Etat physiologique de la plante

Etat physiologique de la plante

Champignon modèle et mutants

La souche sauvage B0510 de B. cinerea est issue de la souche SAS56 (lignée d’ascospores) collectée sur grappes de raisin dans un vignoble en Italie entre 1985 et 1987. Afin d’obtenir une souche haploïde, le génotype SAS56 a été cultivé sur un milieu contenant un fongicide, le Benomyl® (Büttner et al., 1994).
D’autre part, trois mutants de B. cinerea ont été utilisés dans cette étude :
Mutant ms : délétion du gène 01745 codant pour une enzyme de la voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire.
Mutant acp1 : délétion du gène 14153 codant pour une protéase acide.
Mutant bot2 : délétion du gène 16381 codant pour une enzyme de la voie de biosynthèse du botrydial, une toxine non spécifique.

Statut physiologique de la feuille saine

La pince DUALEX® SCIENTIFIC permet de mesurer différentes caractéristiques physiologiques des feuilles. Cet outil développé par ForceA® permet de connaitre le contenu surfacique en chlorophylles (µg/cm²), l’indice des anthocyanes épidermaux et l’indice des flavonols épidermaux. Pour effectuer cette analyse, la pince est placée au centre de la feuille et la mesure est répétée sur trois cultures indépendantes sur plusieurs plantes. Les données sont ensuite extraites de l’appareil et analysées.

Infection des feuilles

Pour effectuer les tests de pouvoir pathogène, les quatre souches de B. cinerea sont inoculées sur des feuilles prélevées de plantes d’A. thaliana âgées de 6 semaines. Le dépôt de l’explant mycélien se fait au milieu de la face abaxiale des feuilles. Elles sont ensuite déposées dans des boites de Pétri contenant des billes de verre et de l’eau stérile afin de garantir une humidité saturante puis incubées sous lumière continue à 21°C. Quotidiennement, les feuilles sont photographiées jusqu’à 2 jours après inoculation (J1 et J2). A l’aide du logiciel ImageJ®, les surfaces des lésions provoquées par le champignon sont mesurées permettant ainsi que quantifier les symptômes (Arbelet et al., 2010).

Extraction des Acides Ribonucléiques (ARN)

Les échantillons foliaires sont récoltés 24h après infection. Seule la partie macérée de la feuille inoculée sera prélevée ainsi que 2 à 3 mm de tissus adjacent apparemment sain. Les échantillons sont congelés à l’azote liquide puis broyés dans un mortier stérile. A environ l’équivalent de 0,5 mL de poudre sont ajouté 1,25 mL de TRIzol®. Les tubes sont agités, laissés à température ambiante pendant 5 min pour dissocier les ARN des lipides et protéines contenues dans l’échantillon. Les tubes sont centrifugés pendant 10 min à 13200 rpm ou 16100 rcf (5°C) pour séparer les polysaccharides. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube auquel on ajoute 250 µL de chloroforme. Après agitation par inversion des tubes, ils sont laissés 5 min à température ambiante puis centrifugés pendant 15 min à 10000 rpm ou 9300 rcf (5°C). La phase supérieure translucide est récupérée dans un nouveau tube puis additionné de 625 µL d’isopropanol.
Les tubes sont agités par inversion et laissés 1h dans la glace. Après centrifugation de 10 min à 11000 rpm ou 11200 rcf (5°C) le surnageant est éliminé et le culot lavé avec 1 mL d’éthanol à 70 % froid. Après une centrifugation de 5 min à 8000 rpm ou 5900 rcf (5°C), les culots sont mis à sécher pendant 10 min minimum.Une fois les culots secs, 25 µL de Tris EDTA (TE) sont ajoutés et les tubes placés 10 min au bain marie à 42°C. Les échantillons sont quantifiés au spectrophotomètre SPECTROstar Nano® de BMG LABTECH (2 µL/échantillon).
L’intégrité structurelle des ARN est vérifiée grâce à une migration en électrophorèse de chaque échantillon (1 µL d’ARN extraits + 2 µL de tampon de charge + 7 µL d’eau stérile) déposé sur gel d’agarose à 1 %. La migration s’effectue à 75V pendant 30 min.

Traitement des ARN par la DNAse et transcription inverse (RT-PCR)

Les ARN de chaque échantillon ont été traités avec une DNAse pour éliminer les restes d’ADN génomique (2 µg de solution d’ARN, 2 µL de Tampon Buffer 10 X – MgCl2, 2 µL de solution de DNAseI, RNAse free et qsp 20 µL d’eau DEPC). Après addition du tampon de la DNAse et de l’eau aux ARN, les tubes sont incubés pendant 45 min à 37°C. Pour mettre fin à la réaction, 2 µL de solution d’EDTA (Thermo Scientific®) sont ajoutés et les échantillons mis à incuber pendant 10 min à 65°C. La transcription inverse permet d’obtenir des ADN complémentaires (ADNc) des ARN extraits. Pour cela, à 2 µg de solution d’ARN ayant subi un traitement à la DNAse sont ajouté 2 µL d’oligonucléotides (dt) (Eurofins Scientific®) et 13 µL d’eau DEPC. La désoxythymine (dt) s’hybride à la queue PolyA des ARNm servant ainsi d’amorce pour permettre la synthèse des ADNc par la transcriptase inverse. Le mélange est incubé pendant 5 min à 65°C pour dissocier les oligos. Après addition de 15 µL de mix à chaque échantillon (8 µL de Tampon Buffer 5 X, 4 µL de dNTPs à 10 mM, 1 µL d’enzyme Ribolock et 2 µL de RevertAid ; Thermo-Fisher Scientific®), une incubation de 60 min à 42°C va permettre l’élongation des brins d’ADNc. Puis une nouvelle incubation de 10 min à 70°C va inactiver l’enzyme. Après avoir ajouté 50 µL d’eau qPCR (eau stérile, distillée, purifiée filtrée à 0,2 µm et sans endotoxines) à chaque échantillon, les ADNc sont quantifiés au spectrophotomètre SPECTROstar Nano®.

Test de Wilcoxon-Mann-Whitney

Ce test statistique est plus communément appelé Mann-Whitney, il est non paramétrique et permet de comparer la distribution de deux échantillons indépendants (avec un effectif inférieur à 30) en ordre croissant pour déterminer leur rang. Le risque d’erreur utilisé était α = 5 %. L’hypothèse nulle H0 indique que les deux échantillons ont la même distribution. Si H0 est acceptée au risque α, cela signifie que la différence entre les moyennes des deux échantillons est due au côté aléatoire de l’échantillonnage. Si au contraire l’hypothèse H0 est rejetée avec le même risque, cela signifie que les deux échantillons sont différents.

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Table des matières

I. Introduction bibliographique
II. Matériels et méthodes
A. Matériel végétal
B. Matériel fongique
C. Méthodes utilisées
III. Résultats
A. Etat physiologique de la plante
B. Pouvoir pathogène
C. Observation des infections à la loupe binoculaire
A. Etude de l’expression des gènes dans les tissus foliaires
IV. Discussion
V. Conclusions et perspectives
VI. Références bibliographiques
A. Articles scientifiques
B. Sites internet
VII. Annexes

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