AYY-AZIL-79
Etude Bibliographique La plante hôte
Matériel et méthodes
1. L’isolement de l’agent pathogène
L’isolement a été effectué dans différentes régions de l’ouest, de l’est et du sud Algérien à partir de plantes de tomates atteintes de fusariose durant les compagnes de 2009, de 2011 et de 2013 (figure 17).
Dans la wilaya d’Oran ; Dans la wilaya d’Ain Temouchent ; Dans la wilaya de Mascara ; Dans la wilaya de Mostaganem ; Dans la wilaya de Chlef ; Dans la wilaya de Guelma ; Dans la wilaya d’Annaba ; Dans la wilaya d’El Taref ; Dans la wilaya de Skikda ; Dans la wilaya d’El Oued.
L’isolement à partir des fragments de tiges
La technique consiste d’abord à couper transversalement la tige en petits fragments, les rincer à l’eau distillée, les mettre dans l’hypochlorite de sodium (eau de javel) à 05% pendant 03 minutes pour une désinfection superficielle et afin d’éliminer les saprophytes, puis les rincer de nouveau avec de l’eau distillée stérile pour éliminer les traces d’eau de javel. Après rinçage, les fragments sont coupés longitudinalement puis trempés dans de l’alcool éthylique à 90% pendant trois minutes pour la fixation. Ensuite, 02 à 04 fragments sont mis dans des boîtes de Pétri (figue 18) contenant du milieu PDA (annexe I) + ATB (Streptomycine et chloramphénicol à raison de 20 mg/100 mL) pour minimiser la contamination, ces dernières sont incubées à 28°C pendant une semaine (Rapilly, 1968).
L’isolement à partir des fragments de racines et collets
En premier lieu, les collets et les racines sont découpés en petits fragments, rincées à l’eau distillée puis désinfectés à l’hypochlorite de sodium. Après un rinçage à l’eau distillée stérile, les collets et les racines sont coupés longitudinalement puis trempés dans de l’alcool éthylique à 90%. Les fragments de collets et racines sont déposés dans des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA + ATB (Streptomycine et chloramphénicol à raison de 20 mg/100 mL) pour minimiser la contamination (figure 19, 20), ces dernières sont incubées à 28°C pendant une semaine (Davet et Rouxel, 1997).
L’isolement à partir du sol
La technique directe
Les suspensions-dilutions (dilution plates
Le principe (figue 21) consiste à mettre une quantité de terre en suspension dans de l’eau stérile, puis à incorporer les différentes dilutions de cette suspension dans le milieu d’isolement. Cette technique comprend plusieurs étapes, allant de la préparation des dilutions jusqu’à l’interprétation des résultats (Rapilly, 1968).
La préparation des dilutions consiste: tout d’abord à ajouter une quantité connue de terre (en général 10 g) à 90 mL d’eau stérile, puis à agiter pendant un temps donné (en général 30 mn), ce qui constitue la dilution 10-1 . Des prélèvements successifs de 10 mL dans cette suspension, puis dans les suivantes, ajoutés chaque fois à 90 mL d‘eau stérile, vont constituer les dilutions 10-2 , 10-3 jusqu’à 10-6 en général.
Rappelons que pour réaliser ces différents prélèvements. Il est primordial d’utiliser des pipettes stériles qu’il faut changer à chaque dilution. Au moment de l’analyse, 10 mL de chaque dilution sont versés dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 90 mL du milieu culture PDA maintenu en surfusion au bain-marie entre 37 et 40°C. Il est important de veiller à ce que la température ne soit pas trop élevée, ce qui aurait pour conséquence d’éliminer les champignons les plus thermosensibles Après homogénéisation, les 100 mL sont répartis en 05 boîtes de Pétri que l’on maintient dans les conditions (température, éclairage, durée d’incubation) les plus propices à l’isolement sélectif du champignon recherché. Certains auteurs préfèrent déposer un volume déterminé de la dilution finale dans chaque boîte de Pétri (en général 0l mL) et verser pardessus le milieu gélosé maintenu en surfusion. L’homogénéisation est réalisée en agitant manuellement les boîtes d’un mouvement circulaire dans le plan horizontal.
Après un certain temps qui selon l’espèce recherchée, peut varier de 02 à 20 jours, la dilution présentant un nombre de colonies suffisant est repérée, mais sans confluences entre ces dernières ni avec des envahisseurs indésirables, ce qui compliquerait l’isolement. En effet, la sélectivité est rarement absolue et il faut être précis pour localiser et identifier le microorganisme recherché sur le milieu d`isolement.
Une variante de cette technique concerne le mode d’incorporation, elle consiste à étaler un très faible volume de chaque dilution à la surface du milieu gélosé solidifié en boîte de Pétri. Le succès de cette technique, repose sur la bonne dispersion de la suspension sur l’ensemble de la surface. Elle favorise le démarrage de la croissance des espèces aérobies et constitue par conséquent un facteur de sélectivité intéressant (Davet et Rouxel, 1997).
La purification
Le repiquage successif\
Cette technique permet d’extraire le champignon recherché de la boîte de Pétri aussitôt qu’il est identifié et que le développement du thalle est suffisant pour permettre un prélèvement.
L’observation des boîtes à la loupe binoculaire ou au microscope, au faible grossissement, permet de s’assurer que la colonie est exempte de contamination. Si tel est le cas, on peut transférer directement un fragment de la culture dans un tube de milieu de conservation gélosé. Dans le cas contraire, il est nécessaire de transplanter des fragments de thalle dans de nouvelles boîtes. Les prélèvements doivent être faits le plus loin possible de l’origine de la colonie (Rapilly, 1968).
Néanmoins, les cultures obtenues risquent d’être contaminées par des bactéries et par des champignons qui sont parfois invisibles et afin d’éviter ce risque, le procédé le plus simple et le plus sûr reste celui de la culture monospore (Rappily, 1968).
La culture monospore
La technique de la culture monospore (figure 22) permet d’obtenir une culture pure à partir des spores fongiques par étalement sur milieu Malt Triton (annexe I). Dans un premier temps, la souche à monosporer est repiquée dans une boîte contenant du milieu PDA et laissée se développer sur la totalité de la surface de la boîte pendant 05 à 06 jours.
Un explant est prélevé à partir de la périphérie de la boîte et introduit dans un tube contenant 09 mL d’eau distillée stérile, après agitation, une suspension sporale est obtenue à partir de laquelle des dilutions au dixième sont réalisées comme suit :
01 mL de la suspension sporale est prélevé puis introduite dans un tube contenant 09 mL d’eau distillée stérile. Cette opération est reproduite autant de fois jusqu’à la dilution voulue.
A partir des deux dernières dilutions (10-3 et 10-4 ), 01 mL est prélevé puis étalé à l’aide de billes stériles sur milieu Malt Triton.
Après 24h d’incubation à 28°C, à l’aide d’une loupe binoculaire, le repérage et la délimitation des spores en germination sont effectués. Ces dernières sont prélevées à raison de 03 à 04 conidies puis déposées dans de nouvelles boîte de Pétri contenant du milieu PDA puis incubées à 28°C pendant une semaine (Rappily, 1968). Matériel et méthodes Milieu Malt-Triton Incubation à 28°C pendant 07 jours
L’identification morphologique
L’identification des Fusarium est difficile en raison, d’une part de la variabilité naturelle de la morphologie des espèces et, d’autre part de l’influence sur cette morphologie de la nature du substrat nutritif sur lequel le champignon s’est développé (Champion, 1997).
L’étude macroscopique
L’identification se fait à l’œil nu, elle se base essentiellement sur la vitesse de croissance et la morphologie des colonies sur milieu PDA qui varie énormément. Le mycélium peut avoir un aspect floconneux, clairsemé ou abondant avec une couleur allant du blanc au violet pâle.
Des sclérotes (forme de conservation hivernale) bruns pâle, bleus sombre à violets sont abondamment produits par certains isolats. Fusarium oxysporum produit une pigmentation magenta sombre sur agar tandis que certains isolats ne produisent aucun pigment. D’autres isolats subissent facilement des mutations et produisent un mycélium raz et muqueux voir humide conséquence de la fusion des sporodochies avec une couleur orange sur milieu PDA (Leslie et Summerel, 2006).
L’étude microscopique
L’identification microscopique des souches a été effectuée par la technique CLA (Carnatian Leaf Agar), elle est basée sur les caractéristiques suivantes :
microconidies (en chaines ou en fausses têtes, de forme ovales, en aiguille, citriformes ou piriformes) ; macroconidies (nombre de cloisons et incurvation) ; conidiophores (monophialides ou polyphyalides) ; chlamydospores (isolées, par deux, en chaînes, terminales ou centrales).
Cette technique de référence consiste à prélever un (ou deux) fragment mycélien issu de la culture monospore est mis dans un milieu gélosé à 02% en présence d’un ou plusieurs fragments de feuilles d’œillet de 03-05 mm2 non traitées par des pesticides et préalablement séchés à 70°C pendant 03 à 04 heures puis stérilisés aux rayons gamma (figure 23). Après une dizaine de jours, les boîtes de Pétri sont directement observées au microscope optique (In situ) (Leslie et Summerell, 2006). Cependant cette identification initiale basée sur les caractéristiques morphologiques est importante pour classer les espèces en petits groupes mais il est très recommandé d’effectuer d’autres techniques plus avancées telles que l’identification moléculaire.
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Table des matières
Introduction
CHAPITRE I : Etude Bibliographique La plante hôte
1. L’origine de la tomate
2. La description botanique
2.1. Le feuillage
2.2. Les fleurs
2.3. Le fruit
2.4. La tige
2.5. La racine
2.6. Les graines
3. La position taxonomique
4. La valeur nutritionnelle
5. La culture de la tomate
5.1. La culture de la tomate dans le monde
5.2. Les maladies de la tomate La pathologie
1. La flétrissure fusarienne (Fusarium wilt)
1.1. Les symptômes externes de la maladie
1.2. Les symptômes internes de la maladie
2. La pourriture des racines et du collet (Fusarium crown and root rot)
2.1. Les symptômes externes de la maladie
2.2. Les symptômes internes de la maladie
3. Les mécanismes de défense
3.1. Les barrières mécaniques
3.2. Les barrières biochimiques
3.2.1. Les polyphénoloxydases
3.2.2. Les phytoalexines
4. Les moyens de lutte
4.2. La lutte physique
4.3. La lutte chimique
4.4. La lutte intégrée
4.5. La lutte biologique
4.6. La lutte génétique Le pathogène
1. Généralités sur le genre Fusarium
2. Généralité sur l’espèce Fusarium oxysporum
3. Caractères culturaux de l’espèce F. oxysporum
3.1. Caractères sur milieu CLA
3.2. Caractères sur milieu PDA
4. La pathogénicité, les formes spéciales et les races
5. Le cycle de vie de F. oxysporum
6. La position taxonomique de l’espèce F. oxysporum La plante médicinale
1. L’origine du genévrier de Phénicie
2. La description botanique
3. La position taxonomique
4. La répartition du genévrier de Phénicie en Algérie
5. L’intérêt économique et écologique
1. L’isolement de l’agent pathogène
1.1. L’isolement à partir des fragments de tiges
I.2. L’isolement à partir des fragments de racines
1.3. L’isolement à partir du sol
1.3.1. La technique directe
1.3.1.1. Les suspensions-dilutions (dilution plates
2. La purification
2.1. Le repiquage successif
3. L’identification morphologique
3.1. L’étude macroscopique
3.2. L’étude microscopique
4. L’identification moléculaire
4.1. L’extraction de l’ADN
4.2. L’identification de l’espèce F. oxysporum par le séquençage de la région TEF-1α
4.2.1. L’amplification par PCR de la région TEF-1α
4.2.1.1. Les séquences d’amorces utilisées
4.2.1.2. Les conditions de la PCR
4.2.1.3. Le programme d’amplification du thermocycleur
4.2.2. La vérification des produits de la PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
4.2.3. Le séquençage des produits de la PCR
4.3. L’identification de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici
4.3.1. L’amplification par PCR des séquences partielles des pg1 et pgx4
4.3.1.1. Les séquences d’amorces utilisées
4.3.1.2. Les conditions de PCr
4.3.1.3. Le programme d’amplification du thermocycleur
4.3.2. La vérification des produits de la PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
4.4. L’identification de F. oxysporum f. sp. lycopersici
4.4.1. L’amplification par PCR du gène de la protéine SIX
4.4.1.1. Les séquences d’amorces utilisées
4.4.1.2. Les conditions de PCR
4.4.1.3. Le programme d’amplification du thermocycleur
4.4.2. La vérification des produits de la PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
5. Le test du pouvoir pathogène
6. L’essai in vitro de la lutte biologique
6.1. La collecte de la plante médicinale
6.2. L’extraction des huiles essentielles
6.4. Le test de l’activité antifongique
6.4.1. Préparation des témoins négatifs
6.4.2 Test de l’activité antifongique
CHAPITRE II : Résultats et discussion
1. L’identification morphologique des isolats
1.1. La culture monospore
1.2. L’étude macroscopique
1.3. L’étude microscopique
1.1. La culture monospore
2. L’identification moléculaire des isolats
2.1. L’amplification par PCR de la région TEF-1α
2.2. Le séquençage des amplicons obtenus
2.3. L’arbre phylogénétique des souches identifiées
2.4. L’identification de la forme spéciale
2.4.1. L’identification de la forme spéciale radicis-lycopersici
2.4.2. L’identification de la forme spéciale lycopersici
3. Le test du pouvoir pathogène
4. L’essai in vitro de la lutte biologique
4.1. L’extraction des huiles essentielles
4.2. Le test de l’activité antifongique
4.3. L’analyse statistique
Conclusion et perspectives
Références Bibliographiques
Annexe
Annexe
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