Etude de la sensibilité aux carbapénèmes des bacilles à Gram négatif

Pseudomonas aeruginosa

     Communément appelé bacille pyocyanique (mot grec : bacille agent du pus bleu), c’est la principale espèce du genre Pseudomonas de par sa fréquence et sa présence dans de nombreuses niches écologiques (eaux, végétaux, sols). C’est un petit bacille fin, à Gram négatif, mobile grâce à une ciliature de type polaire monotriche en « vol de moucheron », oxydase positive. La culture de P aeruginosa sur gélose au sang TSA, est caractérisée par une odeur aromatique et la production de pigments (pyocyanine, pyoverdine). Sur le milieu Kligler-Hajna, on observe le brunissement de la pente et l’aspect métallisé de la culture [7]. P. aeruginosa est le type même des bactéries opportunistes pathogènes chez l’immunodéprimé ou après un traumatisme grave ou chez les brûlés. Les souches plus particulièrement pathogènes sont productrices de :
– cytotoxine nécrosante ;
– exotoxines protéiques (A, S, TetU) [41]

Mécanisme d’action et activité in vitro

      De même que les autres β-lactamines, les carbapénèmes ont une activité bactéricide par inhibition des PLP (« protéines liant les pénicillines ») ancrées dans la membrane cytoplasmique de la bactérie. Les PLP sont des enzymes, de type transpeptidases et carboxypeptidases, dont le rôle physiologique est de synthétiser le peptidoglycane, élément essentiel de la paroi bactérienne. Des autolysines détruisent le peptidoglycane et permettent l’élongation et la scission des bactéries, à l’origine de l’arrêt de la synthèse du peptidoglycane et donc la lyse de la paroi et la destruction de la bactérie. Leurs cibles privilégiées sont les PLP1a, 1b et 2, de haut poids moléculaire [19].Les aminopénicillines et céphalosporines se lient à la PLP3, ce qui a pour conséquence une lyse bactérienne sans filamentation préalable en présence de carbapénèmes, ainsi qu’une libération moindre d’endotoxines [19]. La résistance bactérienne est la capacité d’une bactérie à résister aux effets des antibiotiques. La résistance aux agents antimicrobiens est définie comme la capacité d’un micro-organisme à résister à l’action inhibitrice d’antibiotiques auxquels il était jusque-là sensible. Cette résistance est un facteur majeur compliquant le traitement et la dissémination dessouches multirésistantes.

Mécanisme de résistance enzymatique : Les carbapénémases

     Les carbapénèmases décrites chez les entérobactéries appartiennent aux quatre classes connues de B-lactamases (classe A, B, C, D de la classification de Ambler). Actuellement, les plus importantes en microbiologie clinique sont les Bétalactamases de type KPC (classe A), les métallobétalactamases (classe B) de type VIM, IMP et plus récemment NDM, et les Oxacillinase (classe D) de type OXA-48 largement majoritaires actuellement en France [7]. L’enzyme en modifiant le noyau actif de l’antibiotique par clivage ou par addition d’un groupement chimique, empêche la fixation de l’antimicrobien sur sa cible et provoque une perte d’activité. Parmi les réactions biochimiques catalysées par ces enzymes bactériennes, on peut citer des hydrolyses, des acétylations, des phosphorylations, des nucléotidylations, des estérifications, des réductions et des réactions d’addition d’un glutathion. Ces enzymes sont généralement associées à des éléments génétiques mobiles [1].

Carbapénèmase de type OXA-48/OXA-181 :(β-lactamase de  classe D)

      Les carbapénèmases de type OXA sont actuellement les carbapénèmases les plus fréquentes en France. L’épidémiologie des carbapénèmases est très peu connue dans les pays d’Afrique de l’Ouest. Du fait de la faible capacité´ des laboratoires, il y a peu de travaux sur un échantillon de souches consécutives permettant d’estimer les prévalences. Néanmoins Des souches productrices de carbapénèmases ont été´ également notifiées en Sierra Leone [27] et au Sénégal [12]. Dans ces différentes études, il a été´ démontre que les différents types de carbapénèmases déjà décrits ailleurs dans le monde [60] circulent dans la région Elles sont principalement observées chez K. pneumoniae, E. coli et Enterobacter spp. Il s’ajoute une diminution de sensibilité aux carbapénèmes, principalement l’ertapénème (CMI ≥ 0,38 μg/ml). Des niveaux élevés de résistance sont observés en cas d’association avec d’autres mécanismes de résistance, notamment une baisse de la perméabilité. À cause du haut risque de dissémination, il est recommandé de mettre en œuvre des techniques de dépistage phénotypiques et/ou moléculaires des BLSE et des carbapénèmases, afin de pouvoir mettre en œuvre les politiques de surveillance épidémiologique et les mesures d’isolement des patients porteurs [28].

Antibiogramme standard

   Il consiste à étudier la sensibilité in vitro des souches bactériennes aux antibiotiques. Le plus souvent, il se fait par la méthode conventionnelle de diffusion des disques en milieu gélosé (Kirby Bauer) et les critères de lecture et d’interprétation sont basés sur les recommandations du Comité d’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie [47]. Des disques de papier buvard imprégnés d’une quantité définie d’antibiotiques sont déposés à la surface d’un milieu gélosé préalablement ensemencé par une suspension bactérienne. Après une incubation pendant 18 – 24 h dans les conditions optimales, une zone d’inhibition de la croissance bactérienne entoure chaque disque. La détermination du diamètre de la zone d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits. En effet, pour un antibiotique donné, il existe une relation entre le diamètre de la zone d’inhibition et la valeur de la CMI.

Polymerase chain reaction (PCR) et séquençage

     La technique de PCR avec utilisation de couples d’amorces spécifiques des différents groupes de gènes de carbapénémases demeure le gold standard pour la détection des carbapénémases. Elle est employée par de nombreux laboratoires qui ont établis leur PCR « maison ». Cette technique pallie les inconvénients des méthodes phénotypiques puisqu’elle permet la détection de tous les groupes de carbapénémases connus incluant celles de type OXA et ce, en quelques heures. Des essais de PCR simplex visant à détecter une carbapénémase précise ont été rapportés de nombreuses fois, bien qu’aucun consensus n’ait été établi concernant la séquence d’oligonucléotides à utiliser comme amorce pour chaque groupe de gène bla. Certaines techniques de PCR multiplex en temps réel permettent de détecter simultanément, en 3h, les principaux gènes codant les carbapénémases des entérobactéries [39]. Des kits commerciaux de PCR ont été développés par l’industrie, comme le kit Hyplex CarbOxa ID (BAG Health Care, Germany), dont l’utilisation serait, d’après le fabricant, directement possible sur l’échantillon clinique. La société Biocentrics propose également depuis Juillet 2013 un kit de PCR en temps réel (Check-Direct CPE) qui permet en 2h la détection des enzymes KPC, VIM, NDM et OXA-48 directement à partir d’écouvillons rectaux. Les inconvénients de la technique par PCR sont bien évidemment son coût élevé (30€/test pour Check-Direct CPE, Biocentrics) et son incapacité à détecter des carbapénémases encore non découvertes (système fermé). Le séquençage de la région codante du gène permet l’identification précise du type de carbapénémase. Le séquençage, réservé aux laboratoires de référence, est notamment employé pour les enzymes de type VIM, NDM, KPC et OXA-48 [39]. Cette technique présente l’avantage d’être ouverte. Toutefois, la caractérisation d’une nouvelle carbapénémase n’est complète qu’une fois que la séquence moléculaire est obtenue et qu’une analyse fonctionnelle de l’hydrolyse et des profils d’inhibition est réalisée avec la protéine purifiée [39].

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS
CHAPITRE 1 : GÉNÉRALITÉS SUR LES BACILLES A GRAM NEGATIF
I. Les entérobactéries
I.1. Définitions
I.2. Caractères Bactériologiques
I.2.1.Caractères morphologiques
I.2.2.Caractères culturaux
I.2.3. Caractères biochimiques
I.2.4. Caractères antigéniques
II. Bacilles à Gram négatif non fermentaires
II.1 Définition
II.2 Habitat
II.3 Classification
II.4 Caractères bactériologiques
II.4.1 Caractères morphologiques
II.4.2 Caractères culturaux
II.5 Etude de principaux genres
II.5.1 Pseudomonas
II.5.2 Acinetobacter
II.5.3 Stenotrophomonas
CHAPITRE 2 : LES CARBAPENEMES
I. Définition
II. Structure chimique
III. Propriétés pharmacocinétiques
IV. Mécanisme d’action et activité in vitro
CHAPITRE III : RESISTANCES BACTERIENNES AUX CARBAPENEMES
I. Définition
II. Mécanismes et types de résistances des bactéries aux carbapénèmes
II.1. Mécanismes de résistance non enzymatique
II.2. Mécanisme de résistance enzymatique : Les carbapénémases
CHAPITRE IV : ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
I. Définitions et principe
II. Méthode de détermination de la CMI
II.1 Méthodes par dilution
II.2 Méthode par diffusion
II.3.Méthodes de Détermination de la résistance à l’Ertapénème
II.3.1.Méthodes phénotypiques
II.3.2. Détection basée sur l’activité enzymatique
II.3.2 Les méthodes moléculaires
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. Cadre et période d’étude
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Matériel
II.1.1. Origine des souches bactériennes
II.1.2. Matériel utilisé pour l’identification des souches bactériennes
II.1.3. Matériel utilisé pour la réalisation de l’antibiogramme
II.1.4. Matériel utilisé pour la conservation des souches
II.2. Méthodes
II.2.1. Population d’étude
II.2.1.1.Critères d’inclusion
II.2.1.2. Critères de non inclusion
II.2.2. Identification des bacilles à Gram négatif
II.2.4.Etude de la sensibilité des bacilles à Gram négatif aux Carbapénèmes
III. RESULTATS
1. Pourcentage des bacilles à Gram négatif résistants aux carbapénèmes
2. Répartition des entérobactéries résistantes aux carbapénèmes
3. Répartition des Bacilles à Gram négatif non fermentaires résistants aux Carbapénèmes
4. Distribution des bactéries résistantes aux carbapénèmes selon les produits pathologiques
5. Répartition des bacilles à Gram négatif résistants aux carbapénèmes selon l’origine du patient
6. Distribution de la population d’étude selon l’origine du patient
7. Répartition des Bacilles à Gram négatif résistants aux carbapénèmes  selon l’âge
8. Répartition des bacilles à Gram négatif résistantes à l’ertapénème et à  l’imipénème
IV. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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