Etude de l’activité antipaludique et immunomodulatrice deT. albida Dubréka

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Cycle biologique du parasite

Les recherches entreprises ces dernières années pour mettre au point de nouveaux médicaments et des vaccins antipaludiques ont considérablement enrichi la connaissance de la biologie du parasite. Le cycle de vie du parasite se déroule chez deux hôtes : l’homme ou hôte intermédiaire (phase asexuée ou schizogonies), et le moustique du genre anophèle ou hôte définitif (phase sexuée ou sporogonie). Chez l’homme, ce cycle se déroule également en deux phases : une phase hépatique ou pré-érythrocytaire (asymptomatique) et une phase sanguine ou intra-érythrocytaire.

Phase asexuée chez l’Homme

Phase intra-hépatique ou pré-érythrocytaire

Par sa salive, l’anophèle femelle inocule les parasites sous forme de sporozoïtes dans la peau de l’hôte (Figure 4). De nombreux sporozoïtes envahissent les hépatocytes où ils se multiplient par divisions cellulaires pendant 6 à 7 jours pour former des schizontes. Cette phase pré-érythrocytaire est asymptomatique et obligatoire. A maturité, les schizontes hépatiques se lisent et libèrent des mérozoïtes dans la circulation, et c’est ainsi que commence la phase érythrocytaire.
Pour certaines espèces (P. ovale, P. vivax), l’infection hépatique peut devenir latente (formes hypnozoïtes) et permettre au parasite de survivre longtemps dans l’organisme. Ces formes latentes sont à l’origine des récidives qui peuvent survenir des semaines, voire des années plus tard (Vaughan et al., 2008; White et al., 2014).

Phase intra-érythrocytaire : schizogonie endoérythrocytaire

Après leur libération dans la circulation, les mérozoïtes hépatiques vont rapidement envahir les érythrocytes et résider dans des vacuoles parasitophores où ils vont initier leur maturation (Cowman and Crabb, 2006). Peu de temps après l’invasion, les mérozoïtes se différencient en trophozoïtes et se multiplient par reproduction asexuée appelée schizogonie. A ce stade, le parasite se nourrit du contenu des globules rouges pour son développement. Il modifie la membrane cellulaire de ces derniers en y insérant des protéines parasitaires pour découper l’hémoglobine et détoxifie par polymérisation les produits de dégradation tels que l’hème sous forme des cristaux inertes appelés hémozoïne (White et al., 2014). Pour la suite du cycle, le trophozoïte entame une série de mitoses jusqu’à la formation d’un schizonte mature (rosace) qui éclate en rompant la membrane du globule rouge pour libérer, selon l’espèce, de 8 à 32 mérozoites (Cowman and Crabb, 2006). Les mérozoïtes libérés vont parasiter d’autres globules rouges et le cycle asexué recommence. Les manifestations cliniques apparaissent à cette phase, notamment l’anémie, la fièvre et des vomissements (Bartoloni and Zammarchi, 2012; White, 2018). Ce cycle érythrocytaire est de 24 heures pour P. knowlesi, de 48 heures pour P. falciparum, P. vivax et P. ovale (fièvre tierce) et de 72 heures pour P. malariae (fièvre quarte). Après plusieurs cycles schizogoniques, certains trophozoïtes asexués, sous l’effet du stress, se différencient en gamétocytes mâles et femelles et circulent hors des hématies dans la circulation sanguine (White et al., 2014).

Phase sexuée chez l’anophèle

Lors de son repas sanguin chez une personne impaludée (Figure 4), l’anophèle femelle ingère des gamétocytes à potentiel sexuel mâle et femelle. Dans la lumière intestinale du moustique, la différenciation de ces gamétocytes en gamètes est favorisée par la présence d’acide xanthurenique (issu du métabolisme du tryptophane du moustique), une diminution de température d’environ 5°C et d’un pH basique. Ainsi, les gamétocytes femelles se transforment en macrogamètes tandis que les gamétocytes mâles répliquent leur génome en trois cycles passant d’haploïde à octaploïde pour donner 8 microgamètes flagellés selon le processus appelé exflagellation (Bennink et al., 2016; Sologub et al., 2011). La fécondation d’un macrogamète par un microgamète donne naissance à un zygote (diploïde) qui se développe ensuite pour former un ookinète mobile. Cet ookinète traverse la paroi de l’estomac pour se loger dans la couche laminaire basale en formant un oocyste à l’intérieur duquel s’individualisent les sporozoïtes. A maturité, l’oocyste éclate et libère des milliers de sporozoïtes qui vont migrer pour gagner les glandes salivaires en vue de leur dissémination dans un hôte humain lors du prochain repas sanguin (Vlachou et al., 2006).

Paludisme gestationnel

Le paludisme associé à la grossesse repose sur des parasites de P. falciparum qui ont une affinité pour le récepteur placentaire chondroitin sulfate A (CSA). L’interaction hôte parasite via CSA permet une accumulation des globules rouges parasités qui gênent la circulation materno-fetale (Beeson et al., 2002). Ainsi, le paludisme gestationnel est associé à l’anémie maternelle et à l’issue défavorable de la grossesse qui se manifeste par un avortement spontané, la prématurité, le faible poids de naissance du nourrisson et à la morbi-mortalité néonatale (Bardají et al., 2011; Menendez, 1995).

Diagnostic biologique

Entant donné que le diagnostic clinique reste souvent difficile en raison de la nature non spécifique des signes et symptômes liés au paludisme, le diagnostic biologique constitue un volet important dans la prise en charge correcte des patients.

Goutte épaisse et frottis sanguin

La goutte épaisse ainsi que les frottis sanguins minces représentent les méthodes de référence pour le diagnostic biologique du paludisme. Le frottis épais est une technique de concentration qui consiste à examiner environ 2 µl de sang sur une surface moins étendue et colorée au May Grümwald Giemsa pour l’identification du parasite. Cette technique est souvent utilisée en cas 22 de faible densité parasitaire pour une meilleure sensibilité. Cependant, sa réalisation reste un peu délicate en raison de la lyse des globules rouges lors de la coloration, ce qui nécessite une expertise pour le lecteur au microscope (Moody, 2002). En ce qui concerne le frottis mince, il est obtenu par étalement d’une goutte de sang sur lame colorée au May Grümwald Giemsa. De ces deux techniques, le frottis sanguin est la méthode largement utilisée en raison de sa simplicité, son intérêt pour identifier l’espèce infectante et l’évaluation de la densité parasitaire (Berry et al., 2009; Durieux, 2018). Toutefois, cette méthode peut également être mise en cause en cas de parasitémie faible.

Quantitative Buffy Coat (QBC malaria test®)

Ce test a été mis au point afin d’améliorer l’examen microscopique et simplifier les tests du diagnostic biologique. Il consiste à concentrer le sang du patient dans un tube à hématocrite contenant un anticoagulant ainsi qu’un colorant fluorescent (acridine orange) permettant de colorer l’ADN du parasite. Le tube est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 12 000 g et lu au microscope à épi-fluorescence (Chotivanich et al., 2007). La détection d’un signal fluorescent vert vif dénote la présence de noyaux parasitaires, le cytoplasme apparaissant en jaune-orange. Bien que cette technique soit rapide et simple, elle est limitée en raison de la faible spécificité de la technique (Moody, 2002).

Test de diagnostic rapide (TDR)

Le principe de ce test est basé sur la détection d’un antigène parasitaire au stade érythrocytaire et gamétocyte immature par chromatographie d’une goutte de sang sur une membrane contenant des anticorps spécifiques. Les principaux antigènes recherchés sont l’Histidine-Rich Protein 2 (HRP-2), le lactate déshydrogénase (LDH) et/ou l’aldolase. La plupart des anticorps ciblent les protéines spécifiques de P. falciparum notamment HRP2 ou la LDH (Berry et al., 2009). Les TDR ont également montré une efficacité pour le diagnostic des infections à P. vivax (Kim et al., 2008). Cependant, les TDR nommés « pan » communs aux 4 Plasmodiums pp restent moins sensibles pour l’identification des parasites.

Diagnostic moléculaire

La faible sensibilité ainsi que la non spécificité de la plupart des méthodes conventionnelles ont rendu nécessaire la mise au point de nouvelles techniques afin de poser un diagnostic fiable dans la recherche du paludisme pour une meilleure prise en charge. Le développement récent du diagnostic moléculaire a permis une caractérisation plus poussée du parasite.

Technique de Polymerase chain Reaction (PCR)

La PCR est basée sur l’amplification exponentielle in vitro de l’ADN plasmodial en présence d’amorces spécifiques. Elle a la capacité de détecter le parasite à de très faibles concentrations parasitaires et de spécifier les quatre espèces même en cas d’infection mixte (Looareesuwan et al., 2005; Safeukui et al., 2008). Elle est également utilisée pour vérifier le développement de la pharmaco-résistance d’un médicament (Chotivanich et al., 2007). C’est la technique la plus sensible et la plus spécifique pour la recherche du paludisme. Cependant, de nombreux facteurs limitent l’utilité de cette technique, entre autres la nécessité d’un personnel qualifié pour sa réalisation, un délai de rendu des résultats incompatibles avec un diagnostic d’urgence, et le coût élevé de l’équipement pour une application systématique dans les pays à revenu faible.

Technique Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

C’est la technique de biologie moléculaire alternative mise en œuvre pour pallier aux limites de la PCR. Peu couteuse et rapide, LAMP permet également l’amplification d’ADN dans les conditions isothermiques. Dans une étude d’évaluation de la méthode associée au séquenceur MinION™, la capacité potentielle de LAMP dans le diagnostic complet du paludisme a été démontrée avec une sensibilité et spécificité similaire à la PCR. En effet, la méthode utilise un ensemble de quatre amorces spécialement conçues qui reconnaissent six séquences distinctes sur l’ADN cible et s’appuie sur une procédure d’auto-cycle dans des conditions isothermiques. Néanmoins, bien que cette méthode soit facile à réaliser avec un rendu rapide des résultats et un coût inférieur à celui de la PCR, il est nécessaire de l’optimiser sur de grands échantillons afin de garantir son efficacité (Imai et al., 2017). Par ailleurs, d’autres techniques notamment la spectroscopie de masse, le dosage par cytométrie en flux et la sérologie sont également utilisées dans le diagnostic biologique. Néanmoins, seules les méthodes traditionnelles (microscopie optique et TDR) sont utilisées en première intention dans les pays en voie de développement malgré les carences liées à ces techniques.

Luttes anti-vectorielles

La lutte anti vectorielle fait partie intégrante des programmes de lutte contre le paludisme. Différentes techniques de lutte ont été recommandées par l’OMS dans les pays endémiques. Au premier rang de ces techniques figurent la lutte anti- larvaire, la lutte contre les vecteurs au stade adulte (imagocide) et la réduction du contact homme-vecteur. Ces techniques seront développées succinctement ci-après.

La lutte anti-larvaire

La lutte anti-larvaire nécessite la connaissance des rapports hôte-vecteur. Son application n’est considérée efficace que si la majorité des gîtes larvaires sont peu nombreux, fixes, localisables et traitables dans une zone par rapport à la communauté à protéger (OMS, 2013). Les principales méthodes de lutte contre les larves comprennent :
✓ La méthode physique
La méthode physique consiste à créer des conditions défavorables à la reproduction des vecteurs, telle que la modification permanente de l’environnement (remblais, drainages, assèchement des zones marécageuses par la plantation d’arbres avides d’eau, destruction des gîtes larvaires) ou sa manipulation temporaire (canaux d’irrigations, modifications de la salinité, éclaircissement de la végétation dans les cours d’eau).
✓ La méthode chimique
Il s’agit de traiter les gîtes larvaires avec des larvicides dans le but de réduire le nombre de larves et de nymphes (OMS, 2013). Cette méthode est complémentaire à la gestion de l’environnement.
✓ La méthode biologique
L’apparition de la résistance aux insecticides a rendu nécessaire la conception de nouveaux outils. A cet effet, un intérêt accru s’est développé pour la mise en œuvre alternative et intégrée de méthodes de lutte anti-vectorielles incluant la lutte biologique. La lutte biologique consiste à introduire dans les habitats aquatiques des prédateurs provoquant un stress pendant le développement aquatique des larves qui vise à atténuer leur capacité de transmission au stade adulte (Abagli et al. 2019; Kamareddine 2012; OMS, 2013).
✓ La méthode génétique
Elle consiste à modifier le patrimoine génétique des moustiques dans le but de produire une progéniture qui ne puisse pas transmettre la maladie (Fuchs et al., 2013; OMS, 2013). Cependant, cette méthode a été mise en cause par certains chercheurs (Wilke and Marrelli, 2015) selon lesquels une souche de moustique transgénique est indispensable pour chaque espèce cible, ce qui rend ces stratégies difficiles à mettre en œuvre pour une lutte efficace dans un contexte incluant plusieurs espèces de moustique vectrices du paludisme. Une méthode alternative consiste en la modification du microbiote intestinal des moustiques par l’introduction de bactéries génétiquement modifiées qui limitent la capacité vectorielle des moustiques.

Lutte contre les vecteurs au stade adulte

La lutte contre les vecteurs au stade adulte est basée sur l’utilisation d’insecticides et reste le principal outil de prévention du paludisme. Pour éradiquer les moustiques dans les zones endémiques, deux méthodes principales sont recommandées par l’OMS (OMS, 2013). Il s’agit de :
✓ La pulvérisation intra domiciliaire à effet rémanent
Elle consiste à appliquer les insecticides sur les surfaces intérieures des habitations pour réduire la capacité vectorielle des vecteurs endophiles (qui se reposent de préférence à l’intérieur des habitations après avoir pris un repas de sang). Les principaux composés synthétiques utilisés appartiennent aux groupes des organochlorés (DDT, dieldrine), des organophosphorés (malathion), des carbamates (bendiocarbe) ou des pyréthrinoïdes (deltaméthrine).
✓ La pulvérisation spatiale
Utilisée en cas d’urgence (épidémie), cette méthode consiste à pulvériser l’extérieur par dispersion d’insecticide dans l’air en vue de détruire les moustiques exophiles.

Réduction du contact homme-vecteur

La réduction du contact homme-vecteur se fait au moyen des moustiquaires imprégnées (MII) ou à imprégnation durable (MID) qui constituent une mesure efficace dans la réduction générale de l’intensité de la transmission. En outre, il existe des méthodes complémentaires notamment les répulsifs, les vêtements protecteurs et les spirales à diffuseur anti-moustique (OMS, 2013). Malgré les progrès indéniables réalisés grâce à l’utilisation de ces outils essentiels, la résistance des vecteurs aux insecticides rend ces mesures de moins en moins efficaces et a conduit à l’échec des programmes de lutte antivectorielle (Matiya et al., 2019; de Sousa et al., 2019; 1et al., 2013).

Lutte antiplasmodiale

La lutte antiplasmodiale repose sur l’utilisation des médicaments à activité inhibitrice de la croissance des parasites. Les antipaludiques peuvent être utilisés dans un but préventif ou curatif. Ces médicaments sont constitués soit de molécules naturelles (quinine, artémisinine), soit de molécules de synthèse dérivées de la quinine et de l’artémisinine. En revanche, le développement de la résistance de P. falciparum vis-à-vis des antipaludiques en général et de la chloroquine en particulier, constitue un problème majeur dans le traitement de l’infection. Ainsi, bien que la stratégie actuelle reposant sur l’utilisation des ACT a permis une diminution nette du nombre de cas de paludisme au cours de la dernière décennie, P. falciparum s’adapte en permanence et développe des mécanismes de résistance qui menacent l’efficacité de ces combinaisons (Nsanzabana, 2019).

Les antipaludiques Naturels

Les molécules antipaludiques naturelles ont été isolées à partir des plantes issues de la pharmacopée sud-américaine et chinoise telles que Cinchona officinalis et Artemisia annua respectivement.

Quinine

Isolée à partir d’écorce de quinquina (genre Cinchona, Famille des Rubiaceae) en 1820 par Peletier et Cavantou, la quinine est un alcaloïde de la série quinoléique (Figure 5). Son mécanisme d’action n’est que partiellement connu. En effet, elle a une action schizonticide en s’accumulant dans la vacuole digestive du parasite inhibant ainsi la détoxification de l’hème, un processus essentiel du parasite (Petersen et al., 2011). Cette molécule est la plus ancienne des antipaludiques et a été largement utilisée dans les formes sévères et non compliquées en raison de son absorption rapide par voie orale ou parentérale (Achan et al., 2011). Son pic plasmatique est atteint entre 2 à 3 heures après administration et sa demi-vie est de 10 à 12 heures (Dorosz, 2015). A ce jour, elle joue un rôle alternatif dans le traitement du paludisme grave dans les cas où l’artésunate, dérivé de l’artéminine, n’est pas disponible.

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Table des matières

Introduction générale
I. Généralités
1. Définition du paludisme et historique
2. Prévalence et épidémiologie
3. Parasite et agent vecteur
3.1. Agent pathogène
3.1.1. Plasmodium falciparum
3.1.2. Plasmodium vivax
3.1.3. Plasmodium ovale
3.1.4. Plasmodium malariae
3.1.5. Plasmodium knowlesi
3.2. Agents vecteurs
4. Cycle biologique du parasite
4.1. Phase asexuée chez l’Homme
4.1.1. Phase intra-hépatique ou pré-érythrocytaire
4.1.2. Phase intra-érythrocytaire : schizogonie endoérythrocytaire
4.2. Phase sexuée chez l’anophèle
5. Diagnostic clinique et biologique du paludisme
5.1. Diagnostic clinique
5.1.1. Paludisme simple
5.1.2. Paludisme grave
5.1.3. Paludisme gestationnel
5.2. Diagnostic biologique
5.2.1. Goutte épaisse et frottis sanguin
5.2.2. Quantitative Buffy Coat (QBC malaria test®)
5.2.3. Test de diagnostic rapide (TDR)
5.3. Diagnostic moléculaire
5.3.1. Technique de Polymerase Chain Reaction (PCR)
5.3.2. Technique Loop-Mediated Isothermal Amplification
6. Luttes antivectorielles
6.1. Lutte anti larvaire
✓ La méthode physique
✓ La méthode chimique
✓ La méthode biologique
✓ La méthode génétique
6.2. Lutte contre les vecteurs au stade adulte
✓ La pulvérisation intra-domiciliaire à effet rémanent
✓ Pulvérisation spatiale
6.3. Réduction du contact homme-vecteur
7. Lutte antiplasmodiale
7.1. Les antipaludiques naturels
7.1.1. Quinine
7.1.2. Artémisinine
7.2. Les antipaludiques de synthèse
7.2.1. Dérivés de la quinine
Les 4-aminoquinoléines
Les 8-aminoquinoléines
Les aryl-amino-alcools
7.2.2. Les inhibiteurs des acides nucléïques
Les antifolates
Les antibiotiques
7.2.3. Dérivés de l’artémisinine
8. Les différents types de prise en charge
8.1. La prévention pour les voyageurs
8.2. La prévention des populations vivant en zone d’endémie
8.3. Traitement curatif du paludisme non compliqué
8.4. Traitement chez la femme enceinte
8.5. Traitement du paludisme grave
9. Résistance des parasites aux antipaludiques
II. Pathogénèse et immunité anti palustre
1. Physiopathologie générale du paludisme à P. falciparum
2. Pathogénèse du neuropaludisme (ou paludisme cérébral)
3. Modèles murins de paludisme
3.1. Modèles de paludisme simple
3.2. Modèles de neuropaludisme
4. Imunité antipalustre
4.1. Immunité innée
4.1.1. Monocytes/macrophages
✓ Polarisation des macrophages
✓ Implication des monocytes/macrophages dans la réponse antipalustre
4.1.2. Cellules dendritiques
4.1.3. Cellules Natural Killers (NK)
4.1.4. Cellules Natural Killer T (NKT)
4.1.5. Lymphocytes Tγδ
4.2. Immunité adaptative
4.2.1. Immunité à médiation cellulaire
Rôle des lymphocytes T CD4
Rôle des lymphocytes T CD8
Rôle des cytokines dans le paludisme
✓ Le TNF
✓ L’IFNγ
✓ L’IL-12
✓ L’IL-10 et le TGFβ
4.2.2. Immunité à médiation humorale
III. Paludisme et Médecine traditionnelle en Afrique de l’Ouest
1. Définition de la médecine traditionnelle
2. Méthodes d’évaluation de l’activité de plantes antipaludiques
✓ L’approche ethnopharmacologique
✓ L’approche par sélection chimiotaxonomique
3. Médecine traditionnelle et plantes antipaludiques utilisées en Afrique de l’Ouest
3.1. Au Nigéria
3.2. Au Mali
3.3. Au Ghana
3.4. Au Burkina Faso
3.5. Au Bénin
3.6. En Côte d’Ivoire
3.7. Au Togo
3.8. Au Niger et Sénégal
4. Exemple de plantes consommées sous forme de Médicaments Traditionnels Améliorés (MTA)
5. Le cas de la Guinée
5.1. Données géographiques
5.2. Prévalence et épidémiologie du paludisme en Guinée
5.3. Paludisme et médecine traditionnelle en Guinée
IV. Travaux personnels
Chapitre 1 : Etude de l’activité antipaludique de trois plantes issues de la médecine traditionnelle guinéenne
1. Introduction
2. Matériel et Méthodes
2.1. Matériel végétal
2.2. Matériel biologique
2.3. Matériel animal
2.4. Méthode d’extraction
2.5. Prélèvement des macrophages et test de cytotoxicité in vitro des extraits
2.6. Activité antiplasmodiale in vitro
2.7. Activité antipaludique in vivo
2.8. Analyses statistiques
3. Résultats
3.1. Activité in vitro antiplasmodiale et cytotoxicyté des extraits
3.2. Evaluation in vivo de l’activité des extraits de plantes contre les souches P. chabaudi chabaudi (Pcc) et P. berghei ANKA (PbA)
3.3. Effet des extraits de plantes sur le poids des souris infectées avec Pcc et PbA
4. Discussion
5. Conclusion
Chapitre 2 : Etude de l’activité antipaludique et immunomodulatrice deT. albida Dubréka
1. Introduction
2. Matériel et méthodes
2.1. Toxicité aiguë
2.2. Activité antiplasmodiale in vivo
2.3. Mise en évidence des populations cellulaires par cytométrie en flux
2.4. Expression génique de marqueurs pro- et anti-inflammatoires dans le cerveau des souris
2.5. Niveaux de cytokines dans les cerveaux des souris
2.6. Expression génique de marqueurs pro- et anti-inflammatoires par des macrophages murins après activation in vitro au LPS/IFNγ
2.7. Niveaux de cytokines produites par les macrophages murins activés in vitro au LPS/IFN
2.8. Modèle in vitro de production de ROS et activité anti-oxydante de Terminalia albida
2.9. Analyse UHPLC-HRMS
2.10. Analyses statistiques
3. Résultats et discussion
Chapitre 3 : Etude déréplicative des échantillons de T. albida
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
2.1. Equipement d’UHPLC-HRMS
2.2. Conditions d’analyse
2.3. Traitement des données et analyse statistique
3. Résultats et discussion
Chapitre 4 : Etude botanique des échantillons de Terminalia albida Scott-Elliot (Combretaceae)
1. Introduction
2. Matériel et Méthode
2.1. Analyse macroscopique
2.2. Analyse microscopique
2.2.1. Section transversale
2.2.2. Drogue pulvérisée
3. Résultats
3.1. Description macroscopique
3.2. Description microscopique des coupes transversales d’écorce de tige
3.3. Description microscopique de la poudre des écorces de tige
4. Discussion et Conclusion
V. Conclusion et perspectives
Références

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