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Frottis colorés par la méthode de Gram
Des frottis peuvent être colorés directement par la méthode de Gram, en vue de rechercher l’agent pathogène. Ce dernier a la forme typique d’une levure, prenant le colorant de Gram, pléomorphique, ovoïdes ou globuleux, d’un diamètre de 2 à 5 µm. Il peut être isolé ou groupé, en position extracellulaire ou inclus dans des macrophages. Lors de l’examen à l’état frais, ils sont fréquemment entourés d’un halo. [16] Vous en avez un aperçu dans la figure 5.
Histopathologie
L’aspect des lésions sur coupes histologiques colorées à l’hématoxyline-éosine est très caractéristique, consistant en une inflammation pyogranulomateuse avec de nombreuses cellules géantes de Langhans. De nombreux champignons extracellulaires ou intracellulaires dans des macrophages ou des cellules géantes multi nucléées sont observés et mis en évidence plus nettement à l’aide de coloration, au réactif à l’acide périodique de Schiff (PAS) ou par la méthode de Gomori à l’argent-méthénamine. Il semblerait que le nombre de germes augmente lorsque la maladie devient chronique. Ces germes sont pléomorphiques, souvent décrits comme des masses en forme de citron légèrement basophiles, d’un diamètre variant de 2 à 5 µm, et entourés d’un halo lors d’une coloration à l’hématoxyline-éosine ou par la méthode de Gram. [16]
Microscopie électronique
La microscopie électronique a été utilisée pour observer des biopsies de peau de 1,5 à 2 mm d’épaisseur préfixées immédiatement après leur prélèvement dans une solution à 2 % de glutaraldéhyde en tampon phosphate à 4 °C puis fixées définitivement dans du tétraoxyde d’osmium à 1 %. Sur des coupes ultrafines colorées à l’acétate d’uranyle et au citrate de plomb, on peut observer les détails de la structure interne du champignon H. capsulatum var. farciminosum, y compris l’enveloppe cellulaire, la membrane plasmatique, la paroi cellulaire et les structures internes de la cellule. [16]
Culture
La forme mycélienne de H. capsulatum var. farciminosum pousse lentement (en 2 à 8 semaines à 26 °C). Parmi les milieux que l’on peut utiliser, on peut citer la gélose mycobiotique, la gélose dextrosée de Sabouraud à 2,5 % de glycérol, l’infusion cœur-cervelle gélosée à 10 % de sérum de cheval, et la gélose nutritive pour PPLO (pleuropneumonia-like organisms) à pH 7,8 additionnée de 2 % de dextrose et de 2,5 % de glycérol. L’addition d’antibiotiques à tous ces milieux est recommandée comme la cycloheximide (0,5 g/litre) et le chloramphénicol (0,5 g/litre). Pour obtenir une activité anti-bactérienne à large spectre, il convient d’utiliser la gentamycine (50 mg/litre) et la pénicilline G (6 x 106 unités/litre) à la place du chloramphénicol. Les colonies apparaissent en 2 à 8 semaines, formées d’un mycélium d’aspect chiffonné, sec, granuleux et de couleur blanc grisâtre, mais les colonies brunissent en vieillissant. Des formes aériennes peuvent se former, mais rarement. Les formes mycéliennes produisent une grande variété de conidies, comme des chlamydospores, des arthroconidies et quelques blastoconidies. En revanche, les grandes macroconidies rondes et à double paroi souvent observées avec H. capsulatum var. capsulatum sont absentes dans ce cas. Le test peut être confirmé en induisant la formation de formes en levure de H. capsulatum var. farciminosum par subculture de morceaux de mycélium dans une infusion cœur-cervelle gélosée à 5 % de sérum de cheval ou dans du milieu de Pine, entre 35 et 37 °C en atmosphère à 5 % de CO2. Les colonies en forme de levures sont plates, hérissées, d’aspect chiffonné, de couleur blanche à gris brun et de consistance pâteuse. Cependant, la réversion complète vers la forme levure peut ne pas être obtenue avant 4 ou 5 passages sur de nouveaux milieux tous les 8 Jours. [16]
Inoculation à l’animal
L’inoculation expérimentale de H. capsulatum var. farciminosum a été tentée chez la souris, le cobaye et le lapin. Les souris dont l’immunité a été supprimée sont très sensibles à cette inoculation et peuvent être utilisées pour le diagnostic de la maladie. [16]
Epreuves sérologiques
Il existe des publications décrivant les différentes épreuves qui permettent de rechercher les anticorps spécifiques de l’agent causal ainsi qu’un test d’hypersensibilité retardée qui permet de détecter la réaction d’immunité à médiation cellulaire. Les anticorps apparaissent habituellement au moment, ou juste après l’apparition des symptômes. [16]
Epreuves par immunofluorescence
Immunofluorescence indirecte
L’épreuve qualitative est décrite ainsi : [16]
Les micro-organismes servant à détecter les anticorps viennent de l’étalement sur une lame porte-objet du contenu de lésions ou d’une fine émulsion en solution saline de germes en phase levure;
Les lames porte-objet sont fixées à la flamme ;
Elles sont ensuite lavées dans une solution de tampon phosphate (PBS) pendant 1 min ;
Les sérums à tester non dilués sont déposés sur la lame porte-objet et ensuite incubés 30 min à 37 °C ;
Les lames sont ensuite lavées 3 fois pendant 10 min en PBS ; Un anticorps anti-cheval, conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine et dilué de façon appropriée, est déposé ensuite sur la lame qui est incubée 30 min à 37 °C ;
Les lames sont ensuite lavées 3 fois pendant 10 min en PBS ;
Elles sont enfin observées au microscope à immunofluorescence.
Immunofluorescence directe L’épreuve suivante a été décrite ainsi : [16]
La fraction globulinique du sérum à tester est précipitée, puis remise en suspension jusqu’à atteindre le volume initial du sérum dans une solution saline. Le sérum est alors conjugué à l’ITCF ;
Des petits morceaux de colonies mycéliennes du germe sont mis en suspension dans 1 ou 2 gouttes de solution saline déposées sur une lame porte-objet. A l’aide d’une seconde lame porte-objet, les morceaux de colonies sont alors écrasés et étalés sur la lame de façon à former un film ;
Les lames sont fixées par la chaleur ;
Les lames sont lavées en PBS pendant 1 min ;
Les lames sont incubées 60 min à 37 °C, en présence de différentes dilutions de sérum conjugué ;
Les lames sont lavées 3 fois en PBS, chaque fois durant 5 min ; Les lames sont examinées au microscope à immunofluorescence.
Epreuve immuno-enzymatique indirecte L’épreuve suivante a été décrite telle quelle:
L’agent pathogène sous forme mycélienne est obtenu sur gélose de Sabouraud dextrosée, en tubes incubés durant 4 semaines à 26 °C. Trois colonies sont prélevées et broyées dans 50 ml de PBS stérile. La suspension obtenue est diluée à 1/100, et cette dilution est utilisée pour sensibiliser les 96 puits des plaques de micro titrage, à raison de 100 µl par puits ;
Les plaques sont incubées toute une nuit à 4 °C ;
Les plaques sont lavées avec du PBS additionné de Tween 20 (0,5 ml/litre), 3 fois 3 min chacune ; Les plaques, placées sur agitateur automatique, sont incubées avec de la sérum-albumine bovine à 5 %, à raison de 100 µl/puits, entre 23 et 25 °C durant 30 min ;
Les plaques sont lavées avec du PBS-T, 3 fois 3 min chacune ;
Les sérums à tester sont dilués de 2 en 2 dans du PBS-T en commençant à la dilution 1/50 et incubés entre 23 et 25 °C pendant 30 min ;
Les plaques sont lavées avec du PBS-T, 3 fois 3 min chacune ;
Des Immunoglobulines G de chèvre anti-cheval marquées à la peroxydase sont diluées au 1/800 et placées à raison de 100 µl/puits, sur agitateur automatique, pour incubation durant 30 min entre 23 et 25 °C ;
Les plaques sont lavées avec du PBS-T, 3 fois 3 min chacune ;
Finalement, du peroxyde déshydrogène et de l’ABTS (2,2í-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazoline]-6-sulphonic acid) en tampon citrique à pH 4 sont ajoutés, à raison de 100 µl/puits ;
Les plaques sont lues après 60 min dans un spectrophotomètre avec un filtre de 405 nm de longueur d’onde ;
Deux valeurs d’absorption sont relevées pour chacune des dilutions du sérum, et ce sont les écarts à la normale et les pourcentages moyens d’absorption qui sont pris en compte pour l’interprétation des résultats.
Test d’hémagglutination passive Le test consiste en la procédure suivante
L’agent pathogène est multiplié durant 8 semaines sur de la gélose de Sabouraud dextrosée. Cinq colonies sont alors raclées, broyées et mises en suspension dans 200 ml de solution saline puis soumises aux ultrasons durant 20 min. Les éléments mycéliens restants sont éliminés par filtration, et le filtrat lui-même est dilué au 1/160 ;
Des globules rouges normaux de mouton (GRM) sont lavés, traités à l’acide tannique, relavés et mis en suspension à 1 % ;
Différentes dilutions de la préparation antigénique sont mélangées avec les GRM tannés et incubés 1 h au bain-marie à 37 °C. Les GRM sont récoltés par centrifugation, lavées 3 fois dans une solution saline tamponnée et remis en suspension à 1 % ;
Les sérums à tester sont inactivés par chauffage à 56 °C pendant 30 min puis absorbés sur un égal volume de GRM lavés ;
Les dilutions de sérum (0,5 ml) sont placées dans des tubes à essai avec 0,05 ml de GRM tannés recouverts d’antigène ;
L’agglutination est observée entre 2 et 12 h plus tard ;
La réaction est considérée comme positive lorsque les GRM forment un tapis uniforme au fond du tube. Le test est négatif lorsque les GRM sont assemblés en « bouton » au fond du tube.
Tests cutanés d’hypersensibilité retardée
Deux tests cutanés d’hypersensibilité retardée ont été décrits pour le diagnostic de la lymphangite épizootique : [16]
Une culture pure de H. farciminosum est entretenue pendant 8 semaines sur gélose de Sabouraud dextrosée additionnée de 2,5 % de glycérol. Cinq colonies sont raclées et broyées dans 200 ml de solution saline, puis congelées et décongelées 5 fois et enfin soumises aux ultrasons (amplitude de 40°) pendant 20 min. Les éléments mycéliens restants sont éliminés par centrifugation à 1006 g à 4 °C pendant 11 min. La stérilité de la préparation est vérifiée par ensemencement d’un aliquote sur gélose de Sabouraud dextrosée, et incubation pendant 4 semaines à 26 °C ;
Puis, 0,1 ml de cette préparation contenant 0,2 mg/ml de protéine sont inoculés par voie intradermique au niveau de l’encolure des animaux ;
Le point d’inoculation est examiné et la réaction est considérée comme positive si une zone localement indurée et en relief apparait 24 à 48 h après l’injection. Un accroissement de l’épaisseur de la peau supérieur à 4 mm est considéré comme positif.
Un second test possible, à « l’histofarcine », a été comme suit :
Une forme mycélienne du germe est obtenue par culture durant 4 mois entre 23 et 25 °C sur des disques de polystyrène flottant à la surface de 250 ml de milieu pour PPLO, additionné de 2 % de glucose et de 2,5 % de glycérine ;
Le filtrat de cette culture, débarrassé des formes mycéliennes, est mélangé à de l’acétone (2/1) et on laisse le tout reposer durant 48 h à 4 °C ;
Le surnageant est décanté et on laisse l’acétone s’évaporer ;
Le précipité est remis en suspension à 1/10 en eau distillée, jusqu’à reconstitution de son volume initial ;
Les animaux reçoivent 0,1 ml de cet antigène par voie intradermique au niveau de l’encolure.
Le point d’inoculation est examiné et la réaction est considérée comme positive si une zone localement indurée et en relief apparait entre 24, 48 et 72 heures après l’injection. [16]
Pathogénie
La période d’incubation varie de plusieurs semaines à six mois. Après l’invasion initiale de la peau, l’organisme se propage à travers les vaisseaux lymphatiques jusqu’aux ganglions lymphatiques régionaux, et dans les cas plus avancés jusqu’aux organes internes. On observe une suppuration nodulaire et chronique ; les lésions sont évidentes sur la peau recouvrant les nœuds et vaisseaux lymphatiques. Lorsque des lésions sur la muqueuse apparaissent, la plupart sont confinées à la partie supérieure des voies respiratoires et aux yeux. L’infection nasale est généralement accompagnée d’une décharge mucopurulente contenant un grand nombre de champignons. Au Soudan, H. farciminosum a été isolé sur des lésions pulmonaires granulomateuses de deux chevaux souffrant de pneumonie. Une pneumonie mortelle causée par H. farciminosum a été signalée chez un poulain immunodéprimé. [5] [16]
Signes cliniques
L’histoplasmose est une inflammation chronique du système lymphatique sous-cutané des équidés. Elle se caractérise par une lymphangite suppurée, une lymphadénite, des ulcères de la peau, de la kératite ou une pneumonie. En fonction de la localisation, on peut distinguer deux formes d’histoplasmose chez le cheval : la forme cutanée et la forme viscérale (atteintes des organes profonds et des muqueuses). [5] [16]
Forme cutanée
Il s’agit de la lymphangite épizootique vraie. Crest une mycose inoculable et contagieuse affectant le système lymphatique superficiel. [4]
Symptômes généraux
Dans la forme cutanée non compliquée, il n’y a pas de réaction fébrile mais quand la maladie se généralise, il y a perte considérable de l’état général et on note une faiblesse de l’animal. Il est toutefois difficile de faire le diagnostic différentiel avec d’autres affections car en Afrique tropicale, les chevaux sont l’objet d’un parasitisme poussé et de nombreuses affections intercurrentes. [4]
Lymphangite simple
Elle apparaît souvent après un effort violent, une compétition, etc. … lors du repos au box le lendemain. Dans le milieu équestre, elle est aussi appelée « lymphangite du lundi » et fait souvent suite aux compétitions ayant lieu les week-ends. C’est bien pour cela que l’on conseille de doucher longuement les membres du cheval après l’effort et d’appliquer un emplâtre (argile, terre armoricaine, …) ou de l’eau blanche (suspension à l’acétate basique de plomb) ou tout autre produit sous bande de repos après de grosses séances de travail. Le lendemain, il est préférable de ne pas laisser le cheval au box, de lui doucher de nouveau les membres, de le sortir au pas en promenade ou en liberté pour activer la circulation sanguine et le drainage. [11]
Lymphangite aiguë simple
Il s’agit d’une réaction normale à la pénétration de germes. Dans ce cas, les ganglions sont légèrement hypertrophiés, La guérison survient généralement spontanément. Il est alors recommandé de bien désinfecter la plaie, doucher, mettre de l’argile (blanche ou verte) qui possède de nombreuses propriétés même pour « aspirer » germes et impuretés. Cependant il faut faire attention à l’application abusive d’argile sur une trop longue période à cause du caractère abrasif de celle-ci. Il existe également d’excellents draineurs en homéopathie et aromathérapie (médecines en plein développement) qui peuvent aider à la guérison. [11]
Lymphangite aiguë purulente
A la suite de plaies souillées, le plus souvent aux membres, les ganglions sont hypertrophiés, les vaisseaux lymphatiques sont distendus, douloureux et l’on peut voir que ce membre est bien enflé (appelé poteau). Des douches, surtout pas froides sont appliquées et si le cheval peut se déplacer, le marcher au pas en main permet de faciliter le désengorgement. A cela, le vétérinaire prescrira aussi un traitement antibiotique et anti-inflammatoire avec parfois ajout de diurétiques afin de venir à bout de l’infection et de l’inflammation afin de permettre au cheval de retrouver sa mobilité et de retourner au travail. [11]
Lymphangite abcédée
C’est la forme aggravée de la lymphangite aigüe purulente, elle prend ce nom lorsque des abcès apparaissent le long des cordons lymphatiques. Ces abcès peuvent alors s’ouvrir et laisser échapper un pus épais. [11]
Lymphangite chronique ou ulcéreuse
Dans cette forme, la peau devient épaisse et se sclérose (figure 8). De petits nodules durs apparaissent et le membre prend des proportions éléphantesques (apparition de l’œdème par rétention). En général, l’animal présente de l’hyperthermie, une anorexie et une léthargie avec une boiterie intense. Malgré les traitements et l’application de pommades anti-sclérosantes, cette forme peut entraîner des déformations définitives. Par conséquent, elle n’est donc pas à prendre à la légère. [11]
Nous allons maintenant passer à la seconde partie de notre étude portant sur le suivi de quelques cas d’animaux atteints d’histoplasmose dans une écurie de Dakar : le Poney Club de Hann.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 : Rappels des normes physiologiques d’intérêt clinique et du système lymphatique du cheval
1 Normes physiologiques d’intérêt clinique
2 Système lymphatique du cheval
2.1 Les vaisseaux lymphatiques
2.2 Les nœuds ou ganglions lymphatiques
Chapitre 2 : La lymphangite épizootique (histoplasmose)
1 Epidémiologie
2 Etiologie
2.1 Identification de l’agent pathogène
2.2 Techniques de diagnostic
2.2.1 Identification de l’agent pathogène
2.2.2 Epreuves sérologiques
3 Pathogénie
4 Signes cliniques
4.1 Forme cutanée
4.1.1 Symptômes généraux
4.1.2 Symptômes locaux
4.1.3 Aspect des lésions
4.2 Histoplasmose viscérale et des muqueuses
4.3 Evolution
5 Traitement
6 Prophylaxie
Chapitre 3 : Autres lymphangites
1 Lymphangite simple
2 Lymphangite aiguë simple
3 Lymphangite aiguë purulente
4 Lymphangite abcédée
5 Lymphangite chronique ou ulcéreuse
DEUXIEME PARTIE : ETUDE DE CAS DE LYMPHANGITE EPIZOOTIQUE DANS UNE ECURIE A DAKAR
Chapitre 1 : Matériel et méthodes
1 Matériel
1.1 Cadre de l’étude
1.1.1 Localisation et présentation du Poney Club de Hann
1.1.2 Organisation et activités du club
1.2 Présentation du cheptel
1.2.1 Races
1.2.2 Ratio mâles/femelles
1.2.3 Age de la population
2 Méthodes
2.1 Examen clinique
2.2 Prélèvements
2.2.1 Matériel
2.2.2 Technique
2.2.3 Conservation et envoi au laboratoire
2.3 Analyses de laboratoire
2.3.1 La lecture directe
2.3.2 La culture
2.4 Mise en place du traitement
2.4.1 Pharmacopée traditionnelle
2.4.2 Enilconazole
2.4.3 Iodure de sodium
2.4.4 ORNIPURALnd
2.4.5 L’Amphotéricine B
2.4.6 Itraconazole
2.4.7 Fluconazole
2.4.8 Pénicilline-streptomycine
2.4.9 Chirurgie
Chapitre 2 : Résultats et discussion
1 Analyses des données
1.1 Etiologie
1.2 Etude épidémiologique
1.2.1 Source de l’infection
1.2.2 Réceptivité/sensibilité
1.2.3 Evolution de la maladie au sein du cheptel
1.2.4 Durée de l’infection
2 Traitement
2.1 Mise en place du traitement
2.1.1 Prise en charge médicale
2.1.2 Prise en charge chirurgicale
2.2 Protocoles au cas par cas :
3 Prophylaxie
3.1 Mesures prises au niveau des animaux
3.2 Mesures prises au niveau de la structure
Chapitre 3 : RECOMMANDATIONS
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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