Etapes membranaires de la transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G

Les RCPG

  Quel que soit le point de vue choisi, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) s’imposent comme la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils sont présents chez les plantes, les levures, les insectes, les nématodes, les vertébrés et sont codés par une des plus grandes familles de gènes : 1% du génome de Drosophilia, plus de 5% de celui de Caenorhabditis elegans. Chez l’homme près de 1% du génome code pour 1000 à 2000 RCPG qui ont des implications dans toutes les grandes voies de signalisation membranaire. La diversité de leurs fonctions démontre également l’importance de cette famille (Bockaert, 1999; Kenakin, 2002; Marinissen, 2001; Pierce, 2002). Bien qu’ayant une structure-cœur commune, ils ont la capacité de lier spécifiquement des ligands de natures très différentes (du photon au peptide, des hormones aux molécules odorantes) et de transmettre dans chaque cas l’information à la cellule. Cette implication dans des processus multiples a naturellement fait d’eux une cible pharmacologique privilégiée. A ce jour plus de 50% des médicaments mis sur le marché sont des ligands de RCPG et traitent des pathologies aussi diverses que l’asthme, l’hypertension, les allergies ou la migraine.

Signalisation sans les protéines G

   A leur découverte les RCPG ont été uniquement caractérisés par leurs facultés d’interaction avec les protéines G. De plus en plus de travaux mettent en évidence un passage de signal directement entre le récepteur et les effecteurs. Ainsi des motifs de liaison connus tels que les domaines PDZ ou poly-proline ont été retrouvés dans les séquences intracellulaires de certains récepteurs. Nombreuses sont les protéines qui sont ainsi capables d’interagir directement avec certains RCPG, notamment la famille des petites protéines G, ou bien la tubuline, des kinases, Homer, NHERF, etc. (Ferguson, 2001; Hall, 1999). Ces liaisons avec des protéines dites d’échafaudage entraînent également une réponse de la cellule. Le récepteur β-adrénergique transmet de la sorte son signal à ERK par une voie indépendante des protéines G (Shenoy, 2006). Ces voies constituent à ce jour un important axe de recherche pour appréhender toutes les implications des RCPG dans la transduction du signal.

Le cas particulier d’ORL1

   La connaissance des séquences de ces récepteurs a permis d’identifier un gène codant pour un RCPG possédant 60 % d’homologie. La comparaison des séquences avec différents RCPG a permis de supposer qu’il s’agissait d’un récepteur de type opioïde, capable de se lier aux protéines Gi/o. Après expression dans des cellules CHO, il s’est avéré capable de fixer un antagoniste opioïde « universel » (la diprénorphine), et également un agoniste opioïde « universel » (l’étorphine). Dans ce dernier cas, cette liaison entraîne une inhibition de l’adénylate cyclase. Cette inhibition ayant lieu à des concentrations trois fois plus importantes que pour les autres récepteurs opioïdes, et la liaison d’autres ligands opioïdes s’étant révélée peu spécifique, ce nouveau récepteur humain a été appelé ORL-1 pour opioïd like receptor (Mollereau, 1994). La découverte de son peptide endogène, la nociceptine (Meunier, 1995; Reinscheid, 1995 ), a permis d’observer qu’en dépit de différences notables, il existait d’importantes similarités de structure et de fonction entre ORL-1 (et son ligand) et le trio de récepteurs opioïdes (et leurs ligands). Ce récepteur, renommé NOP (Nociceptine OPioïde), est donc à présent un membre à part entière de la famille des récepteurs aux opiacés (Henderson, 1997) mais ne sera que peu évoqué par la suite par manque de données comparatives avec les autres membres de la famille.

Effecteurs opioïdes et traitement chronique

   Après activation, les protéines G vont à leur tour transmettre l’information aux effecteurs, principalement l’adénylate cyclase (protéine membranaire qui convertit l’ATP en AMP cyclique) et des canaux ioniques (potassique et calcique). Comme pour les autres RCPG, il est probable que le dimère Gβγ participe à la signalisation cellulaire. Enfin, en plus de leurs propriétés analgésiques, de nombreux autres effets de ces récepteurs sont suspectés en lien avec d’autres protéines membranaires (chimiokines) ou avec des voies de signalisation intracellulaire (voie des MAP kinase, Erk, … (Tegeder, 2004)). Sans rentrer dans le détail de tous les effecteurs et voies de signalisation impliquées (Connor, 1999; Samways, 2006; Standifer, 1997), il est important de s’attarder un instant sur un des effets spécifiques des opioïdes qui est la tolérance et la dépendance aux opiacés. La tolérance se définit comme une perte des effets des analgésiques aux doses habituellement actives. Quand à la dépendance, elle est caractérisée par le besoin de maintenir l’exposition à la drogue pour éviter les syndromes de manque, physique et psychique (Nestler, 1992). Ces phénomènes sont induits par une prise chronique des dérivés de l’opium (morphine, héroïne, …) et non (ou peu) par les ligands endogènes. Au niveau cellulaire ils correspondent à une régulation négative du système (down-régulation) qui peut avoir lieu à chaque niveau de la transmission du signal : nombre de récepteurs membranaires et/ou d’effecteurs plus faible, fixation moindre des ligands, … (Bailey, 2005 ; Law, 1999a ; Yu, 2003). Ainsi, un traitement chronique à la morphine de cellules surexprimant le récepteur µ montre une modification des protéines exprimées à la membrane (Mouledous, 2005) mais également au niveau de la cellule entière (Neasta, 2006). Ces mécanismes restent à ce jour mal connus.

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Table des matières

Chapitre I : Introduction : Récepteurs couplés aux protéines G et membrane plasmique
1 – Les RCPG 
1.1 – Structure
1.2 – Classification
1.3 – Le cycle de signalisation
1.3.1 – La fixation des ligands
1.3.2 – Les protéines G
→ Le trimère
→ Structure
→ Cycle GDP / GTP
→ Pré-couplage avec le récepteur
1.3.3 – Les effecteurs
1.3.4 – Internalisation consécutive à la fixation de l’agoniste
1.4 – Signalisation sans les protéines G
2 – Le récepteur µ dans la famille des récepteurs opioïdes
2.1 – Préambule
2.2 – Les différents membres de la famille
2.2.1 – Mu, delta et kappa (µ, δ, κ)
2.2.2 – Le cas particulier d’ORL1
2.3 – Les ligands opioïdes
2.4 – Les protéines G de liaison
2.5 – Effecteurs opioïdes et traitement chronique
2.6 – Système de signalisation sans les protéines G
2.7 – Dimérisation
2.7.1 – Au sein de la famille
2.7.2 – Avec d’autres récepteurs
3. La membrane plasmique 
3.1 – Découverte de la membrane
3.1.1 – Ses constituants
3.1.2 – Ses rôles
3.1.3 – Les premiers modèles d’organisation membranaire
3.2 – Complexification des modèles : notions de domaines
3.2.1 – DRM ou raft
→ Découverte
→ Problèmes soulevés
→ Rafts et dynamique
3.2.2 – De l’influence du cytosquelette cortical
3.2.3 – Interactions entre protéines
→ Interactions directes
→ Interactions à longue distance
3.3 – La mosaïque membranaire …
4 – Organisation membranaire des RCPG 
4 1 – Premiers modèles de rencontre des partenaires
4 2 – Analyse de la diffusion des RCPG
4.2.1 – A l’état basal
4.2.2 – Origine des diffusions observées
4.2.3 – Effets des ligands
5 – But de l’étude 
Chapitre II : Techniques : Principes et instrumentations des deux techniques utilisées pour l’étude de l’organisation membranaire du récepteur µ
1 – Le retour de fluorescence après photoblanchiment : FRAP
1.1 – Principe
1.2 – Le FRAP à rayon variable : FRAPrv
1.3 – Détermination des paramètres
1.3.1 – Analyse individuelle des retours de fluorescence
1.3.2 – Analyse par rayon
→ La fraction mobile
→ Le coefficient de diffusion
→ Tailles relatives de la cellule, de la zone d’observation et des domaines
→ Erreur sur les paramètres
1.1.3 – Analyse à deux populations
1.4 – Montage et conditions d’expériences
1.4.1 – Montage
1.4.2 – Limites et contrôles afférents à la technique
1.4.3 – Extrapolation du point IPB
1.4.4 – Analyse sur système modèle
2 – Le suivi de particule unique : SPT 
2.1 – Principe
2.1.1 – Principe général
2.1.2 – Différents types de marquage des molécules d’intérêts
2.2 – Montage
2.2.1 – Le contraste de Nomarski
2.2.2 – Appareillage utilisé
2.2.3 – Détection des particules d’or
→ En post-traitement
→ En temps réel
2.3 – Les colloïdes d’or
2.3.1 – Concentration stabilisatrice
2.3.2 – Fonctionnalisation simple couche et problèmes rencontrés
2.3.3 – Problème relatif à la présence de vésicules
2.3.4 – fonctionnalisation double couche et résolution des problèmes
2.4 – Analyse des trajectoires
2.4.1 – Le déplacement quadratique moyen
→ Calcul
→ Le D1-2
→ Différents types de diffusion simples
2.4.2 –Détection des zones de confinements
→ Algorithmes de Simson et Saxton
→ Modification de l’algorithme
→ Détection des sauts entre domaines
2.4.3 – Résolutions spatiale et temporelle
→ Limites de résolution
→ Critères de reconnaissances des colloïdes immobiles
Chapitre III : La lignée cellulaire SH-SY5Y surexprimant T7-EGFP hMOR : pharmacologie du récepteur et caractéristiques des cellules
1 – La lignée cellulaire : les SH-SY5Y 
1.1 – La lignée sauvage
1.2 – La lignée transfectée stable
2 – Tests de fonctionnalité 
2.1 – Liaison des ligands
2.2 – Transmission du signal à l’adénylate cyclase
2.2.1 – Inhibition de l’adénylate cyclase
2.2.2 – Effet de la toxine pertussique
3 – Environnement lipidique 
4 – Internalisation due aux ligands 
4.1 – Littérature
4.2 – Résultats
5 – Le cytosquelette 
6 – Fluorescence totale des cellules et survie cellulaire 
7 – Le glycocalyx 
8 – Présence du récepteur dans les DRMs ? 
Chapitre IV : Analyse par FRAPrv et SPT de la diffusion latérale de T7-EGFP-hMOR
1 – Analyse à l’état basal 
1.1 – Organisation à température ambiante
1.1.1 – Analyse par FRAP à rayon variable
→ Résultats
→ Modèles d’organisation latérale
1.1.2 – Influence du glycocalyx
→ Premiers résultats de SPT
→ Effet du glycocalyx sur la diffusion de µ* observée par FRAPrv
1.1.3 – Analyse en SPT, après dégradation du glycocalyx
→ Les différents modes de diffusion observés
→ Les trajectoires confinées
→ Variations du coefficient de diffusion avec la taille des domaines
→ Comparaison des résultats en présence et en absence du glycocalyx
1.1.4 –Un modèle d’organisation pour le récepteur µ* à 22°C
1.2 – Effet de la modulation de la température
1.2.1 – Analyse par FRAPrv *
→ Diminution de la température : analyse à 14°C
→ Augmentation de la température : analyse à 37°C
1.2.2 – Analyse par SPT à 37°C
1.2.3 – Diffusion de sondes lipidiques, analyse par FRAPrv
→ Résultats
→ Comparaison avec la littérature
1.2.4 – Un modèle d’organisation pour le récepteur µ* à 37°C
1.3 – Influence du cytosquelette d’actine sur la diffusion de µ*
1.3.1 – Etude en fonction de la température par FRAPrv
1.3.2 – Etude à température ambiante par SPT
1.3.3 – Comparaison des résultats et modèle d’organisation
1.4 – Influence des protéines G sur la diffusion de µ* : étude en fonction de la température par FRAPrv
1.4.1 – Dynamique des récepteurs µ* à 22°C
1.4.2 – Dynamique des récepteurs µ* à 14°C
1.4.3 – Dynamique des récepteurs µ* à 37°C
1.4.4 – Origine des domaines et modèle d’organisation
2 – Analyse par FRAPrv de la dynamique de µ* en présence de ligands
2.1 – Effet des antagonistes
2.2 – Effet des agonistes
2.2.1 – La morphine
→ Effet de la morphine sur l’organisation de µ*
→ Origine de ces domaines
→ Modèle d’organisation des récepteurs µ* activés par la morphine
2.2.2 – Le DAMGO
→ Effet du DAMGO sur l’organisation de µ*
→ Analyse à deux populations et modèle d’organisation
→ Origine de ces domaines
2.2.3 – Comparaison de l’effet des deux agonistes sur l’organisation membranaire de µ*
Chapitre V : Conclusions et Perspectives
Références bibliographiques

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