérimentation comporte une phase irriguée suivie d’une phase non irriguée à partir de l’apparition de la sixième feuille du brin maître. Les pots qui subissent le stress hydrique sont fermés hermétiquement et placés sur des balances automatisées afin de suivre l’évolution de la fraction d’eau transpirable du sol (FTSW), ratio caractérisant le degré d’avancement du stress.
FTSW = ASW (Eau du sol réellement disponible) / TTSW (Eau maximale disponible dans le sol pour la transpiration).
Les glucides solubles et l’amidon sont quantifiés sur des échantillons de limbes et de feuilles en croissance (puits) prélevés à quatre dates correspondant à des FTSW comprises entre 1 (pas de stress hydrique : plantes témoins) et 0 (état critique de stress hydrique) pour suivre la cinétique de répartition des assimilats au cours de l’installation du stress. Les activités invertases ont été dosées aux mêmes dates sur les limbes uniquement car pour les feuilles puits le matériel végétal était insuffisant.
Les teneurs en glucides comme les activités invertases sont exprimées en pourcentage de la moyenne de trois plantes témoins prélevées à la même date.

EXTRACTION ET DOSAGE DES SUCRES SOLUBLES ET DE L’AMIDON

Extraction des sucres solubles

Les échantillons sont prélevés par dissection de la plante suivant les différents organes étudiés : limbes sources, feuilles puits ou gaines, placés dans des piluliers et immédiatement conservés dans l’azote liquide avant d’être stockés au congélateur à -30°C.
Les échantillons sont broyés dans un broyeur à billes puis séchés à l’étuve à 65° C pendant deux heures. 10 à 30 mg de matière sèche sont pesées puis placées dans un micro – tube.
L’extraction se fait par l’ajout de 1 mL d’éthanol 80 % (v/v) pendant trente minutes au bain marie à 80° C. L’échantillon est centrifugé à 10 000 g puis le surnageant est récupéré.
Le culot est repris dans l’éthanol 80 % et centrifugé, puis l’opération est répétée avec de l’éthanol 50 %. Il est une dernière fois repris dans 0,5 mL d’éthanol 80 % avant d’être congelé dans l’attente du dosage de l’amidon.
Les surnageants sont filtrés sur une mini – colonne contenant du PVPP et du charbon actif afin d’éliminer les pigments et les polyphénols. La colonne est lavée à deux reprises avec 0,5 mL d’éthanol 80 %. Le filtrat est récupéré puis évaporé avec un évaporateur sous vide (Jouan RC-1022) pendant cinq heures et repris dans 1 mL d’eau ultra pure. L’échantillon est congelé en attendant le dosage des sucres solubles.

Dosage des sucres solubles et de l’amidon

Dosage des sucres solubles

Le dosage des sucres solubles (glucose, fructose et saccharose) est réalisé par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en ampérométrie pulsée de type Dionex (Annexe 7). L’ HPLC est étalonnée à l’aide de six solutions standards de glucose, fructose et saccharose de concentrations comprises entre 1 et 50 mg/L. Les échantillons décongelés sont dilués dans de l’eau ultra – pure (10 à 50 fois). Un volume de 10 µL d’échantillon dilué est injecté sur la colonne et est élué par de la soude (NaOH) 150 mM avec un débit d’élution de 1 mL/min. Régulièrement, les solutions standards ainsi qu’un étalon biologique (du jus d’orange Joker dilué 2000 fois) sont intercalés entre les échantillons pour pouvoir remédier à toute dérive au cours d’une série d’analyses qui dure plusieurs heures.

Dosage de l’amidon

Le dosage de l’amidon est réalisé sur les culots stockés au congélateur (Annexe 7). Ce dosage consiste à hydrolyser l’amidon solubilisé en glucose par l’amyloglucosidase puis à quantifier le glucose par spectrophotométrie dans les mêmes conditions que lors du dosage de l’invertase (Figure 8). Le résultat est exprimé en mg équivalent glucose/g de matière sèche.

DOSAGE DES ACTIVITES INVERTASES VACUOLAIRES ET PARIETALES

Les échantillons de limbes sont prélevés en suivant le même protocole que pour le dosage des assimilats. Après stockage à – 30 °C, les activités invertases vacuolaires et pariétales sont évaluées sur des échantillons à partir de 120 mg environ de matière fraîche pesée précisément et 600 µL de tampon d’extraction en suivant le protocole décrit plus haut.

RESULTATS

ETUDE DES INVERTASES ACIDES

Cette expérimentation a pour but d’optimiser la méthode de quantification des activités invertases acides et de mieux comprendre leurs conditions de fonctionnement. Les activités spécifiques sont exprimées en nmol de glucose/min/mg de protéines afin de pouvoir comparer entre eux les résultats.

ETUDES CINETIQUES

Les études cinétiques ont été essentiellement accomplies sur l’invertase vacuolaire car au vu de la littérature, l’invertase pariétale a des caractéristiques cinétiques très proches
(Kock, 2004) (Winter et Huber, 2000) (Tymowska – Lalanne et Kreis, 1998) (Sturm, 1999). La linéarité de la réaction en fonction du temps a été évaluée à partir d’un échantillon de limbe. Nous observons que l’activité en nmoles/mg de protéines est proportionnelle au temps d’incubation (Figure 9). Ainsi un temps d’incubation de 60 minutes a été utilisé pour la suite des expérimentations. En effet, les absorbances mesurées sont suffisamment importantes pour une bonne sensibilité du dosage tout en se situant dans la zone de linéarité entre activité et temps d’incubation.

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Table des matières

I.INTRODUCTION
A. MISSION ET ORGANISATION DU CIRAD 
B. CONTEXTE GENERAL DE L’ETUDE
1. Problématique – cadre de l’etude
2. Etat de l’art
3. Objectif du stage
II. MATERIELS ET METHODES
A. ETUDE DE L’ACTIVITE DES INVERTASES ACIDES 
1. Conditions de culture du riz
2. Extraction et dosage des proteines
3. Dosage des activités invertases vacuolaires et parietales
4. Etudes cinétiques
5. Influence du mode de preparation de l’echantillon
6. Influence des conditions de stockage des echantillons apres prelevement
B. REPARTITION DES CARBOHYDRATES ET ACTIVITES INVERTASES EN FONCTION DE L’INTENSITE DU STRESS HYDRIQUE 
1. Conditions de culture et méthodes generales
2. extraction et dosage des sucres solubles et de l’amidon.
3. Dosage des activites invertases vacuolaires et parietales
III. RESULTATS 
A. ETUDE DES INVERTASES ACIDES 
1. Etudes cinetiques
2. Influence du mode de preparation de l’echantillon
3. Influence du mode de stockage des echantillons
B. INFLUENCE DU STRESS HYDRIQUE SUR LA REPARTITION DES ASSIMILATS ET LES ACTIVITES INVERTASES ACIDES 
1. Les sucres solubles
2. L’amidon
3. Les invertases acides dans les limbes
IV. DISCUSSION
OPTIMISATION DES CONDITIONS DE DOSAGE DES ACTIVITES INVERTASES
INFLUENCE DU STRESS HYDRIQUE SUR LE METABOLISME GLUCIDIQUE
Comparaison IR64 – Azucéna
Adaptation de la plante au stress hydrique
V. CONCLUSION
VI. BIBLIOGRAPHIE ET WEBOGRAPHIE
VII. ANNEXES 
ANNEXE 1 : PROTOCOLE D’EXTRACTION DES PROTEINES ET DES INVERTASES
ANNEXE 2 : PROTOCOLE DE DOSAGE DES PROTEINES TOTALES
ANNEXE 3 : PROTOCOLE DE DOSAGE DES ACTIVITES INVERTASES 
ANNEXE 4 : ELEMENTS DE CINETIQUE ENZYMATIQUE
ANNEXE 5 : PROTOCOLE DE PURIFICATION DE L’EXTRAIT 
1. Précipitation par sulfate d’ammonium à 80% de saturation
2. Purification par passage sur colonne sephadex G25
ANNEXE 6 : PROTOCOLE GENERAL DE L’ETUDE DU STRESS HYDRIQUE
ANNEXE 7 : PROTOCOLE DE DOSAGE DES SUCRES SOLUBLES ET DE L’AMIDON
1. Dosage des sucres solubles
2. Dosage de l’amidon

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