Etapes de développement d’un vaccin 

L’hématocrite

L’hématocrite représente le volume occupé par les globules rouges dans un volume donné de sang, prélevé sur anticoagulant.
L’hématocrite peut être déterminé soit par une méthode manuelle par centrifugation ou à l’aide des automates.
Il varie en fonction de l’age et du sexe.

Le taux d’hémoglobine

Diverses méthodes sont utilisées pour le dosage de l’hémoglobine dans un échantillon de sang, notamment celle utilisant l’acide cyanhydrique qui transforme l’hémoglobine et tous ses dérivés en cyanméthémoglobine qui est dosé sur un spectrophotomètre à 540 nm. Les résultats sont exprimés en gramme par 100 ml de sang (g/dl).

Volume et contenu des globules rouges

Le contenu des globules rouges dépend de la quantité d’hémoglobine synthétisée au cours de l’érythropoïèse et du volume de l’hématie. Leurs appréciations sont faites essentiellement par le calcul des constantes dites de Wintrobe : Volume Globulaire Moyen (VGM), Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (CCMH) et Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (TCMH).
-Calcul du Volume Globulaire Moyen (VGM): Il se fait en divisant le volume globulaire compris dans 1 mm3 de sang (fourni par l’hématocrite) par le nombre de globules rouges contenus dans le même volume (fourni par la numération).
La normale se situe entre 85 et 95 fl. En dessous de 85 fl, on parlera de microcytose, au-dessus de 95 fl de macrocytose, dans les limites normales de normocytose.
Il existe chez le petit enfant une microcytose (75-80 fl) qui semble physiologique.
-Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (CCMH) : Elle est le rapport entre le résultat du dosage d’hémoglobine sur celui de l’hématocrite.
On obtient ainsi la quantité d’hémoglobine par unité de volume de globules rouges :
Le résultat normal est compris entre 0,32 et 0,36 généralement exprimé en pourcentage (%). Lorsque le contenu en hémoglobine des globules rouges par unité de volume est insuffisant, cette valeur est < 32% : il y a hypochromie. Lorsque la CCMH est comprise entre 32% et 36%, il y a normochromie. En revanche, il n’existe pas d’hyperchromie.
-Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (TCMH) : La TCMH a moins d’intérêt physiologique que la CCMH ou le VGM. Elle s’obtient en divisant le résultat du dosage de l’hémoglobine par le nombre de globules rouges et indique le poids moyen d’hémoglobine par globule rouge.

La numération des réticulocytes

Les réticulocytes sont des jeunes globules rouges qui sont passés et qui ne durent pas plus de 48 heures dans le sang. La durée de vie des globules rouges est d’environ 120 jours. Ces réticulocytes représentent donc environ 1% des globules rouges. Le nombre normal des réticulocytes est entre 25000 et 100000/mm3 pour un taux d’hémoglobine normal.

Etude quantitative des globules blancs

Les globules blancs ou leucocytes sont des cellules mobiles possédant tous des organites fondamentaux des cellules animales et qui jouent le rôle de défense de l’organisme. Le comptage des globules blanc est fait sur le même prélèvement que les globules rouges et par le même appareil.

Etude quantitative des plaquettes

Ce sont des petites cellules de 2 à 4 μm de diamètre anucléées dans les quelles on distingue seulement quelques granulations colorées. Les plaquettes sont les principaux acteurs de l’hémostase primaire. Les compteurs électroniques les plus perfectionnés assurent simultanément sur le même prélèvement des comptes de globules rouges, des globules blancs et des plaquettes. L’intervalle de variation normale est très large de 150000 à 500000 par mm3.

Analyse qualitative

Elle est réalisée sur un frottis sanguin, qui consiste à étaler une fine goutte de sang sur une lame de verre et en l’examinant au microscope après coloration. Le colorant le plus utilisé est le May-Grunwald-Giemsa. Cet examen au microscope permet d’étudier la morphologie des hématies et de faire la « formule sanguine ». Elle permet en outre de différencier les lymphocytes, monocytes, les polynucléaires neutrophiles basophiles, éosinophiles et les cellules immatures éventuelles.

L’Alanine aminotransférase (ALAT)

Définition

L’ALAT encore appelée la transaminase glutamate pyruvate (TGP) est une enzyme intracellulaire qui intervient dans la synthèse et la dégradation des acides aminés. Cet enzyme est principalement trouvée dans le foie, elle est normalement présente dans le sérum à basse concentration, mais libérée dans le sang en plus grande quantité lorsque les lésions des membranes entraînent une augmentation de la perméabilité voire une nécrose des hépatocytes.
Elle est impliquée dans le métabolisme protéique, glucidique (la néoglucogenèse en particulier) et lipidique par le pyruvate formé.
L’ALAT catalyse le transfert du groupement NH2 d’une fonction amine sur un récepteur cétonique.
L’ALAT catalyse le transfert de la fonction amine de l’alanine vers l’ -cétoglutarate qu’elle transforme en glutamate.
Dans un premier temps, l’ALAT se lie à l’alanine puis transfère la fonction amine sur un coenzyme lié : le phosphate de pyridoxal (PPal) qui devient phosphate de pyridoxamine (PPine) sans cesser d’être lié à l’enzyme. L’enzyme se dissocie alors du pyruvate. Dans le second temps, l’enzyme liée au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe avec l’ -cétoglutarate, puis transfère la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate de pyridoxal, vers le second substrat qui est transformé en glutamate.
Enfin, le complexe ALAT-glutamate se dissocie, l’enzyme et son coenzyme retrouvent leurs structures initiales.

Les valeurs normales

Les valeurs normales de l’activité sérique des transaminases sont différentes d’un laboratoire à un autre ; une valeur élevée indique la présence d’une anomalie mais ne définit pas une maladie. La mesure de l’ALAT dans une population « normale » ne suit pas une distribution « gaussienne » mais plutôt une courbe logarithmique.

Les variations physiologiques

Les valeurs normales diffèrent d’un laboratoire à un autre du fait de la technique de dosage, mais aussi de la taille de population témoin considérée ou du fait de variations démographique ou géographique.
Dans la pratique quotidienne, au moment du prélèvement, certaines situations liées à l’échantillon peuvent influer, le plus souvent modérément, les résultats du dosage comme l’exercice physique, la position assise ou debout, la stase veineuse ou l’hémolyse. Une activité sérique augmentée de l’ALAT est plus souvent observée chez l’homme que chez la femme, chez les sujets d’origine hispanique ou indienne aux Etats-Unis, entre 25 et 35 ans et chez les mariés.
Enfin, l’ALAT est plus élevée lorsque la consommation de cigarettes est supérieure à 20 par jour[53]. L’activité sérique des transaminases diminue pendant la grossesse et lors du déficit en vitamines B6.
Les étiologies des transaminases élevées
Suivant le contexte et la clinique nous avons :
– les hépatites virales (A,B,C,D) ;
– les hépatites médicamenteuses et toxiques ;
– les hépatites auto-immunes ;
– la mononucléose, la tuberculose ;
– le cytomégalovirus, le Herpès ;
– la leptospirose et les rickettsioses ;
– les arboviroses (fièvre jaune, dengue) ;
– l’hémochromatose, la maladie de Wilson ;
– l’infarctus du myocarde, les myopathies, la cytolyse musculaire.

Mesure de l’activité de l’enzyme

En général, le dosage des enzymes se fait de manière indirecte, en évaluant une propriété proportionnelle à la concentration d’enzyme :
– Soit une propriété physique : C’est la méthode calorimétrique, qui consiste à mesurer la quantité de chaleur dégagée lorsque l’on ajoute du substrat en excès à un milieu adéquat contenant l’échantillon d’enzyme à doser.
– Soit une propriété cinétique : C’est la mesure de l’activité enzymatique, la mesure est faite dans les conditions particulières où cette dernière est proportionnelle à la concentration de l’enzyme. Ce procédé s’adapte parfaitement à l’analyse avec les automates et consiste à suivre l’évolution de la réaction en fonction du temps. La substance dont on mesure la vitesse de disparition ou d’apparition doit posséder une propriété spectrale spécifique dans l’UV ou le visible. L’enregistrement des variations d’absorbance en fonction du temps est la technique la plus simple, la plus rapide et la plus spécifique.

La créatinine

Définition

La créatinine est un constituant azoté non protéique, provenant de la déshydratation de la créatine, elle-même présente dans le muscle strié où elle permet le stockage de l’ATP (Adénosine Triphosphate) sous forme de créatine phosphate ou phosphagène par une réaction catalysée par la créatine kinase (CK). La créatinine plasmatique et urinaire est le reflet de la masse musculaire globale [55].
Au niveau du néphron, la créatinine subit la filtration glomérulaire ; elle n’est par la suite ni absorbée ni excrétée au niveau du tubule. Sa clairance mesure le volume du filtrat glomérulaire formé par seconde.
Clairance = 2 ml/seconde pour 1,73 m2 de surface corporelle.

Méthodes d’exploration

Détermination de la créatinine sanguine

Le sang total renferme de la créatinine et de la créatine. La créatine se trouve surtout dans les globules rouges à des taux faibles, alors que la créatinine est également repartie entre les globules et le plasma. La concentration en créatinine totale du sang est remarquablement constante. Elle ne dépend ni du régime, ni de l’exercice physique, ni même d’autres influences biologiques. C’est le constituant sanguin dont le taux est le plus fixe.
La créatinine sanguine ne varie pratiquement que dans les lésions rénales.
Son taux varie, chez l’adulte, de 50 à 105 μmol/l.

Notion de clairance

Elle établit le rapport entre la quantité d’une substance apportée par le plasma au niveau du rein et la quantité de cette substance éliminée par le rein. C’est le coefficient d’épuration plasmatique ou nombre de ml de plasma totalement épuré par le rein dans l’unité de temps. Ce volume théorique s’exprime en ml/s ou ml/minute.

Signification des variations pathologiques 

Valeur pronostique dans le cadre du syndrome biologique de rétention azotée
Un taux d’urée sanguine entre 8 et 12 mmol/l associé à une creatininémie à 88 μmol/l permet d’affirmer le caractère extra-rénal de cette azotémie. Par contre une urée à 17 mmol/l associée à une creatininémie à 220 μmol/l signifie une insuffisance rénale modérée.
Une azotémie à 33 mmol/l et une creatininémie à 600 μmol/l témoigne d’une insuffisance rénale avancée.

Valeur pronostique et surveillance de la thérapeutique

Tout au long de l’évolution d’une néphropathie, la valeur de la creatininémie et la clairance de la créatinine mesurent le degré d’insuffisance rénale et motivent de ce fait les attitudes thérapeutiques, alors que le taux d’urée sanguine et urinaire mesurent surtout le catabolisme azoté.

Méthodes enzymatiques

La spectroréflectométrie

C’est le cas de l’appareillage Boehringer “Reflotron Plus®”.
L’analyse est basée sur une hydrolyse enzymatique de la créatinine entraînant la production d’ammoniac et une migration sélective de l’ammoniac à travers une membrane semi perméable vers une couche contenant un indicateur (bleu de bromophénol). Le changement de couleur produit par l’ammoniac peut être mesuré à 600 nm par réflectométrie.

Méthode enzymatique lecture UV

Dans ce cas la créatinine est catalysée sous l’action de plusieurs enzymes pour générer le pyruvate et le NADH. Ce dernier sous l’action de la lactate déshydrogénase va entraîner la formation de la lactate et du NAD+.
La cinétique décroissante de disparition du NADH suivie à 340 ou 366 nm est proportionnelle à la quantité de créatinine initiale présente.

Réaction de Jaffé : coloration picrique

Après défécation à l’acide trichloracétique, on utilise la réaction de Jaffé.
La créatinine au contact d’un picrate alcalin donne une coloration orange. La créatine ne donnant pas cette réaction, la créatinine préformée est dosée seule. La lecture est effectuée à 510 nm.

Le candidat vaccin FMP1/AS02A

Le FMP1, une version recombinante de la portion C-terminale du fragment 42KDa de la MSP1, fabriqué et développé par le WRAIR, provient de la souche 3D7 de Plasmodium falciparum. Cet antigène est marqué par l’histidine et exprimé dans E.coli. Un processus efficace de fermentation et de purification compatible avec les normes de l’industrie pharmaceutique a été développé.
L’adjuvant AS02A a été fabriqué par le GSKBio. Jadis appelé SBAS2, il représente une émulsion huile dans eau à base de monophosphoryl lipide A (MPL) et de QS-21 (dérivé de l’écorce de Quillaja saponaria).
Les deux produits ont subi les tests de contrôle de qualité requis selon les procédures des Bonnes Pratiques de Manufacture ( Good manufactory Practices: GMP).
Le candidat vaccin FMP1 se présente sous forme de poudre lyophilisée à utiliser en association avec l’adjuvant AS02A.
Le flacon de FMP1 contient 62,5μg de protéine lyophilisée avec 31% de lactose.
Une quantité de 0,5ml de l’adjuvant AS02A contient 250μl de SB62 (une émulsion d’huile dans l’eau), 50μg de MPL et 50μg de QS-21, complétée par une solution tampon saline (PBS). L’adjuvant AS02A est livré sous forme de seringues pré remplies, chaque seringue contient 0,65 à 0,75ml de liquide et doit être impérativement conservée entre 2o C et 8o C.

Justification de l’étude au Mali

FMP1 a été bien toléré et a montré une bonne immunogénicité dans des essais de phase I sur des sujets neufs aux Etats-Unis. Un essai thérapeutique de phase I de FMP1 a été conduit au Kenya, une zone d’intense transmission du paludisme. La tolérance et l’immunogénicité d’un vaccin antipaludique peuvent varier selon l’intensité de la transmission du paludisme et l’état de semi-immunité des populations. Au Mali, la transmission du paludisme est de moindre intensité avec un rythme saisonnier. Il est nécessaire de procéder à des essais thérapeutiques de phase I/II en zone d’endémie. La présente étude vise, alors, à évaluer la tolérance et l’immunogénicité de FMP1 au Mali.

Le vaccin témoin antirabique IMOVAX

Le recours à un groupe témoin est utile en zone d’endémie dans une étude de Phase I, car l’immunité acquise et l’exposition naturelle à la transmission du paludisme peuvent compliquer l’interprétation des données de l’immunogénicité. L’effet du candidat vaccin n’étant pas connu, une augmentation du titre des anticorps peut être attribuée à tort à ce produit. Le placebo serait un bon témoin, mais des problèmes éthiques. Un vaccin qui apporterait une protection contre une maladie existante dans la zone serait un témoin éthique. Car ce vaccin permettra de maximiser le rapport risques/bénéfices pour les participants, quand on sait que ce rapport est toujours défavorable dans un essai de phase I. Plusieurs vaccins peuvent répondre aux critères de choix d’un témoin pour notre étude, mais la plus part de ces vaccins sont disponibles dans le Programme Elargi de Vaccination au Mali.
Nous avons choisi le vaccin antirabique Imovax®.
Imovax® est fabriqué par Aventis Pasteur SA. Il s’agit d’une suspension du virus de la rage, asséchée par congélation, stérile et stable, préparée à partir de la souche PM- 1503-3M et obtenue auprès de l’institut Wistar à Philadelphie, US. Chaque dose reconstituée de vaccin de 1ml contient 100mg d’albumine humaine, moins de 150μg de néomycine et 2,5UI d’antigène antirabique. Le vaccin Imovax® est livré sous forme de flacon contenant une dose unique d’antigène lyophilisé avec une seringue pré-remplie contenant 1ml d’eau pour injection comme diluant.
Son schéma de vaccination recommandé est 0, 7 et 21 jours. Mais des études hors label réalisées en Angleterre, en Allemagne, en France et en Belgique ont montré que 100% des sujets vaccinés avec deux doses à 1 mois d’intervalle présentaient des titres d’anticorps protecteurs, avec une moyenne géométrique de 10UI[50, 56].
Le vaccin Imovax® présente un profil de tolérance acceptable. Des réactions locales ou systémiques d’intensité modérée peuvent survenir suite à l’injection d’Imovax®.
Ces réactions sont passagères et ne contre-indiquent pas l’utilisation du vaccin: elles consistent en une douleur locale, un érythème, un oedème ou un prurit au site d’injection [57]. Des maux de tête, une nausée, des douleurs abdominales, des douleurs musculaires et des vertiges, ont été rapportés chez 20% des personnes ayant reçu le vaccin [57]. Dans une étude[58, 59], deux sujets ont présenté des symptômes qui ressemblaient au syndrome de Guillain-Barré. Des réactions allergiques généralisées ont également été rapportées, sous forme d’urticaire généralisée, d’oedème de Quincke, de douleurs articulaires, de fièvre, de nausée et des vomissements. Ces réactions étaient rares après une dose de vaccin antirabique.
Toutefois, elles ont été rapportées chez environ 7% des sujets ayant reçu une dose de rappel.

METHODOLOGIE

Lieu d’étude

Notre étude s’est déroulée dans la ville de Bandiagara (figure 6), chef lieu de cercle située au coeur de la région de Mopti sur le plateau Dogon. Elle s’étend de l’isohyète 200mm à l’isohyète 700mm.
La ville est irriguée par un affluent du fleuve Niger: le ‘‘Yamé’’ qui constitue un gîte pour le développement des anophèles pendant une bonne partie de l’année.
La végétation est de type sahélien sur un plateau rocailleux. Elle est dominée par des essences épineuses (dattiers sauvages, taniers, gommiers) et d’autres tels que les balanzans, les tamariniers et les raisins sauvages.
Le climat est caractérisé par une courte saison de pluie allant de juin -juillet à aoûtseptembre avec une pluviométrie de 400 à 700 mm d’eau par an (673.2 mm pour l’année 2003), et une saison sèche plus longue. Le relief est dominé par une grande table de grès.
L’activité économique est essentiellement agropastorale, le tourisme est également assez développé.
La ville de Bandiagara comptait 12500 habitants au recensement du MRTC en 2002 : la tranche d’âge de 0 à 20 ans représente 57% de la population générale. Cette population est composée majoritairement de Dogons (environ 65%), suivis des Peuhls, Mossis, Bozos, Bamanans, Sonrhaïs, Sénoufos.
La transmission du paludisme est saisonnière et couvre toute la saison des pluies.
L’incidence du paludisme simple non compliqué était de 17,13% en 2002 et le taux de prévalence de l’infection de 75,6%.
La ville de Bandiagara a été depuis 1993, le site d’études épidémiologiques et entomologiques du  l’université de Bamako. Depuis 1999 Bandiagara abrite un projet de préparation du site pour la conduite d’essais cliniques de vaccins antipaludiques du DEAP avec le support financier et technique du NIH, et en partenariat avec l’université de Maryland, connu sous le nom de BMP (Bandiagara Malaria Project). Ce projet a conduit plusieurs études notamment : des études d’incidence du paludisme, une étude cas de paludisme sévère comparé au témoin paludisme simple et aux sujets bonne santé pour évaluer la susceptibilité immunogénétique au paludisme, une étude d’interaction immunologique entre l’infection palustre et la schistosomiase, une étude de clairance parasitaire par la chloroquine. En Avril 2003 une étude des normes a été menée pour établir la distribution normale dans la population locale des paramètres hématologiques et biochimiques pour avoir les intervalles de référence. L’activité économique est essentiellement agropastorale, le tourisme est également assez développé.
La ville dispose de trois groupes scolaires et un lycée. Elle est le siège de plusieurs projets de développement.

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Table des matières

CHAPITRE I: INTRODUCTION 
CHAPITRE II: OBJECTIFS
1- Objectif général
2- Objectifs spécifiques
CHAPITRE III: GENERALITES
1- Cycle biologique du Plasmodium falciparum
2- Vaccination et candidats vaccins antipaludiques
3- Les antigènes
3.1- Les vaccins pré-érythrocytaires
3.2- Les vaccins érythrocytaires
3.3- Les vaccins bloquant la transmission
3.4- Les nouvelles approches de formulation de vaccin
3.5- Les adjuvants vaccinaux
3.5.1- Le QS-21
3.5.2- Le MPL
4- Etapes de développement d’un vaccin
5- Les éléments de la tolérance
5.1- L’hémogramme
5.1.1- Définition
5.1.2- Les paramètres de l’hémogramme
5.2- L’Alanine aminotransférase
5.2.1- Définition
5.3- La créatinine
5.3.1- Définition
5.3.2- Méthodes d’exploration
5.3.3- Signification des variations pathologiques
5.3.4- Méthodes de dosage
CHAPITRE IV : NOTRE TRAVAIL
1- Le candidat vaccin FMP1/AS02A
2- Justification de l’étude au Mali
3- Le vaccin témoin antirabique IMOVAX
4- METHODOLOGIE
4.1-Lieu d’étude
4.2-Période d’étude
4.3-Type d’étude
4.4-Population d’étude
4.5-Technique d’échantillonnage
4.6-Critères d’inclusion et de non-inclusion
4.6.1- Critères d’inclusion
4.6.2- Critères de non-inclusion
4.7-Organisation pratique du travail
4.8-Technique d’étude et variables mesurées
4.8.1- Evaluation clinique
8.1.1- Matériels
– Techniques de laboratoire
– Prélèvement du sang
– La réception
– L’hémogramme
– Les tests biochimiques
– Test de grossesse
– Les tests immunologiques
4.9-Considérations éthiques
4.10-Collecte saisie, analyse des données
CHAPITRE V: RESULTATS
1-Résultats du screening
2-Caractéristiques de base de la population d’étude
3-Résultats cliniques
4-Etude des paramètres de l’hémogramme
5-Résultats biochimiques
6-Résultats immunologiques
CHAPITRE VI: COMMENTAIRES ET DISCUSSION 
CHAPITRE VII: CONCLUSION 
CHAPITRE VIII: RECOMMANDATIONS 
CHAPITRE IX: REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
RESUME 
LES ANNEXES

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