Etapes du dosage de la vitamine D au laboratoire

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Intérêts dans le diagnostic médical.

L’établissement des valeurs usuelles pour chaque constituant biologique permet aux cliniciens
▪ de fixer une limite de décision adaptée à chaque cas particulier de patient,
▪ de vérifier un état de santé chez un patient,
▪ d’alerter le patient sur les risques encourus,
▪ de confirmer ou conforter un diagnostic médical,
▪ de dépister une affection cliniquement non décelable

Intérêts dans le pronostic et le suivi thérapeutique

L’étude comparative des valeurs usuelles des populations saines et des valeurs des populations malades permet de classer les examens suivant leur pouvoir discriminant.
Les valeurs usuelles permettent également d’évaluer l’effet thérapeutique, et/ou de surveiller un risque dû à la prise de médicaments. On peut ainsi évaluer la position d’une mesure isolée par rapport aux limites de distribution d’une population saine ou sous la même thérapeutique et en tirer des conclusions quant à la suite du traitement (le poursuivre ou le modifier) [10].

Intérêts en épidémiologie

L’établissement des valeurs de référence permet de mesurer la prévalence de certaines pathologies dans une population à un échelon régional, national ou international. Pour cela il est souhaitable que l’influence des variations biologiques soit réduite au minimum.
Une autre application épidémiologique est la comparaison des valeurs observées sur des populations très différentes. On peut ainsi étudier des différences ethniques, de régime alimentaire, de régime socioculturel ou génétique.
On peut également suivre l’évolution à long terme des conditions de santé d’une population. De même les conditions de transmissibilité des valeurs de référence d’un laboratoire à l’autre, ou d’un pays à l’autre, pourront être précisées [10].
En somme, les intérêts multiples des valeurs de référence dans notre contexte justifient le bien fondé de notre travail

VITAMINE D

Définition

La vitamine D ou 1,25-dihydroxyvitamine D ou calcitriol (Figure 2) estLiposoluble et appartient au groupe des sécostéroïdes de par sa structure et ses fonctions [11]. Elle provient de deux précurseurs immédiats (Figure 3) : la vitamine D2 ou ergocalciférol (Figure 3A) qui est d’origine végétale et la vitamine D3 ou cholécalciférol (Figure 3B) qui est d’origine animale.
Pour la quantifier dans un médicament ou dans un aliment, on utilise l’unité internationale (UI) ou le microgramme (μg). Sa concentration sanguine estexprimée quant à elle en nanomole par litre (nmol/l) ou en nanogramme par millilitre (ng/ml). Ces unités sont liées par la relation : 100 UI=2,5 μg ou 1 nmol/l=0,4 ng/ml.

Synthèse de la vitamine D

La synthèse endogène débute au niveau cutané. On obtient la vitamine D (D2 ou D3) qui est transportée dans le sang par la Vitamin D-Binding Protein (DBP) jusqu’au foie où elle est hydroxylée pour former le 25-hydroxy vitamine D [25(OH) D]. Cette hydroxylation hépatique se fait sous l’action de la 25-hydroxylase qui est très peu régulée [17]. La demi-vie de la 25(OH) D est de l’ordre de trois semaines et sa concentration sérique représente le statut vitaminique D d’un individu.
La vitamine D est de nouveau hydroxylée sous l’action de la 1 alpha-hydroxylase, pour donner la 1,25 dihydroxyvitamine D [1,25(OH)2D] ou calcitriol ; c’est le métabolite actif de la vitamine D dont la demi-vie est courte (environ quatre heures) (Figure 5). Cette seconde hydroxylation est réalisée classiquement dans les cellules du tubule proximal rénal.
Ensuite, le complexe 25(OH) D-DBP est filtré par le glomérule puis réabsorbé par les cellules proximales grâce à la mégaline.
Environ 80 à 90% de la 25 (OH) D et de la 1,25 (OH) 2D sont transportés dans la circulation générale par la DBP. Le restant est lié à l’albumine ou aux lipoprotéines (10 à 20 %) et une faible fraction demeure libre [18].
De nombreux tissus de l’organisme sont également capables d’hydroxyler la 25 (OH) D en 1,25(OH)2D puisqu’ils expriment la 1α-hydroxylase. Ceci permet d’envisager les propriétés extra-osseuses de la vitamine D.
Il existe par ailleurs une voie d’inactivation de la vitamine D via une enzyme, la 24 α–hydroxylase (CYP 24) qui induit la production de composés inactifs [24,25(OH) 2 vitamine D et 1, 24,25 (OH) 3 vitamine D] transformés ensuite en acide calcitroïque inactif et éliminé par voie fécale [19].

Actions de la vitamine D sur le métabolisme de l’organisme

Homéostasie phosphocalcique

➢ Effets de l’excès en vitamine D
Le rôle le mieux connu de la vitamine D est le maintien de l’homéostasie phosphocalcique par augmentation de l’absorption intestinale du calcium et du phosphore. Dans la cellule intestinale, la 1,25 (OH)2D induit la synthèse de la :
 Protéine TRPV6 qui crée un canal calcique au niveau de la bordure en brosse apicale de l’entérocyte, permettant l’entrée de calcium dans la cellule ;
 Calbindine 9K qui transporte le calcium dans l’entérocyte ;
 Protéine NPT2b, cotransporteur sodium-phosphate favorisant l’entrée du phosphate dans l’entérocyte [24,25].
Au niveau rénal, la 1,25(OH)2D augmente la réabsorption tubulaire distale du calcium et la réabsorption tubulaire proximale du phosphore. Ce processus permet une augmentation significative de la fraction de calcium et de phosphore absorbée par rapport à la quantité ingérée. Ce mécanisme nécessite une concentration plasmatique élevée de vitamine D et il est donc prépondérant lorsque les apports en calcium et phosphore sont faibles dans certaines conditions physiologiques (croissance, grossesse) ou pathologiques (hyperparathyroïdie).
➢ Effets du déficit en vitamine D
Un déficit en vitamine D entraîne une diminution d’absorption du calcium intestinal. Il s’ensuit une tendance à l’hypocalcémie qui augmente les concentrations plasmatiques de parathormone. Cette dernière favorise le remodelage osseux, contribuant à long terme à l’ostéoporose du sujet âgé. Dans ce cas d’hypovitaminose, elle stimule les ostéoclastes, libérant ainsi les minéraux contenus dans la matrice osseuse.
Pour cela, elle est d’abord reconnue par les ostéoblastes, qui surexpriment alors le ligand RANKL ; celui-ci se fixe sur son récepteur situé sur les pré-ostéoclastes et engendre la transformation du pré-ostéoclaste en ostéoclaste mature. Les ostéoclastes sécrètent des collagénases et de l’acide chlorhydrique qui détruisent le tissu osseux et libèrent le calcium et le phosphore contenus dans l’os vers la circulation sanguine et augmentent ainsi le produit phospho-calcique [26].
Il existe une relation étroite, inversement proportionnelle entre les concentrations sériques de parathormone et celles de vitamine D. La parathormone commence à augmenter quand le taux de 25 (OH)D est inférieur à 30 ng/ml. L’hypovitaminose D chronique a des effets néfastes sur l’os (ostéomalacie) et les muscles (myopathie proximale), y compris chez l’adulte jeune par ailleurs en bonne santé : elle provoque une fragilisation de l’os, qui aboutira à plus ou moins long terme à une ostéoporose, le tout augmentant le risque de fractures.

Auto immunité

Les maladies auto-immunes (MAI) représentent la troisième cause de morbidité dans les pays industrialisés. Elles résultent de l’exposition d’individus génétiquement prédisposés à certains facteurs environnementaux et traduisent une rupture de la tolérance immunitaire. Les effets de la vitamine D sur le système immunitaire sont connus et bien décrits (Figure 6).

Mécanisme d’action de la vitamine D

Parmi les tissus et cellules cibles de la vitamine D on note les cellules immunitaires et endothéliales, les seins et le cerveau. La vitamine D se fixe sur le récepteur dénommé Vitamine D Receptor (VDR) situé dans le cytosol de ces cellules ; cela représente le point de départ d’un mécanisme hormonal induisant les effets phosphocalciques et osseux de la vitamine D.
Une fois lié au calcitriol, le VDR s’associe à une autre protéine, le récepteur de l’acide rétinoïque (RXR) puis à l’ADN dans des sites spécifiques appelés éléments de réponse à la vitamine D (VDRE) ; la conséquence est une stimulation ou une inhibition de la synthèse protéique (Figure 7 ).

Stockage de la vitamine D

Contrairement aux autres vitamines liposolubles, la vitamine D n’est pas stockée majoritairement dans le foie mais dans le tissu adipeux et les muscles ; elle s’y trouve sous forme de 25 hydroxy vitamine D. Elle est donc mobilisable en cas de diminution des apports alimentaires ou de baisse de la synthèse cutanée (période hivernale par exemple).
Sa distribution dans l’organisme varie selon la molécule. Le cholécalciférol (D3) qui représente 65 % de l’ensemble de la vitamine D de l’organisme est principalement stocké dans le tissu graisseux (75%) tandis que la 25(OH)D qui représente 35 % de la vitamine D de l’organisme, possède une distribution plus ubiquitaire (20 % dans les muscles, 30 % dans le sérum, 35 % dans le tissu graisseux et 15 % dans les autres tissus) [22]. C’est la 25(OH)D qui représente le stock de vitamine D de l’organisme et qui doit donc être dosée pour estimer le statut vitaminique D de l’organisme.

Mécanismes de régulation de la vitamine D

C’est au niveau de l’enzyme 1α-hydroxylase rénale que s’effectue le contrôle de la concentration en vitamine D active. L’hydroxylation rénale est régulée par différents systèmes selon les besoins de l’organisme [23] :
 La Parathormone ou Hormone parathyroïdienne (PTH) stimule l’expression de la 1α -hydroxylase et la conversion de la 25 (OH)D en 1,25 (OH) 2 D. A l’inverse, la vitamine D exerce un rétrocontrôle négatif sur la synthèse de la PTH en inhibant la synthèse par les glandes parathyroïdes ;
 La Calcitonine stimule l’expression de la 1α-hydroxylase et celle de la PTH ;
 L’hypocalcémie et l’hypophosphatémie stimulent l’expression de la 1α hydroxylase. A l’inverse l’hypercalcémie et l’hyperphosphatémie l’inhibe ;
 Le Fibroblast Growth Factor (FGF23), libéré par l’os en croissance, témoin d’un climat phosphocalcique satisfaisant, effectue un rétrocontrôle négatif sur la 1α-hydroxylase et stimule la synthèse de la 24-hydroxylase. En plus, il diminue directement l’absorption phosphocalcique intestinale et la réabsorption rénale ; ceci entraine une diminution de la concentration de 1,25(OH)2D. A l’inverse, la vitamine D exerce un rétrocontrôle positif sur la synthèse de FGF23 par l’ostéocyte ;
 Le taux de 1,25(OH)2D circulant s’autorégule lui-même : un excès inhibe la production et l’activité de la 1α-hydroxylase et stimule la 24, hydroxylase ce qui permet de réduire sa propre concentration ;
 D’autres hormones (insuline, prolactine, hormone de croissance) stimulent la production de 1,25(OH)2D.

Dosage de la 25 hydroxy vitamine D ou 25(OH)D

Cependant, considéré comme un dosage de routine, il permet d’évaluer le statut vitaminique D [24,28].
Il est relativement facile à pratiquer et est disponible dans de nombreux laboratoires. Toutefois, sa mise au point n’est pas facile [29]
Les principales difficultés proviennent du fait que la 25(OH)D est une molécule hautement hydrophobe et qu’il existe deux formes à doser, la 25(OH)D2 et la 25(OH)D3. La désignation 25(OH)D est utilisée pour intituler les résultats rendus, lorsque la méthode de mesure ne permet pas de les distinguer [30].
Les techniques de dosage de la 25(OH)D sont de deux ordres : l’immunodosage (la plus pratiquée) d’une part et, d’autre part, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse.

Dosage de la 1,25 dihydroxyvitamine D ou 1,25(OH)2D

Il est difficile car nécessitant des techniques de séparation de la 1,25(OH)2D des autres métabolites de la vitamine D ; il y a environ 1000 fois moins de 1,25(OH)2D que de 25(OH)D dans le sérum. Il existe des techniques radio-immunologiques nécessitant une extraction par des solvants organiques ou une immuno-extraction sur mini-colonnes ; Cependant, la spectrométrie de masse reste la méthode de référence.
Les indications de ce dosage viennent en seconde intention dans le cadre d’un bilan extensif du métabolisme phosphocalcique, particulièrement [31] :
 Une hypercalciurie (avec ou sans hypercalcémie) avec un taux de parathormone bas ou normal ;
 Un diabète phosphaté primitif posant le diagnostic différentiel des rachitismes vitamino-résistants pseudo-carentiels.
Les valeurs de référence habituelles de la 1,25 dihydroxyvitamine D varient avec l’âge : 30-150 pg/ml chez le nourrisson, 20-80 pg/ml chez l’enfant prépubère de plus de 3 ans, 30-120 pg/ml chez l’adolescent et le sujet adulte [31].

Facteurs influençant le dosage

➢ Facteurs pré-analytiques
En pratique, c’est le sérum qui est le plus utilisé.
Le dosage de la 25(OH)D en HPLC ou en SM a montré des problèmes de reproductibilité lorsque l’échantillon (sérum ou plasma) était recueilli dans des tubes à gel [32].
La 25(OH)D est extrêmement stable dans le sérum, rendant inutile des précautions particulières pour la conservation des échantillons. En pratique, si le dosage est effectué dans la journée, l’échantillon (décanté) peut rester à température ambiante ; s’il est décalé, l’échantillon sera conservé à −20°C [33].
➢ Facteurs analytiques
Il n’existe pas de méthode de référence aujourd’hui pour le dosage de la 25(OH)D. Des discordances modérées mais significatives existent entre les différentes techniques actuellement utilisées [34]. Il faut choisir une technique qui mesure les deux formes : 25(OH)D2 et 25(OH)D3[23]. La technique de chimiluminescence, non encore validé comme technique de référence est venue révolutionner le dosage de la vitamine D total avec une sensibilité et spécificité avoisinant 100%.

Indications du dosage de la vitamine D

Les valeurs de référence proposées (30-60 ng/ml) sont avant tout applicables aux effets « musculosquelettiques » et phosphocalciques de la vitamine D. On peut donc raisonnablement proposer de doser la 25(OH)D chez les patients souffrant de :
 Ostéomalacie ;
 Ostéoporose avec ou sans fracture ;
 Traitement par les corticoïdes, les anti-aromatases, les analogues de la GnRH ;
 Maladies entraînant une malabsorption :
o Maladie coeliaque ;
o Maladie de Crohn ;
o Mucoviscidose ;
o Chirurgie bariatrique ;
o Insuffisance rénale ;
o Hyperparathyroïdie
 Traitements pouvant modifier significativement le métabolisme de la vitamine D, principalement des inducteurs enzymatiques comme le kétokonazole, certains anti-comitiaux et barbituriques, et certains traitements de l’infection à VIH comme l’éfavirenz.

Dosage de la vitamine D

Appareillage

Le dosage de la vitamine D total a été réalisé sur le Cobas E411, qui est un appareil d’immuno-dosage de dernière génération de Roche Diagnostic (France).
Il utilise la technique chimiluminescence avec méthode de détection électrique des complexes Antigène-anticorps d’où sa très grande précision, sensibilité et spécificité avec une cadence de 400 test par heures avec 18 paramètres différents.

Etapes du dosage de la vitamine D au laboratoire

Nous décrivons ici, les différentes étapes de la méthode et la procédure utilisée au laboratoire pour doser la vitamine D.

Principe

Test par électro chimiluminescence (ECLIA) pour la détermination in vitro de la teneur totale en 25-hydroxyvitamine D.
Il utilise la compétition mettant en jeu la protéine porteuse de la vitamine D (VDBP) : Les échantillons sont prétraités pour dissocier la vitamine D (25-OH) de sa protéine porteuse (VDBP). Les échantillons prétraités sont incubés avec une VDBP recombinante marqué au ruthénium afin de former un complexe. Pour occuper les sites libres des VDBP ruthénylés, de la vitamine D (25-OH) biotinylée est ajoutée. Celle-ci interagit alors avec les microparticules tapissées de streptavidine. La vitamine D (25-OH) biotinylée rentre en compétition avec la vitamine D (25- OH) de l’échantillon.

DISCUSSION

Le but de la détermination des valeurs usuelles est de définir les valeurs décisionnelles pour le diagnostic, propre à un laboratoire et de se poser la question à savoir quels seuils faudrait-il prendre ? Est-ce les seuils de la technique utilisée ou les seuils recommandés par les consensus ? afin de pouvoir faire une échelle de correspondance entre les différentes techniques pour faciliter les interprétations et les diagnostics des anomalies.
Ainsi le GBEA et la norme ISO 15189 pour les laboratoires de biologie médicale et la directive 98/79/CE pour les industriels du diagnostic in vitro, prescrivent à des titres divers l’utilisation ou la mention de limites de références sur les comptes-rendus d’analyse et sur les notices des réactifs de laboratoire [1, 2, 5].
En outre la sélection d’une population de référence n’est pas facile, c’est un véritable défi. Il est difficile de sélectionner sur un nombre forcément restreint, un groupe d’individus représentatif de la diversité biologique rencontrée dans les laboratoires de biologie clinique.
D’autre part, la variabilité analytique entre les systèmes analytiques reste un facteur limitant pour la détermination des valeurs de référence par tous les laboratoires. Il est quand même possible, à défaut, de déterminer les valeurs usuelles.
Ce travail nous a permis d’établir les valeurs usuelles de la vitamine D, dosée par electrochimiluminescence dans une population adulte sénégalaise en bonne santé apparente. Ces valeurs pourront servir d’outil de travail pour une interprétation plus juste des résultats des cliniciens.
Nos résultats ont été exprimés selon les recommandations de La NACB et l’ATA en déterminant les intervalles de référence définis sur la base de l’intervalle de confiance à 95 % situé entre les percentiles 2,5 et 97,5 avec le calcul de la médiane [35].
Les percentiles 2,5 et 97,5 définissant 95% des valeurs centrales se situent entre 23,2 et 25,08 ng/ml avec une valeur médiane à 24,14 ng/ml. L’intervalle de référence pour la vitamine D proposée par le fabricant est la même pour le sérum et échantillons de plasma (30-70 ng/ml) [4]. On constate que les valeurs usuelles proposées par le fabricant sont au-dessus des valeurs de notre étude préliminaire. Ceci nous pousse à poursuivre cette étude avec un échantillonnage beaucoup plus grand. Par ailleurs les études similaires menées en Tunisie [36] et aux Etats Unis [37], avaient retrouvées des valeurs différentes. Naifar M. et al [36] qui ont travaillé sur des femmes ménopausées avaient obtenus des valeurs largement inferieures pour la limite basse (3–42 ng/mL). Cette différence pourrait s’expliquer par le fait que dans la population d’étude il y’avait une prédominance de femmes voilées donc avec une faible exposition au soleil. Quant au travaux de Holick MF et al [37] effectués dans la population générale américaine, les limites supérieures comme inférieures étaient aussi différentes (7,61-55,5 ng/ml) par rapport à notre étude. Par ailleurs la valeur moyenne de son étude était proche de la nôtre (25,7 vs 23,91 ng/mL). Cette différence pourrait s’expliquer par une méthodologie qui est différente et par l’effectif de nos populations (400 vs 23) d’une part, mais aussi par le phototype de nos sujets (VI) et les conditions (nutritionnelles ; environnementales ; vestimentaire voire professionnelle …) [38,39].
L’analyse de variance de la vitamine D en fonction du sexe et de l’âge a montré des variations statistiquement significatives avec des valeurs de p< 0,05.
Par contre, dans la littérature on note que les valeurs observées ne varient pas en fonction du sexe, ni en fonction de l’âge à l’exception des enfants [24] qui ne font pas partie de notre étude. Du fait de notre méthodologie qui est différente de celle décrite dans la littérature et du faible effectif de notre population, cette différence notée pourrait être levée en augmentant l’effectif et en utilisant la même méthodologie que celle décrite dans la littérature.

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
1. CONCEPT DE VALEURS USUELLES
1.1. Définition
1.2. Intérêts des valeurs usuelles
1.2.1. Intérêts dans le diagnostic médical.
1.2.2. Intérêts dans le pronostic et le suivi thérapeutique
1.2.3. Intérêts en épidémiologie
2. VITAMINE D
2.1. Définition
2.2. Origine, synthèse et activité biologique de la vitamine D
2.2.1. Source alimentaire
2.2.2. Synthèse de la vitamine D
2.2.3. Actions de la vitamine D sur le métabolisme de l’organisme
2.2.3.1.Homéostasie phosphocalcique
2.2.3.2.Auto immunité
2.3. Mécanisme d’action de la vitamine D
2.4. Stockage de la vitamine D
2.5. Mécanismes de régulation de la vitamine D
3. Dosage de la vitamine D
3.1. Dosage de la 25 hydroxy vitamine D ou 25(OH)D
3.2. Dosage de la 1,25 dihydroxyvitamine D ou 1,25(OH)2D
3.3. Facteurs influençant le dosage
3.4. Indications du dosage de la vitamine D
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
1. LES OBJECTIFS DE L’ETUDE
2. CADRE – PERIODE DE L’ETUDE
2.1. Cadre de l’étude
2.2. Période de l’étude
2.3. Type de l’étude
3. Population de l’étude
4. MATERIEL – METHODES DE L’ETUDE
4.1. Matériel de l’étude
4.2. Dosage de la vitamine D
4.2.1. Appareillage
4.2.2. Etapes du dosage de la vitamine D au laboratoire
4.2.2.1. Principe
4.2.2.2.Mode opératoire
4.2.3. Valeurs de référence du fabricant
5. TRAITEMENT ET ANALYSE DES DONNEES
6. ASPECTS ETHIQUES
7. ASPECTS FINANCIERS
8. RESULTATS
8.1. Validité technique et biologiques des résultats
8.2. Caractéristiques de la population d’étude
8.2.1. Répartition de la population en fonction du sexe
8.2.2. Répartition de la population en fonction de l’âge
8.3. Valeurs usuelles de la vitamine D dans la population d’étude
8.4. Valeurs usuelles de la vitamine D en fonction du sexe
8.5. Valeurs usuelles de la vitamine D en fonction de l’âge
8.6. Valeurs usuelles de la vitamine D en fonction du sexe et de l’âge
9. DISCUSSION
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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