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Mesure par médiateur rédox de la matière organique biodégradable
Plusieurs capteurs ont été développés dans la littérature se basant sur des médiateurs rédox. Habituellement, les micro-organismes oxydent la matière organique en condition aérobique. Ce-pendant, en présence d’un médiateur rédox, ce dernier agit comme un accepteur d’électrons à la place de l’oxygène [42, 43, 44, 45, 46].
La quantité du médiateur rédox réduit par la réaction de biodégradation est directement propor-tionnelle à l’activité métabolique des microorganismes et donc à la quantité de matière organique biodégradable.
L’ajout d’un substrat à un milieu contenant un excès d’un médiateur rédox entraîne une aug-mentation de l’activité métabolique des bactéries et de la quantité de médiateur réduit. La réoxidation de ce dernier génère un courant quantifiable par une méthode coulométrique [47] ou ampérométrique [42].
Les travaux de Pasco [47] et de Yoshida [42] dans les années 2000 ont permis le développement de capteurs basés sur ce principe.
L’équipe de Learoyd [44] a étudié le taux de réduction de sept colorants rédox par treize souches bactériennes. Différentes combinaisons de bactéries et colorant rédox ont été faites. Le bleu de toluidine et l’éthosulfate de phénazine ont été les plus rapidement réduits par la majorité des bactéries.
Le principal avantage est qu’avec ces médiateurs rédox, la réaction de biodégradation ne dé-pend pas de l’oxygène dans le milieu réactionnel [47]. De plus, avec un médiateur rédox, il n’est pas nécessaire de diluer les échantillons. Enfin, la durée d’analyse est plus courte que pour les méthodes standards étant donné que le médiateur rédox accélère la biodégradation.
Mesure du potentiel électrique
Des équipes de recherche ont travaillé sur le développement de capteurs basés sur le principe des piles à combustible microbiennes. Comme indiqué dans la figure 1.7, celles-ci sont composées d’un compartiment anaérobie avec une anode (électrode négative) et un compartiment aéro-bie avec une cathode (électrode positive) ; les deux étant séparés par une membrane. Dans le compartiment anaérobie, les microorganismes dégradent la matière organique et générent des électrons et des protons [7, 48]. Les protons migrent à travers la membrane vers la cathode, où l’oxygène est réduit pour former de l’eau (H2O) et les électrons passent de l’anode à la cathode par un circuit électrique externe.
La circulation des électrons dans le circuit électrique génère un courant mesurable propor-tionnel à l’activité de biodégradation microbienne, permettant ainsi l’estimation de la DBO d’un échantillon. Les piles à combustible microbiennes développées par [49] montrent une bonne cor-rélation avec la DBO5 obtenue avec la méthode standardisée (r2 = 0, 999).
Plusieurs travaux ont été centrés sur cette technique [49, 50, 51, 52, 53] mais peu ont été évalués avec des échantillons environnementaux réels. Ces méthodes ont permis d’élargir la gamme de détection jusqu’à 0-200 mg/L [7].
Dispositifs miniaturisés de mesure de polluants organiques (biodégra-dables)
Malgré leur forte robustesse et leurs bonnes performances, les méthodes conventionnelles présentent des limites conséquentes pour des mesures fréquentes. Les méthodes alternatives dé-veloppées afin d’améliorer les caractéristiques de ces dernières présentent des limites similaires liées principalement au fait que les mesures sont différées, ne sont pas réalisées sur site et né-cessitent également une durée de mesure importante [54]. L’intégration et la miniaturisation des capteurs offrent des perspectives intéressantes pour améliorer les performances des mesures en milieux biologiques.
Des recherches de plus en plus nombreuses essayent de répondre à ce besoin en développant une grande variété de biocapteurs millimétriques et micrométriques.
Les biocapteurs sont des dispositifs de détection analytiques qui traduisent un phénomène bio-logique par un signal détectable et mesurable. Ils se composent de deux parties principales : le biorécepteur et le système de transduction dédié au biorécepteur.
Les éléments de détection biologiques représentent la partie du biocapteur qui intéragit avec l’analyte d’intérêt. Par analogie avec les méthodes conventionnelles, nous limiterons notre étude aux capteurs bactériens. Les biocapteurs bactériens sont couramment utilisés pour la surveillance de l’environnement [55, 56, 57, 58]. Ils sont capables de fournir des informations sur les niveaux de pollution [59]. Le transducteur physique convertit l’activité biologique en un signal lié à la concentration de l’analyte d’intérêt [59]. Plusieurs types de transducteurs physiques peuvent être intégrés sur un biocapteur.
Dans cette partie, nous présenterons les différents biocapteurs développés en fonction de la mé-thode de transduction choisie [60, 61] en nous focalisant sur les transductions électrochimique et optique qui sont les plus couramment utilisées.
Biocapteurs électrochimiques à bactéries
Les méthodes électroanalytiques offrent un grand potentiel de surveillance des échantillons d’eau car elles sont simples à utiliser et suffisamment sensibles. De plus, elles sont très facilement miniaturisables.
De nombreux biocapteurs électrochimiques ont été développés pour détecter la biodégradation dans les eaux [50, 55, 62, 63].
Les bactéries sont immobilisées sur les surfaces des électrodes ou confinées dans un puits, avec ou sans étape de prétraitement. Cette dernière permet d’optimiser le procédé et donc d’avoir une mesure plus rapide.
Les techniques d’immobilisation peuvent être classées en trois groupes. Dans le premier cas, les bactéries sont piégées à l’intérieur d’un réseau polymère qui limite leur mouvement. Plusieurs matrices ont été évaluées, dont l’alginate [64], l’agarose [65, 66], le polycarbamoxyl sulfonate (PCS) [67, 8, 68], un gel de silice [69], un matériau composite de type sol-gel (silice et poly (alcool vinylique) -polymère greffé (vinylpyridine)) [70, 71, 72, 73], un sol-gel d’Al2O3 [74], la résine ENT-3400 (une résine de réticulation activée par ultraviolet) [75], l’alcool polyvinylique (PVA) [76] et l’ormosil (silicate organiquement modifié) [77].
Tous ces polymères sont biocompatibles et ont une faible toxicité pour les micro-organismes. Néanmoins, le choix du polymère dépend de l’application. L’alginate et l’agarose sont particuliè-rement faciles à utiliser mais peuvent manquer de stabilité mécanique adéquate dans certaines conditions [67]. Les polymères PCS et le sol-gel sont plus complexes à utiliser mais plus résistants mécaniquement. De plus, les sol-gel de polymères sont décrits comme chimiquement inertes et photochimiquement et thermiquement stables.
La deuxième méthode d’immobilisation consiste à intercaler des cellules entre deux couches de polymères. Plusieurs combinaisons de polymères : membranes de teflon / dialyse [78], acétate de cellulose / éthylène-propylène fluorée (EPF) [79], teflon / teflon [80], polycarbonate / teflon [81] ont été utilisées dans les études citées.
La dernière méthode d’immobilisation microbienne consiste à adsorber les cellules sur des sup-ports solides, par exemple, des membranes poreuses (cellulose [82], fibre de verre [83] ou nylon [84]).
Certains polluants peuvent exiger une phase de latence longue avant de devenir biodégradables par des micro-organismes. Une étape complémentaire de prétraitement consiste alors à hydro-lyser, physiquement ou biochimiquement, les macromolécules qui sont plus difficiles à dégrader dans les échantillons [82, 85, 86].
Karube [55] a développé en 1977 deux types différents de capteurs à base d’électrodes mi-crobiennes. Le premier comprend une électrode d’oxygène et utilise une membrane de bacté-ries/collagène. Le courant de l’électrode diminue de façon marquée avec le temps lorsque cette dernière est placée dans une solution de glucose ou d’acide glutamique (modèle d’eau usée). Le deuxième est une cellule de biocarburant utilisant une électrode de Clostridium Butyri-cum/Platine. Une relation linéaire a été obtenue entre le courant de l’électrode et la DBO avec une erreur de +/-10%. Une plateforme complète de mesure, développée par Ben-Yoav [9], permet l’analyse de la toxicité de l’eau (Figure 1.9). Le système électrochimique est composé de deux micro puces : une puce microfluidique en PDMS et une micro chambre à trois électrodes.
Bilan partiel sur les systèmes miniaturisés
Les systèmes de détection électrochimiques sont facilement miniaturisés et portables permet-tant une analyse sur site et un résultat rapide, en temps réel sur la qualité des eaux [59, 108]. Ils permettent l’analyse à une fréquence élevée car la période de stabilisation de la mesure est généralement courte. De plus, le bruit est proportionnel à la taille de l’électrode, donc bas. Ces systèmes sont précis et sensibles.
Cependant, l’utilisation de biocapteurs électrochimiques est limitée aux espèces électro-actives [9]. En outre, le contact direct du capteur avec la solution examinée peut entraîner une détério-ration de la surface des électrodes entraînant une modification des propriétés de détection.
La transduction optique présente plusieurs avantages par rapport à d’autres techniques telles que la possibilité d’effectuer une analyse multiple simultanément [109]. De plus, les systèmes optiques peuvent être facilement fabriqués en masse et miniaturisés et sont sans interférences électriques et magnétiques [110, 111]. Le système de transduction n’est pas en contact avec la solution examinée, ce qui élimine les problèmes d’encrassement biologique [106, 112, 113].
La majorité des biocapteurs utilisant la transduction optique sont faits sur microplaque avec des systèmes de lecture commerciaux type spectrofluoromètre ou spectrophotomètre ce qui li-mite l’utilisation sur site. Ceci explique la faible production bibliographique sur des biocapteurs optiques miniaturisés par rapport aux biocapteurs électrochimiques. Les biocapteurs optiques présentent toutefois à leur tour des limites telles que l’interférence lumineuse ce qui signifie que les mesures doivent être effectuées dans des chambres noires ainsi que leur incapacité à four-nir des résultats précis lors de l’examen d’échantillons troubles [59]. Ces limites restent peu contraignantes comparativement aux systèmes électrochimiques.
Conclusions sur l’état de l’art
Un des enjeux scientifiques et technologiques dans le domaine du traitement et de l’analyse des eaux est de disposer de systèmes de mesure performants et fiables, permettant de faire des mesures de polluants organiques en temps réel et sur site.
Les méthodes de mesure des polluants organiques peuvent être classées en deux grandes catégo-ries : les méthodes conventionnelles et les biocapteurs (méthodes alternatives et miniaturisées). Les méthodes conventionnelles nécessitent des mesures longues (5 jours au minimum). Elles permettent d’obtenir les résultats les plus précis car elles utilisent en général plusieurs souches bactériennes issues de boues actives. Ces méthodes fournissent une valeur exacte et de manière directe de la teneur en matière organique dans les eaux (la DBO).
Les biocapteurs permettent des temps d’analyse réduits avec de larges plages de mesure. Quant à eux, ils n’utilisent qu’une seule souche bactérienne et font appel souvent à des algorithmes complexes permettant l’estimation de la valeur réelle de la DBO. Ainsi, les mesures effectuées sont indirectes et peu de données sur des applications de terrain sont disponibles.
D’un point de vue biologique, une différence se manifeste entre les deux catégories de systèmes (direct et indirect) car généralement deux types d’inoculums microbiens sont utilisés : boues activées [78] ou souches pures.
Les méthodes de mesure conventionnelles sont technologiquement fiables (sonde d’oxygène ou de pression) et leurs protocoles d’utilisation sont disponibles dans la littérature. Néanmoins, elles nécessitent de longues périodes d’analyse et, en général, un espace de travail important. Inversement, les méthodes alternatives nécessitent un temps réduit pour effectuer des analyses.
Ecart de mesure entre les différentes chaînes de mesure
Un autre paramètre à prendre en compte est l’erreur d’une chaîne de mesure à une autre et d’un puits à un autre. Une même mesure est faite plusieurs fois dans tous les puits et aussi avec les quatre chaînes du système de mesure. Le but est de voir l’écart pour une même concentration bactérienne et concentration en matière organique entre les quatre fibres optiques du système de mesure. La figure 2.5 présente l’écart de mesure entre les différentes lignes optiques du système pour une concentration bactérienne de 2.108 cell/mL et une concentration en glucose de 80mg/L. Un léger écart est observable de l’ordre de 0,26 mg/L. On voit que cet écart est du même ordre de grandeur que l’écart type entre 2 expériences consécutives. On peut considérer que ce n’est donc pas pénalisant pour la mesure. Toutefois afin de minimiser cette erreur, la même expérience sera faite sur la même chaîne à chaque fois.
Effet de la concentration bactérienne
Afin de voir l’effet de la concentration bactérienne sur la consommation en oxygène, nous avons fait plusieurs expériences avec plusieurs dilutions du milieu LB (dilué 100 fois : 1/100 et dilué 300 fois : 1/300) et avec différentes concentrations bactériennes de 0,16.108 cell/mL qui correspond à une Absorbance590nm = 0, 02 jusqu’à une concentration de 2.108 cell/mL qui correspond à une Absorbance590nm = 0, 25.
La figure 2.6 illustre l’influence de la concentration bactérienne sur l’accélération de la consom-mation de l’oxygène dissous. Les résultats corroborent les observations effectuées par L. Recoules.
La première constatation attendue est que la cinétique de consommation de l’oxygène est trés sensible à la population bactérienne. Pour la concentration de 2.108 cell/mL, la consommation en O2 est très rapide, inférieure à 30 minutes et la cinétique de consommation est peu visible.
On observe également un fort décalage du signal à t=0. La consommation rapide de l’oxygène avant t=0, peut expliquer ce décalage. En effet, les bactéries, nombreuses et ayant beaucoup de nutriments, réagissent très rapidement avant le remplissage des puits et le lancement de la mesure, ce temps pouvant prendre entre 10 et 15 minutes. Ainsi, afin de voir la cinétique de consommation des bactéries il vaut mieux éviter des populations trop importantes surtout que cela peut entraîner également la mort de bactéries qui constitueront à leur tour une source de matière organique pour les vivantes.
On constate également que l’oxygène contenu en solution est totalement consommé ce qui montre la bonne étanchéité du système.
En calculant la pente à l’origine pour les différentes courbes (entre une heure et deux haures de mesure), on peut déduire la vitesse de consommation de l’oxygène dissous dans la solution. Ces valeurs sont rassemblées dans le tableau 2.1 qui donne également le temps de mesure nécessaire à l’analyse.
La concentration bactérienne joue un rôle important sur la vitesse de consommation de l’oxygène et donc la durée de mesure.
Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur à optode
L’objectif de ce travail est de déterminer d’une part quelles sont les conditions opératoires optimales et d’autre part d’évaluer les performances du capteur.
Afin d’étudier la réponse du capteur en fonction de la teneur du milieu en matière organique, nous reconstituons un échantillon organique à l’aide d’une solution M9 (voir annexe) contenant les bactéries (en concentration variable) et une solution de glucose (en concentration variable également).
L’échantillon à analyser est constitué de 90% de solution de bactéries dans du milieu M9 et 10% de solution de glucose. Nous avons choisi une gamme de mesure de glucose de 0 à 300 mg/L. La concentration en glucose correspondant à 40% de concentration en carbone organique, ce qui nous permet de déduire que pour la gamme de [0-300]mgGluc/L en glucose correspond à une gamme de mesure de [0-120]mgC/L en carbone. En première intention, nous avons regardé la variation de la concentration en oxygène sur une très large gamme de concentrations en glucose.
Réalisation du système microfluidique
Procédé de fabrication de la biopuce
Le choix s’est porté sur des biopuces mono-puits de contenance 20µL. Les dimensions du réservoir ont été définies en fonction des dimensions de l’optode. Cette dernière est de forme cylindrique de rayon 2,5mm et d’épaisseur 125µm. L’optode est collée à l’intérieur du puits. Celui-ci a une forme circulaire de hauteur 500µm et de rayon 4mm. Les canalisations microfluidiques d’entrée/sortie font 6mm de longueur et 0,6mm de largeur.
Le procédé de fabrication utilisé comprend trois étapes : la réalisation du moule des puces (un moule en Silicium/SU8), la fabrication des puces par moulage de PDMS et finalement l’étape de capotage. Les différentes étapes de réalisation des biopuces sont schématisées sur la figure 2.11 et les détails du procédé dans le tableau 2.4.
Procédé de fabrication du moule des biopuces Les masques sont dessinés à l’aide du logiciel Clewin. La configuration des puces est simple avec une canalisation d’entrée et de sortie reliées au puits. Sur un wafer 4 pouces, nous avons pu placer une dizaine de biopuces comme illustré dans la figure 2.10.
Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur miniaturisé à optode
Afin de tester le microsystème, nous avons reproduit les expériences faites avec le macrosys-tème et avons comparé les deux systèmes pour les mêmes conditions expérimentales. Le protocole expérimental utilisé pour cette section est le même que celui utilisé pour le macrosystème.
Glucose mimant la matière organique
Comme dans le cas du capteur millifluidique, la biopuce est testée avec une solution contenant du glucose. Le protocole bactérien est exactement le même que précédemment. Nous reprenons le culot bactérien après lavage et ajustons la concentration bactérienne avec du milieu M9 jusqu’à obtenir de la densité souhaitée. L’échantillon final est préparé en diluant le milieu bactérien dans le milieu M9 enrichi en glucose.
Influence de la concentration bactérienne La figure 2.15 montre la consommation de l’oxygène dissous pour une concentration en glucose de 80mg/L pour quatre concentrations bactériennes différentes allant de 0,8.108 cell/mL à 4,8.108 cell/mL.
On note une absence complète de dynamique respiratoire en fonction des concentrations bactériennes, ce qui n’était pas le cas pour le macrosystème.
Mesure de la concentration en glucose L’absence de l’effet de la concentration bactérienne pour la concentration en glucose de 80 mg/L, nous a poussé à regarder l’impact de la concentration de ce dernier pour une densité bactérienne donnée.
La figure 2.16 présente les résultats pour 2.108 cell/mL pour trois concentrations en matière organique. Le résultat est identique.
Milieu LB mimant la matière organique
Afin de comprendre l’absence de la respiration bactérienne (signal constant) , nous avons décidé de reproduire les expériences avec le milieu LB qui est très riche en nutriments. L’expérience a été faite pour deux concentrations en bactéries à savoir 2.108 cell/mL et 4,8.108 cell/mL. Les résultats sont présentés sur la figure 2.17.
Comme pour le macrosystème, l’augmentation du taux en bactéries joue sur le temps de mesure et aussi sur la vitesse de consommation. En effet, pour la concentration la plus importante, la mesure est faite en moins de 4 heures tandis que pour la concentration de 2.108 cell/mL, la mesure prend plus de 9 heures. Pour cette dernière concentration bactérienne, un temps de latence assez important, de l’ordre de 5 heures, est également noté. A partir de ce moment là, la cinétique de la consommation de l’oxygène reprend à une vitesse de 1,4 mgO2/L/h. Pour la concentration élevée, il n’y a pas de temps de latence. La vitesse de consommation de cette dernière est de 1,44 mgO2/L/h, soit similaire à celle observée avec la population bactérienne plus élevée.
Mesure de la concentration en matière organique La détermination du taux d’oxygène dis-sous consommé en fonction de la matière organique présente est un paramètre important pour valider notre système et aussi définir sa gamme de détection. Les échantillons sont préparés avec plusieurs dilutions du milieu LB et les résultats sont comparés à ceux obtenus de façon analogue avec le macrosystème. Les cinétiques de ces dernières sont illustrées dans la figure 2.18.
L’échantillon préparé est composé de bactéries avec différentes concentrations et du milieu LB avec quatre concentrations différentes (dilution 10, 100 et 300 fois).
Pour une même concentration bactérienne, nous avons voulu voir l’effet de la concentration en nutriments sur la consommation en oxygène. La figure 2.18 illustre les résultats de la consomma-tion en oxygène en fonction de la dilution du milieu de culture pour une concentration bactérienne correspondant à une Absorbance590nm = 0, 25 (2.108 cell/mL).
Pour le macrosystème, l’influence de la concentration en nutriments est nettement visible sur la vitesse de consommation et aussi sur la durée de mesure. Pour le milieu non dilué, la réponse est très rapide et la vitesse de consommation est de 18,07mg/L/h. Pour les milieux LB 100 et 300 fois dilués, la durée de mesure et la vitesse de consommation de l’oxygène sont respectivement deux heures, quatre heures et 3,11 mg/L/h, 2,14 mg/L/h.
Les comportements sont radicalement différents dans le cas du microsystème. En effet, cette absence de consommation bactérienne dans le cas des milieux LB dilués 100 et 300 fois avec le microsystème ne peut pas être expliquée par le manque en matière organique car les mêmes dilutions montrent une dynamique de consommation avec le macrosystème.
L’explication la plus probable est que la porosité du PDMS permet un renouvellement rapide de l’oxygène dans l’échantillon ce qui masque la consommation bactérienne. Cet effet est d’autant plus visible que le rapport surface exposée/volume du réservoir est grand, ce qui est clairement en défaveur du système miniaturisé.
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Table des matières
1 Mesure de la concentration en polluants organiques dans l’eau : Etat de l’art et problématique
1.1 Problématique générale
1.2 Etat de l’art
1.2.1 Méthodes conventionnelles de mesure de l’oxygène dissous
1.2.2 Méthodes alternatives
1.2.3 Dispositifs miniaturisés de mesure de polluants organiques (biodégradables)
1.2.4 Conclusions sur l’état de l’art
1.3 Objectifs de la thèse
2 Développement du capteur à Optode
2.1 Macrosystème à optode
2.1.1 Optimisation du système de mesure avec du milieu LB et du glucose
2.1.2 Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur à optode
2.2 Microsystème à optode
2.2.1 Réalisation du système microfluidique
2.2.2 Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur miniaturisé à optode
2.3 Conclusion
3 Développement du capteur à résazurine
3.1 Introduction
3.2 Qu’est ce que la résazurine?
3.3 Préparation de l’échantillon
3.4 Mise en place d’une expérience de référence
3.4.1 Optimisation du protocole expérimental
3.4.2 Etalonnage de la mesure de la concentration en matière organique
3.4.3 Conclusion
3.5 Ingénierie du microsystème à résazurine
3.5.1 Amélioration de la chaîne instrumentale
3.6 Conception et réalisation des biopuces
3.6.1 Design des biopuces
3.6.2 Première génération de biopuce : Biopuces PDMS
3.6.3 Deuxième génération de biopuces : Biopuces SU8
3.6.4 Troisième génération de biopuces : Biopuces en film DF
3.7 Conclusion
4 Cas d’étude d’une application toxicologique
4.1 Introduction
4.2 Application toxicologique
4.2.1 Protocole expérimental
4.2.2 Souche E.coli
4.2.3 Souche Pseudomonas aeroginosa
4.2.4 Souche Rhizobium radiobacter
4.2.5 Conclusion
4.3 Vers une application sur le terrain
4.3.1 Protocole expérimental
4.3.2 Mélangeur fluidique
4.4 Conclusion
Conclusion
Glossaire
A Milieux de culture et produits chimiques
A.1 Stérilisation du matériel
A.2 Milieux de culture
B Préparation de la souche bactérienne
B.1 Conservation des souches bactériennes
B.2 Cinétique et suivi de la croissance bactérienne
C Protocole bactérien de préparation de l’échantillon
C.1 Etape de pré-culture
C.2 Etape de culture
C.3 Etape de lavage des bactéries
C.4 Préparation de l’échantillon
D Chaîne instrumentale du capteur à Résazurine
D.1 Etage d’excitation
D.2 Etage de détection
E Procédé de fabrication des biopuces Verre/PDMS
Annexes
Bibliographie
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