Etude de la dynamique conformationnelle de FhaC

Au cours de ma thèse je me suis intéressé à la voie de sécrétion bactérienne de type 5b, que l’on nomme aussi voie TPS (Two-Partner Secretion). Ainsi je vous présenterai les membres de la voie de sécrétion de type 5 qui, nous le verrons dans la seconde partie de cette introduction, peuvent être classés en 5 catégories (T5a à T5e). Mais puisqu’ils partagent tous globalement la même voie de biogenèse, je vous propose donc dans un premier temps de voir les différentes étapes qui vont permettre à ces systèmes de sécrétion de se mettre en place dans la membrane externe des bactéries (Fig. 1). Nous verrons ainsi que cette insertion est régie par une protéine qui possède de grandes similarités avec les transporteurs retrouvés dans la voie TPS.

L’une des caractéristiques majeures des bactéries de type à Gram négatif vient de la présence d’une structure remarquablement organisée et nommée membrane externe. A la différence de la membrane interne, cette membrane est asymétrique. Son feuillet externe qui fait l’interface au milieu extérieur se compose d’une molécule lipidique nommée lipopolysaccharide (LPS). Son feuillet interne se rapproche plus en composition de la membrane interne, car formé principalement d’un phospholipide zwitterionique, la phosphatidyléthanolamine (PE, 90%) et de phosphatidylglycérol chargé négativement (PG, 10%) avec une faible proportion de cardiolipine (diPG) (Fig. 2).

Cette membrane particulière possède un double rôle, l’un étant d’être une barrière résistante aux composés présents dans le milieu extérieur (antibiotiques, toxines, protéases, détergent…), l’autre étant d’avoir une perméabilité sélective. Alors que son premier rôle est assuré par la nature même du LPS, son second est plus complexe car il requiert de nombreux acteurs : les protéines de membrane externes. Elles représentent environ 70% de la masse de la membrane, et participent à de nombreux processus qui incluent l’apport de nutriments par le transport, la sécrétion, l’adhésion, la signalisation, la biogenèse… . Ces protéines peuvent être soit ancrées au niveau du feuillet interne par leur N terminus (Lipoprotéines), ou soit traverser complètement la membrane grâce à une structure en tonneau β (Outer Membrane Proteins (OMPs)) (Fig. 2). Durant ma thèse je me suis intéressé plus particulièrement à cette dernière structure, dans le cadre de la voie de sécrétion de type 5, qui permet la translocation de protéines de grandes tailles vers le milieu extérieur à travers un tonneau β.

Biogenèse des OMPs

L’adressage et l’assemblage des protéines membranaires sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux acteurs. Pour les protéines de membrane externe la biogenèse est d’autant plus complexe qu’elles doivent traverser la membrane plasmique et l’espace inter-membranaire (périplasme) avant d’être intégrées spécifiquement dans la membrane externe (Fig. 2). Ainsi, tous les acteurs permettant la reconnaissance et/ou l’assemblage de ces protéines doivent être capable de faire la différence entre une protéine de membrane interne, de membrane externe ou une protéine devant être sécrétée dans le milieu extérieur. Les OMPs sont donc transportées en premier à travers la membrane interne. C’est un processus qui nécessite un apport d’énergie donc couplé avec une réaction exergonique (du Plessis et al., 2011). De plus, afin d’éviter l’agrégation ou la structuration prématurée, les domaines hydrophobes de la protéine doivent être protégés de l’aquosité du périplasme, tout ceci avant d’être correctement intégrés et structurés dans la membrane externe sans aucun apport d’énergie. Le périplasme est en effet dépourvu d’ATP et la membrane externe ne permet pas la formation d’un gradient électrochimique utilisable pour fournir de l’énergie à un processus de transport (Peterson et al., 2010 ; Hagan et al., 2011).

Translocation des OMPs à travers la membrane interne

Le transport des OMPs à travers la membrane cytoplasmique se fait par la translocase Sec. Il est médié principalement par le complexe SecYEG formant le pore de translocation, associé à la protéine SecA fournissant l’énergie au système. Les protéines devant traverser la membrane interne sont synthétisées dans le cytoplasme avec une extension N-terminale. L’adressage vers le complexe Sec se fait par la reconnaissance de cette séquence N-terminale de la pré-protéine. Nommée « peptide signal », cette séquence se compose d’environ 25 acides aminés divisés en 3 régions : N-H-C, comprenant des résidus chargés positivement (N), un segment hydrophobe (H) suivi du site de coupure (C) (Driessen and Nouwen, 2008) (Fig. 3). A la différence des protéines qui seront exportées à travers la membrane cytoplasmique, les protéines devant être intégrées à la membrane cytoplasmique ne possèdent généralement pas de site de coupure (C) et leurs segments hydrophobes forment des hélices α plus longues permettant leur insertion stable dans la membrane. Dans le cas de certaines protéines appartenant au type 5 de sécrétion (Autotransporteurs, protéines de type TpsA (voir chapitre II.)), le signal peptide est beaucoup plus grand (supérieur à 40 acides aminés) car il se compose d’une région supplémentaire : « l’extension N-terminale ». Comme son nom l’indique, cette extension se situe en position N-terminale du signal peptide, juste après la première méthionine. Cette extension porte un motif assez conservé et se compose principalement d’acides aminés hydrophobes et aromatiques (Fig. 3). La fonction de cette extension n’est toutefois pas encore bien définie. Par exemple dans le cas de l’autotransporteur EspP, sa délétion n’entraine pas de problème de translocation à travers la membrane interne mais une accumulation dans le périplasme. Cette extension n’aurait pas de fonction dans l’adressage vers Sec, mais pourrait avoir un rôle lorsque la préprotéine se trouve dans le périplasme avant son clivage. Il a été proposé que cette extension puisse servir d’accroche transitoire à la membrane interne, qui préviendrait alors un repliement précoce dans le périplasme pouvant bloquer la translocation à travers la membrane externe (Szabady et al., 2005). Toutefois dans d’autres cas, comme par exemple pour l’hémagglutinine filamenteuse (FHA), la délétion de cette extension affecte peu le processus de sécrétion chez Bordetella pertussis (Lambert-Buisine et al., 1998). Elle retarderait cependant le clivage du peptide-signal et/ou ralentirait le passage de la FHA par la machinerie Sec, vraisemblablement pour mieux coordonner les traversées des membranes plasmique et externe (Chevalier et al., 2004).

Dans le cytoplasme : Sec B et Sec A
Le peptide-signal doit donc être accessible depuis le cytoplasme, et pour éviter que les OMPs (et certaines protéines à sécréter) ne se structurent prématurément, la chaperonne SecB interagit directement avec ses ‘substrats’ à la sortie du ribosome. SecB aura donc comme fonction d’empêcher le repliement, et aussi de diriger la protéine vers le complexe de translocation en interagissant avec SecA. SecB est un homotétramère organisé en dimère de dimère. L’interface entre dimères s’organise en hélices α formant un sillon d’une longueur de 70 Å servant à maintenir l’état déstructuré de la protéine substrat (Fig. 4) (Xu et al., 2000). Ces différentes interfaces de fixation ont pu être décrites très précisément par l’équipe de Linda Randall et de Wayne Hubbell en utilisant la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) (voir chapitre III). Ils ont confirmé que la protéine substrat pouvait bien se situer dans ce sillon et être stabilisée par des interactions hydrophobes. Toutefois la stabilisation de la protéine ne s’arrête pas là, puisque SecB est aussi capable de faire des interactions polaires en dehors de ce sillon sur des motifs localisées en différentes positions de surface de SecB (Crane et al., 2006). Nous pouvons supposer que cette flexibilité d’interaction est très importante pour sa fonction, puisque SecB possède un très grand nombre de protéines ‘substrats’ qu’elle adresse au complexe Sec pour passer la membrane interne. La protéine est ensuite transmise de l’homotétramère SecB vers le dimère SecA par une interaction directe entre ces 2 protéines : Le C terminus de SecA est hautement flexible et chargé positivement, de par la fixation d’un ion zinc par 3 résidus cystéine et un résidu histidine. Cette région permet une interaction électrostatique avec un patch de résidus chargés négativement et situés sur les feuillets β de chaque côté de SecB. Le C terminus de SecB interagit avec le N terminus de SecA en s’insérant dans l’interface de dimérisation de SecA. L’ouverture de cette interface pourrait alors créer un sillon dans SecA permettant le passage de la protéine substrat de SecB vers SecA (Crane et al., 2005).

SecA est une protéine centrale du complexe Sec, qui possède une activité ATPase et interagit avec presque tous les acteurs du complexe Sec. Actuellement de nombreuses structures de SecA sont disponibles, et montrent pour la plupart un dimère organisé de manière antiparallèle. Chaque protomère est divisé en plusieurs sous-domaines structuraux dont NBF1 et NBF2 qui contiennent la fonction motrice (« moteur DEAD ») permettant l’hydrolyse de l’ATP. Celle-ci induit les changements de conformation de SecA nécessaires pour la translocation de la protéine substrat. Son interaction directe avec le canal SecYEG couplé avec la réaction exergonique va permettre à la protéine substrat de progresser dans le pore.

Membrane Interne : SecYEG
Le canal de translocation est composé de 3 protéines intégrées dans la membrane cytoplasmique et formant un complexe stable. Cet hétéro-complexe a été conservé au cours de l’évolution puisqu’il est aussi présent chez les archéobactéries et les eucaryotes (Sec61 αγβ). La première structure du complexe provient de celui d’une archéobactérie Methanococcus jannaschii (van den Berg et al., 2004). Le pore du canal est formé par les 10 hélices α transmembranaires de la protéine SecY (Sec61α) qui peut être divisée en 2 sousunités symétriques comprenant d’un côté les hélices 1 à 5 et de l’autre 6 à 10 (Fig. 5A).

Chaque moitié est organisée avec 2 hélices plus internes et 3 plus externes. La forme du canal peut faire penser à un sablier avec un resserrement central formant un joint étanche composé de 6 résidus hydrophobes (des Isoleucines chez E. coli) pointant vers l’intérieur canal (Fig. 5B). Coté cytoplasmique, le canal possède une ouverture d’environ 25 Å pouvant servir de zone d’interaction avec SecA et/ou la protéine à transporter. Ce pore est obstrué du coté périplasmique par une hélice α qui est une extension de l’hélice 2 (Fig. 5A). L’utilisation d’agents de réticulation photo-activables a permis ici de piéger certaines étapes de la translocation de SecYEG. Ainsi, le signal-peptide de la protéine substrat est capable de s’intercaler entre les hélices 2 et 7 qui sont situées vers l’avant du canal coté cytoplasmique (Plath et al., 1998). Cette interaction peut alors séparer les 2 sous-unités, ce qui aurait comme conséquence de déplacer la partie de l’hélice α 2 obstruant le pore pour ouvrir ce dernier. La présence de cette hélice est très intéressante dans une protéine de membrane interne car nous verrons par la suite que nous retrouvons ce même type de structure à l’intérieur de certaines OMPs du type 5. Cette hélice n’est pas indispensable puisque sa délétion n’entraîne pas de défaut de translocation (Maillard et al., 2007). Cependant de manière plus étrange, si un pont disulfure vient bloquer cette hélice avec une cystéine introduite dans SecE, afin de stabiliser la forme ouverte (Fig. 5B), alors cette mutation entraîne un phénotype létal pour la bactérie (Harris and Silhavy, 1999). Des mesures d’électrophysiologie réalisées sur ce pore ont ainsi montré que, dans sa forme au repos, ce canal était imperméable aux ions et possédait une très faible conductance. Dans un variant où l’hélice est manquante, la conductance du pore est augmentée reflétant un pore plus ouvert. De même l’utilisation du double mutant cystéine montre un passage d’ions quand le pont disulfure est formé (l’hélice est en interaction avec SecE), tandis que le pore redevient imperméable aux ions à l’ajout d’une molécule qui rompt les ponts disulfures (Dithiothréitol), suggérant que l’hélice est retourné dans le pore (Saparov et al., 2007). SecYEG ne sert pas qu’à exporter des protéines vers le périplasme, ce canal permet aussi l’insertion de protéines dans la membrane interne. Dans ce cas la partie transmembranaire de la protéine à insérer doit être en contact avec la bicouche lipidique. Cette insertion se ferait alors par une ouverture latérale du canal entre les hélices 2-3 et 7-8 lors d’un changement de conformation induit par la rupture de la liaison 2-7 lors de l’interaction avec le peptide-signal. Il doit donc s’agir d’un canal extrêmement dynamique, dans laquelle la forme ouverte latéralement doit être stabilisée par la présence de la protéine à intégrer dans la membrane, empêchant l’influx de lipides à l’intérieur du canal. La stabilisation de SecY se fait aussi essentiellement par SecE qui se compose de 3 hélices transmembranaires chez E. coli. Ces hélices se situent autour de SecY et plus particulièrement à l’arrière de la zone d’ouverture latérale permettant ainsi de stabiliser les 2 côtés du canal. Chez les bactéries, la troisième protéine (SecG) du complexe de translocation est différente de celle présente chez les eucaryotes ou Archées (Sec61β). Elle possède 2 hélices transmembranaires proches du N terminus de SecY et n’est pas essentielle pour la translocation chez E. coli.

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Table des matières

INTRODUCTION
I. Biogenèse des OMPs
1. Translocation des OMPs à travers la membrane interne
a) Dans le cytoplasme : Sec B et Sec A
b) Membrane Interne : SecYEG
2. Intégration des OMPs dans la membrane externe
a) Dans le périplasme : les chaperonnes
b) Membrane externe : Le complexe Bam
II. Classification de la sécrétion de Type V
1. Autotransporteurs
a) T5a : «autotransporteurs classiques»
b) T5c : « autotransporteurs trimériques »
c) T5e : « autotransporteur inversé »
2. Systèmes TPS (et apparentés)
a) T5b : « sécrétion à 2 partenaires »
TpsA (FHA)
TpsB (FhaC)
b) T5dSS un mélange entre les systèmes autotransporteurs et TPS
III. Résonance Paramagnétique Electronique appliquée aux protéines
1. Marquage de spin (Site-Directed Spin Labeling)
2. De la propriété magnétique du MTSL jusqu’au spectre RPE
a) Principe physique
b) Un peu de calcul
c) Analyse de spectre RPE
3. Quelques exemples
4. La RPE en mode impulsionnel
OBJECTIFS
RESULTATS
1. Création des mutants et test fonctionnel
2. Premières expériences de RPE
3. Publication : Conformational dynamics of protein transporter FhaC: large-scale motions of plug helix
4. Rôle du Linker
a)Analyse de sa mobilité par RPE
b) Caractérisation de la fonction du linker pour la sécrétion
5. Rôle de L6
a) Analyse de sa mobilité par RPE
b) Test de sensibilité aux antibiotiques : R450-D492
6. Autres changements conformationnels possibles ?
DISCUSSION ET PERSPECTIVE
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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