Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) et Candida albicans (C. albicans) sont des pathogènes opportunistes fréquemment isolés chez des patients présentant des facteurs de risque d’infection. La résistance de P. aeruginosa aux antibiotiques est en croissance permanente et les rapports de cas de multi résistance voire de pan-résistance sont de plus en plus fréquents (1). L’association de ces deux microorganismes est fréquente dans les services de réanimation, notamment au niveau des voies aériennes. L’implication clinique de cette association reste indéterminée. En 2006, Azoulay et al. ont mis en évidence un association positive entre la colonisation des voies aériennes par C. albicans et le risque de pneumopathie acquise sous ventilation mécanique (PAVM) (2). Nous avons développé un modèle murin de colonisation des voies aériennes par C. albicans et avons testé l’effet de cette colonisation dans notre modèle de pneumonie à P. aeruginosa. De façon surprenante, nous avons mis en évidence que la colonisation des voies aériennes par C. albicans diminuait la sévérité des pneumonies à P. aeruginosa (3).

Des interactions directes ayant été mises en évidence de façon expérimentale entre P. aeruginosa et C. albicans (4,5), nous avons exploré ces interactions pour évaluer leur effet sur la protection induite par C. albicans. Mais aucune interaction directe n’a permis d’expliquer cette protection (Méar JB & Guery BP, travail de MASTER II, données non publiées). En revanche, l’exposition des voies aériennes à C. albicans était responsable d’un recrutement alvéolaire de macrophages. Nous avons par conséquent décidé d’explorer la réponse immunitaire induite par C. albicans au niveau pulmonaire afin de déterminer si elle était responsable de la protection observée.

La Pneumonie

Définition, symptomatologie, épidémiologie

La pneumonie ou infection respiratoire basse est une infection des voies aériennes inférieures. Elle résulte de la multiplication d’un microorganisme (virus, bactérie ou champignon) dans un lieu habituellement exempt de pathogènes: les bronchioles et alvéoles. Les symptômes de la pneumonie associent des signes généraux (fièvre, asthénie), une toux, souvent productive, une douleur thoracique et un essoufflement. L’examen clinique met en évidence des crépitants, témoins de l’œdème alvéolaire lésionnel et des signes en rapport avec la tolérance de la pneumonie (augmentation de la fréquence respiratoire, cyanose, voire détresse respiratoire aiguë). La pneumonie est la quatrième cause de mortalité dans le monde et la première cause de mortalité par maladie infectieuse en Europe. Son incidence est de 1,54 à 1,7/1000habitant par an (6). Les facteurs de risque reconnus sont l’âge ≥ 65 ans, le tabagisme, l’alcoolisme, l’immunodépression et toutes maladie chronique responsable d’une dysfonction d’organe (Insuffisance rénale, cardiaque, Broncho-pneumopathie chronique obstructive…). Les pneumonies sont la deuxième cause d’infection nosocomiale en France, mais la première cause de mortalité par infection nosocomiale (chiffres R.A.I.S.I.N 2012). Parmi les pneumonies nosocomiales, celles des patients de réanimation ou pneumopathie acquise sous ventilation mécanique (PAVM) sont celles qui ont le pronostic le moins favorable, avec une incidence d’environ 13,5% et une mortalité variable, en fonction du germe, de 30 à 60% (chiffres RÉA-R.A.I.S.I.N 2012 (7,8). P. aeruginosa est le germe le plus fréquemment rencontré au cours des PAVM et celui qui est responsable de la mortalité la plus importante (8,9). Le traitement de ces PAVM repose sur une antibiothérapie à large spectre, d’autant que les germes responsables de ces infections nosocomiales sont souvent multirésistants. Ces dernières années, le niveau de résistance de P. aeruginosa n’a cessé d’augmenter, avec l’apparition de souches multi- voire pan résistantes (9,10), conduisant parfois à des échecs cliniques en l’absence d’alternative thérapeutique.

Physiopathologie

De nombreux mécanismes permettent d’empêcher l’accès des micro-organismes aux voies respiratoires inférieures. La première barrière à l’infection est mécanique : l’épithélium bronchique et alvéolaire est bordé d’un mucus composé de glycoprotéines et de polysaccharides hydratés capable de piéger les particules qui ont passé les barrières plus haut situées. Ce mucus contient également des peptides antimicrobiens et des protéines du complément capables de tuer les bactéries (11). Il est évacué jusqu’au carrefour laryngé par des cils vibratiles et dégluti. Le défaut d’un seul de ces systèmes (défaut de synthèse des glycoprotéines, défaut d’hydratation du mucus, défaut des cils), inné ou acquis est responsable d’infections bactériennes chroniques (les trois atteintes les plus connues étant la mucoviscidose, le syndrome de Kartagener et la broncho-pneumopathie chronique obstructive post tabagique). Au niveau de l’alvéole, la barrière entre l’air et le sang est épaisse d’un µm seulement, composée d’un pneumocyte, de sa membrane basale et d’une cellule endothéliale. C’est la barrière la plus fine qui existe entre le sang et le milieu extérieur (12). Les capillaires pulmonaires localisés au contact des alvéoles vont, du fait de leur conformation, piéger les polynucléaires neutrophiles (PNN), augmentant leur concentration 50 fois par rapport au sang périphérique. Ils constituent ainsi une réserve opérationnelle, prête à intervenir (12). L’alvéole contient des macrophages, qui constituent la dernière ligne de défense avant l’épithélium alvéolaire. Si une bactérie parvient à atteindre l’espace alvéolaire, elle sera reconnue par les PRR des macrophages et phagocytée (13). La réponse immunitaire au niveau pulmonaire est toujours partagée entre deux impératifs : éliminer le microorganisme pour éviter sa dissémination et préserver la fonction d’organe. En effet, l’œdème et l’afflux de PNN au niveau alvéolaire empêche les échanges gazeux et la pneumonie peut entrainer, lorsque la surface atteinte est trop importante, un syndrome de détresse respiratoire aiguë et le décès du patient (14). Chez l’animal, des études ont mis en évidence que la limitation de l’inflammation pouvait être bénéfique au cours des pneumonies. Ces découvertes n’ont pour l’instant pas encore été appliquées chez l’homme (12) et restent controversées. Après l’installation de l’infection, l’un des signes de gravité est la perte du confinement du microorganisme, c’est à dire sa diffusion à travers la barrière épithéliale, la dissémination et l’invasion d’organes situés à distance. Les pathogènes à l’origine des pneumonie ne sont pas tous responsables du même tableau. Ainsi Streptococcus pneumoniae ne nécessite pas un inoculum important pour déclencher une pneumonie chez l’immunocompétent. À l’inverse, P. aeruginosa a besoin d’un terrain favorable pour s’installer, c’est à dire un défaut mécanique (intubation, absence de toux), un défaut du milieu (stagnation ou changement des propriétés physico-chimiques du mucus) ou un déficit immunitaire (comme ceux que l’on peut rencontrer en réanimation après  un choc septique, ou sur des terrains particuliers comme le diabète, la neutropénie, le cancer…). Toutes ces conditions sont rassemblées chez les patients de réanimation, d’où la fréquence des PAVM. Dans les modèles murins, l’augmentation de l’inoculum permet de pallier à l’absence de facteur favorisant. Les facteurs favorisants la pneumonie à P. aeruginosa sont également ceux qui favorisent la colonisation des voies aériennes par C. albicans, d’où la fréquence de leur coisolation (2).

Modèles animaux de pneumonie

Infection des animaux

L’exposition à des animaux infectés est le moyen le plus proche de la réalité pour transmettre un pathogène, et permet d’étudier à la fois la transmission et la sévérité de la pneumonie. Cependant, peu de pathogènes humains sont contagieux spontanément chez l’animal, ce qui limite cette approche. De plus, cela ne permet pas de contrôler l’inoculum et le taux d’infection. L’utilisation d’aérosol (mise en suspension du pathogène dans des gouttelettes de 4 à 6µm de diamètre) reproduit la transmission aéroportée, et permet un dépôt symétrique et uniforme du pathogène dans les voies aériennes (15). Cette procédure est simple, rapide, et permet un contrôle de l’inoculum. Cependant, elle nécessite un matériel spécifique coûteux et expose au risque de contamination de l’environnement de l’animal (yeux, bouche, fourrure) et de l’opérateur. De plus, il existe une limitation de l’inoculum, et certains pathogènes comme le pneumocoque sont très sensibles à l’aérosolisation, et ne sont pas utilisables avec cette technique. L’injection de pathogènes dans la trachée, soit directement après exposition et ouverture chirurgicale de la trachée (voie intra trachéale), soit après intubation orotrachéale (voie endotrachéale). Ces deux voies offrent les mêmes avantages : possibilité d’inoculer tous les pathogènes, quel que soit l’inoculum dans les voies aériennes inférieures, avec un bon contrôle de cet inoculum. Ce sont les seules voies possibles pour la délivrance de billes d’agar utilisées dans les modèles d’infection chronique. Ces techniques partagent comme inconvénients la nécessité d’une anesthésie générale et le dépôt de l’inoculum qui peut être inhomogène et asymétrique, voire sélectif. La voie intra-trachéale nécessite en plus une chirurgie (exposant à des complications spécifiques) et est une procédure longue (≈20 minutes par animal pour un opérateur entrainé). La voie endo-trachéale est difficile à mettre en œuvre techniquement et nécessite un opérateur entraîné pour des résultats reproductibles. Cette voie expose en plus à la contamination des voies aériennes inférieures par la flore oropharyngée (16). La voie intranasale (IN) est la plus simple de toutes. Elle nécessite une anesthésie de courte durée et ne présente pas de difficulté technique particulière. Elle permet de délivrer un inoculum important, quel que soit le type de pathogène. Elle partage avec les voies trachéales le désavantage d’une répartition inhomogène et asymétrique de l’inoculum, et expose à risque de contamination par la flore naso-pharyngée. Son inconvénient principal est la diffusion de l’inoculum aux voies aériennes supérieures. Certains auteurs lui reprochent également son manque de reproductibilité et la variabilité induite par le volume instillé et la concentration de l’inoculum (15,17). Cependant, après une mise au point et un contrôle strict de la concentration, du volume instillé, de la position de l’animal et du mode d’anesthésie, la voie intranasale apparaît être la voie la plus reproductible dans notre modèle. Cette voie nous a permis de diminuer les écarts-types et d’augmenter la reproductibilité entre les expériences. Elle nous a également permis de diminuer la mortalité per-procédure. Ces améliorations nous ont permis de diminuer le nombre de souris par groupe expérimental de dix à cinq, tout en augmentant la significativité (Méar JB., Faure E. et Guery B., données non publiées).

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Table des matières

INTRODUCTION
I. LA PNEUMONIE
I. A. Définition, symptomatologie, épidémiologie
I. B. Physiopathologie
I. C. Modèles animaux de pneumonie
I. C. 1. Infection des animaux
I. C. 2. Modèle chronique
I. C. 3. Modèles de PAVM
I. C. 4. La lésion pulmonaire
I. C. 5. Choix du modèle
II. CANDIDA ALBICANS
II. A. Caractéristiques microbiologiques
II. A. 1. Classification
II. A. 2. Morphologie
II. A. 3. Paroi
II. A. 4. Quorum Sensing
II. A. 5. Biofilm
II. B. Distribution, habitat
II. C. Virulence
II. D. Pathogénicité
II. D. 1. Candidoses muqueuses
II. D. 2. Candidoses invasives
II. E. Facteurs favorisants & Réponse de l’hôte
II. E. 1. Mécanismes déduits de pathologies humaines
II. E. 1. α. Candidoses muqueuses
II. E. 1 β. Candidoses invasives
II. E. 2. Modèle intégré de la réponse à C. albicans
III. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
III. A. Caractéristiques microbiologiques
III. B. Distribution, habitat
III. C. Virulence
III. C. 1. Quorum Sensing
III. C. 2. Facteurs de Virulence
III. C. 2. α. Facteurs sécrétés
III. C. 2. β. Facteurs constitutionnels
III. D. Pathogénicité, facteurs favorisants
III. E. Réponse de l’hôte
IV. INTERACTIONS ENTRE C. ALBICANS & P. AERUGINOSA
MATÉRIEL & MÉTHODES
I. MODÈLE ANIMAL
I. A. Animaux
I. B. Souches de bactérie et de levure
I. B. 1. Pseudomonas aeruginosa
I. B. 2. Candida albicans
I. B. 3. Autres microorganismes
I. C. Modèle murin de pneumonie
I. C. 1. Colonisation & infection
I. C. 2. Traitements pharmacologiques (cf. Tableau 2)
I. C. 3. Transfert de cellules immunitaires
II. ÉVALUATION & RECUEIL DE RÉSULTATS DANS LE MODÈLE ANIMAL
II. A. Poids & survie
II. B. Quantification des lésions pulmonaires : perméabilité́ de la barrière alvéolocapillaire
II. C. Analyse bactérienne et fongique
II. C. 1. Charges bactérienne et fongique pulmonaires
II. C. 2. Translocation bactérienne et fongique
II. D. Caractérisation de la réponse immune
II. D. 1. Caractérisation cellulaire
II. D. 1. α. LBA et récupération des poumons
II. D. 1. β. Extraction des cellules
II. D. 1. γ. Analyse des cellules par cytométrie en flux
II. D. 2. Dosage des cytokines dans le surnageant de LBA
II. D. 3. Dosage des défensines par RT-qPCR
III. IN VITRO
III. A. Extraction des composants de la paroi de C. albicans
III. A. 1. Extraction des mannanes
III. A. 2. Extraction des β-glucanes
III. A. 3. Extraction de la chitine
III. B. Stimulation cellulaire in vitro
IV. ANALYSES STATISTIQUES
RÉSULTATS
I. VALIDATION DU MODÈLE DANS LE FOND C57BL/6
II. VOIES DE SIGNALISATION IMPLIQUÉES DANS LA RÉPONSE PROTECTRICE
III. RÉPONSE CELLULAIRE ET CYTOKINIQUE INDUITE PAR C. ALBICANS
IV. CCL20
V. UTILISATION DES POLYOSIDES PARIÉTAUX DE C. ALBICANS.
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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