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La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) : un rôle clé dans le processus métastatique
Mécanismes de l’EMT
L’expression du programme de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) conduit à l’acquisition d’un phénotype mésenchymateux par les cellules épithéliales qui deviennent alors mobiles. A la suite de cette transition les cellules vont aussi acquérir des capacités de résistance à l’apoptose et à la dissémination (Barrallo-Gimeno et Nieto, 2005; Klymkowsky et Savagner, 2009; Polyak et Weinberg, 2009; Thiery et al., 2009; Yilmaz et Christofori, 2009)
(Figure 8).
Un très grand nombre de facteurs de transcription incluant Snail, Slug, Twist, Zeb1/2, orchestrent l’EMT (Heerboth et al., 2015; Kalluri et Weinberg, 2009), et sont responsables de l’expression de marqueurs spécifiques des cellules mésenchymateuses et de la répression des marqueurs épithéliaux (Figure 8). Ces facteurs de transcription peuvent notamment être stimulés par des facteurs de croissance (tel que TGF beta, Transforming Growth Factor beta, Thiery et al., 2009), l’interaction avec le stroma (lui-même modifié par les cellules tumorales) et l’hypoxie.
L’EMT : un processus plastique, transitoire, réversible et partiel
La description des différentes étapes du processus métastatique que nous venons de faire n’est qu’un aperçu de la complexité et la diversité des mécanismes impliqués à chaque étape. Le programme de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) semble critique pour l’invasion et la dissémination de cellules tumorales individuelles issues de carcinomes. Selon certains modèles, chaque cellule doit acquérir des propriétés mésenchymateuses, et un état de cellule souche, afin de passer les différentes phases du processus métastatique pour atteindre un tissu à distance. L’EMT peut sembler être décrit comme un programme binaire où les cellules sont soit dans un état mésenchymateux soit dans un état épithélial. Il semblerait cependant que différents états intermédiaires existent. L’activation de l’EMT dans les cellules de carcinome permettrait l’acquisition de certains traits mésenchymateux nécessaires, des caractéristiques épithéliales étant également conservées. Ces équilibres conduisent à des cellules au phénotype mixte épithélial/mésenchymateux. Cette plasticité vient s’ajouter à la réversibilité du programme de l’EMT via une transition mésenchymato-épithéliale (MET) que nous avons évoquée dans la section précédente. De plus, il semblerait que cet état d’ « EMT partiel » (Savagner, 2015) favorise la progression tumorale et l’apparition de métastases (Bednarz-Knoll et al., 2012; Sampson et al., 2014; Schliekelman et al., 2015) (Figure 10). Selon les modèles tumoraux les cellules métastatiques ne vont pas exprimer les mêmes traits d’EMT lors du processus métastatique (Bonnomet et al., 2012; Celià-Terrassa et al., 2012; Trimboli et al., 2008).
Comportements collectifs cellulaires lors de la cascade métastatique
Cette partie est consacrée à la présentation de deux comportements collectifs décrits lors du processus métastatique :
– la migration cellulaire collective (CCM) qui intervient lorsque les cellules de la tumeur primaire envahissent le tissu environnant pour migrer vers des tissus voisins ou vers la circulation sanguine (et lymphatique)
– les clusters (agrégats) de cellules tumorales circulantes (CTC) qui ont été identifiés dans la circulation sanguine et qui évoluent en conditions ancrage-indépendantes.
Dans un premier temps nous présenterons de manière assez globale la migration cellulaire collective puis nous décrirons de façon plus précise les clusters de cellules tumorales circulantes (CTC) qui ont principalement motivé ce travail de thèse. Dans l’exposé des deux comportements collectifs le rôle des jonctions intercellulaires sera mis en avant.
Migration cellulaire collective (CCM) tumorale
Définition et mécanismes
La migration cellulaire collective (CCM) se produit lorsqu’un groupe de cellules se déplace dans un tissu en conservant des jonctions intercellulaires, coordonnant leur dynamique d’actine et leur signalisation cellulaire pour former une unité fonctionnelle et structurale (Ilina et Friedl, 2009).
Ce phénomène de CCM est impliqué dans plusieurs évènements physiologiques tels que la réparation tissulaire (régénération d’épithélium) ou la morphogenèse (Lecaudey et Gilmour, 2006; Weijer, 2009). Par ailleurs, la CCM pourrait favoriser le potentiel métastatique en permettant l’invasion de groupe de cellules nombreuses (Friedl et Gilmour, 2009). Comme pour l’EMT, les cellules cancéreuses vont détourner ce mécanisme pour l’invasion du tissu environnant la tumeur primaire. La CCM est observée pour la plupart des cancers solides (Figure 13) comme les carcinomes mammaires, à cellules squameuses, le rhabdomyosarcome (Friedl et al., 1995), les carcinomes colorectaux (Chung et al., 2016), et les cancers épidermoïdes de la tête et du cou (Veracini et al., 2015) sur des cellules d’origine épithéliale ou mésenchymateuse. On retrouve ces groupes de cellules principalement à la bordure des tumeurs à l’interface avec le stroma (Friedl et al., 2012).
Comme pour la migration de cellules isolées, que nous avons brièvement décrite dans la partie précédente (Figure 4), la CCM résulte de la polymérisation et la contractilité de l’actomyosine couplées à la polarité cellulaire. Il y a cependant des différences clés. La migration cellulaire suit un processus cyclique décrit en 5 étapes : polarisation et protrusion du front de migration dirigées par le cytosquelette d’actine, suivi par l’attachement à la matrice extracellulaire et sa dégradation protéolytique, contraction du cytosquelette d’actomyosine (générant une tension le long de la cellule) pour terminer par un glissement vers l’avant de l’arrière de la cellule (Friedl et Wolf, 2009). Ces principes sont conservés lors de la CCM mais la principale différence est que les jonctions intercellulaires sont conservées aussi bien au niveau du front de migration que des régions latérales et au centre du groupe de cellules en mouvement (Lecaudey et Gilmour, 2006). Par conséquent, la migration cellulaire collective diffère dans la polarisation coordonnée et simultanée des cellules (souvent nombreuses) au front de migration du groupe; la translocation des cellules par couplage physique et force de traînée; l’activité du cytosquelette d’actine dans de multiples cellules le long ou sous le groupe de cellules; le remodelage secondaire de la matrice extracellulaire le long de la voie de migration et la rétraction coordonnée de plusieurs des cellules à l’arrière du groupe (Friedl et Gilmour, 2009; Ilina et Friedl, 2009) (Figure 14). Les modes de migration isolée ou collective (Figure 15) dépendent des jonctions intercellulaires, de la contractilité du cytosquelette et du turn-over des jonctions cellulaires à la matrice extracellulaires via les intégrines. Les cellules peuvent adopter une migration isolée ou collective selon la modification des propriétés que l’on vient d’énoncer (Friedl et Wolf, 2009) et notamment la régulation des jonctions intercellulaires (Friedl et Mayor, 2017). Cette plasticité peut être associée aux notions d’EMT partielle et réversible introduites plus tôt et au statut épithélio-mésenchymateux des cellules (Aiello et al., 2018; Revenu et Gilmour, 2009; Saitoh, 2018).
Implication des jonctions intercellulaires
Le rôle des jonctions intercellulaires dans ce comportement collectif est primordial car elles permettent aux cellules de rester cohésives mais, elles peuvent également contribuer à la signalisation entre cellules, à la polarité cellulaire, à l’intégrité mécanique et au couplage entre les cellules voisines. L’ensemble des jonctions épithéliales classiques (jonctions adhérentes, serrées, desmosomes, jonction gap) peut être maintenu entre les cellules du groupe migratoire et participer au processus (Ilina et Friedl, 2009).
Les jonctions épithéliales et notamment les jonctions adhérentes médiées par les cadhérines peuvent participer à la régulation de la migration cellulaire collective (Bazellières et al., 2015). Les cadhérines participeraient à la CCM en régulant l’activité des Rho GTPases (Plutoni et al., 2016b), ainsi il a été démontré que la P-cadhérine favorisait la migration cellulaire collective en activant la Rho GTPase Cdc42 (Plutoni et al., 2016a).
Les Rho GTPases RhoA, Rac1, Cdc 42 mais aussi RhoE (Thuault et al., 2016) participent activement à la migration cellulaire collective : régulation de la dynamique d’actine, formation de protrusions maintien de la polarité avant-arrière et de la polarité apico-basale, mécanotransduction, stabilité des jonctions intercellulaires entre les cellules leaders et les autres cellules (Zegers et Friedl, 2014). Leurs fonctions lors de la CCM (différentes selon le type de Rho GTPase) sont principalement médiées par leur capacité à remodeler le cytosquelette d’actomyosine.
Hétérogénéité des cellules lors de la migration cellulaire collective
Au sein d’un groupe de cellules migratoires, les cellules peuvent avoir différents phénotypes en fonction de leur position et de leur rôle. S’il a été décrit que les fibroblastes (Gaggioli et al., 2007) ou les macrophages (Condeelis et Pollard, 2006) pouvaient remplir cette fonction, ce sont principalement les cellules leader (sur le front de migration) (Figure 14) qui sont le moteur de la migration cellulaire collective en dégradant la matrice extracellulaire et en impulsant le mouvement et la migration de l’ensemble des cellules.
Différentes études rapportent que ces cellules leaders seraient principalement de phénotype mésenchymateux, les autres cellules de la cohorte étant plutôt épithéliales (Revenu et Gilmour, 2009; Westcott et al., 2015).
Clusters de cellules tumorales circulantes
Nous avons évoqué les cellules tumorales circulantes isolées au moment des étapes du processus métastatique. On les retrouve dans la grande majorité des carcinomes (Alix-Panabières et Pantel, 2014) et l’étude de leur rôle dans la progression tumorale est un champ de recherche à part entière. Les découvertes récentes concernant ces CTC (Alix-Panabières et Pantel, 2013; Dive et Brady, 2017) ont conduit à l’approbation par la Food and Drug Administration (FDA) de leur potentiel prédictif du pronostic des patients (Cristofanilli et al., 2009).
Des clusters de CTC, définis comme des groupes de cellules tumorales circulantes (plus de deux ou trois cellules selon les études), ont été identifiés dans la circulation sanguine de patients. Ces clusters sont connus sous différents noms : microembolis, micrométastases, clumps (paquets) ou agrégats. Par la suite, nous dénommerons clusters de CTC des clusters constitués uniquement de cellules tumorales et microembolis tumoraux circulants (CTM) des groupes de cellules incluant des cellules tumorales et non-tumorales (plaquettes, leucocytes, fibroblastes).
Découverte et premières observations
Si les cellules tumorales circulantes ont été mises en évidence il y a plus de 150 ans par Ashworth (Ashworth, 1869), il a fallu attendre les années 1950 pour que soient identifiés les premiers clusters de CTC (Talmadge et Fidler, 2010, Figure 17). Dans les années qui ont suivies il a été démontré que ces clusters pouvaient rapidement passer dans la circulation pulmonaire (Zeidman et Buss, 1952), et que l’injection de clusters de cellules de carcinome dans le système veineux d’une souris conduisait à l’apparition de métastases contrairement à l’injection de cellules isolées (Watanabe, 1954).
Ces premiers résultats démontrant le potentiel métastatique supérieur des clusters comparé à celui des cellules isolées dans des modèles animaux ont été confirmés sur des métastases pulmonaires de mélanome et des métastases hépatiques de cancer du côlon (Fidler, 1973; Thompson, 1974; Topal et al., 2003; Updyke et Nicolson, 1986). De plus ce potentiel métastatique est dépendant de la taille et de la concentration de clusters (Liotta et al., 1974).
Modèles d’étude de l’agrégation cellulaire tumorale en conditions ancrage-indépendantes
Comme nous venons de le voir dans les précédentes parties les jonctions cellulaires ont un rôle prépondérant lors du processus métastatique.
Ces données confirment le besoin de modèles d’étude in vitro permettant d’étudier le rôle de ces jonctions dans le phénomène d’agrégation cellulaire tumorale en absence d’ancrage.
Les essais d’agrégation décrits dans la bibliographie
Un grand nombre d’études utilisent des essais d’agrégation sans ancrage. Ils reposent tous sur l’utilisation d’un support de culture dont la surface est traitée pour empêcher l’adhésion cellulaire. La différence d’agrégation entre deux conditions, par exemple en condition contrôle versus un traitement pharmacologique, est généralement analysée après des durées assez longues (Figure 29A, Figure 2). Les résultats sont présentés sous forme d’images en microscopie sans quantification (Figure 29) ou avec quantification selon des paramètres tel que la taille des agrégats (Figure 30), le nombre d’agrégats, le nombre de cellules ou encore le pourcentage d’agrégation (mesuré en fonction du nombre de cellules qui restent seules et ne forment pas d’agrégats).
Ce type de quantification donne des informations assez partielles et en particulier ne prend donc pas en compte la cinétique et la dynamique du processus d’agrégation ni ses étapes précoces.
Validation de l’essai et identification de protéines membranaires régulatrices de l’agrégation cellulaire tumorale
Afin de confirmer que les paramètres d’agrégation cellulaire observés étaient indépendants de la migration cellulaire ou de l’adhésion à une matrice, l’impact d’un peptide RGD (Arg-Gly-Asp) qui empêche les interactions entre les intégrines et la matrice extracellulaire (Plow et al., 2000) a été évalué. Aucun effet n’a été observé (Figure 33), ce qui démontre que les cellules n’adhèrent pas à la surface des puits via des intégrines et que cet essai se déroule bien dans des conditions ancrage-indépendantes.
Un traitement des cellules à la trypsine (0,4%) a été utilisé pour abolir totalement l’agrégation des cellules HCT116 et montrer que la présence de protéines à la membrane cellulaire est essentielle à l’agrégation (Figure 34) et que des phénomènes passifs comme la gravitation ne sont pas impliqués. De même, l’implication de protéines transmembranaires calcium-dépendantes (Grunwald, 1993; Kemler et al., 1989; Koch et al., 1997) a été confirmé par l’effet inhibiteur de l’EDTA (Ethylène-diamine-tétra-acétique, chélateur d’ions). La contribution de protéines transmembranaires de jonctions cellule-cellule calcium-dépendantes a été étudiée: la E-cadhérine (jonction adhérente), la desmogléine 2 et la desmocolline 2 (desmosome), à l’aide d’un anticorps bloquant (Bracke et al., 1993; Shimoyama et al., 1989) pour la première protéine et de peptides bloquants pour les deux suivantes (Runswick et al., 2001). Dans les deux cas l’inhibition de la E-cadhérine ou de DSC2 et DSG2 a pour conséquence une inhibition importante de l’agrégation, on constate en plus un effet additif mais pas total lorsque l’on bloque simultanément les 3 protéines. Ces résultats suggèrent que l’adhésion médiée par la E-cadhérine et les protéines desmosomales coordonnent simultanément l’agrégation cellulaire tumorale. Cependant il y a certainement d’autres protéines transmembranaires calcium dépendantes impliquées dans ce processus car l’inhibition n’est pas totale lorsque l’on bloque simultanément ces 3 protéines.
Ces résultats sont extrêmement intéressants car la plakoglobine, identifiée dans les travaux d’Aceto et al. sur les clusters de cellules tumorales circulantes, participe à la fois aux jonctions adhérentes (E-cadhérine, Harris et Tepass ; 2010) et aux desmosomes (DSC2, DSG2, Garrod et al., 2008).
En conclusion cet essai original permet d’étudier spécifiquement les mécanismes d’agrégation cellulaire tumorale en conditions ancrage-indépendantes. Son utilisation a permis d’identifier des régulateurs de l’agrégation qui y participent activement (protéines de jonction intercellulaire calcium-dépendantes E-cadhérine, DSC2 et DSG2) ou qui l’inhibe (tension du cytosquelette générée par la myosine IIA, voir article).
Implication des jonctions communicantes (ou jonctions gap)
Les jonctions gap ont de nombreux et différents rôles au sein de la cellule et une implication majeure dans la progression tumorale de nombreux types de cancer (aussi bien anti- que pro-tumorale selon les contextes, (Kandouz et Batist, 2010, Aasen et al., 2016). Nous avons donc examiné si les jonctions gap étaient présentes au cours de ce processus et si elles y contribuaient. Pour y répondre nous avons utilisé l’essai d’agrégation présenté précédemment ainsi qu’un essai reposant sur le transfert d’une sonde fluorescente (la calcéine) entre les cellules au cours de l’agrégation en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques des jonctions gap. Ces travaux nous ont permis de mettre en évidence le rôle des jonctions gap au cours de l’agrégation et ont fait l’objet d’une publication dans le journal BMC Cancer (Gava et al., 2018).
Introduction et résumé de l’article
Les jonctions gap, en plus de leur rôle dans l’adhésion intercellulaire, ont la particularité de créer une communication directe entre le cytoplasme de deux cellules jointes via un canal afin d’échanger des molécules hydrophiles de petite taille (inférieures à 1kDa). Dans notre approche expérimentale nous avons utilisé cette caractéristique pour mettre en évidence la présence de jonctions gap fonctionnelles lors de l’agrégation des cellules MCF7 grâce à une sonde fluorescente, la calcéine, capable de transiter via ces jonctions (le principe détaillé de cet essai est exposé Figure 35 et 36).
Dans un premier temps nous avons démontré que des jonctions gap fonctionnelles sont établies au cours de l’agrégation et ce dès les étapes précoces. En effet, nous avons montré l’existence d’un transfert spécifique de calcéine des cellules positives vers les cellules négatives dès les deux premières heures et qui augmente au cours de l’agrégation des cellules MCF7. Pour confirmer ce résultat nous avons ensuite utilisé deux inhibiteurs pharmacologiques des jonctions gap : le Tonabersat et le Méclofenamate. De manière similaire ces deux drogues provoquent une inhibition significative du transfert de calcéine au cours du temps traduisant un blocage des jonctions gap. Nous avons ensuite étudié l’impact du blocage des jonctions gap par ces deux drogues sur l’agrégation des cellules MCF7. On observe une inhibition partielle de l’agrégation des cellules à des temps précoces (entre 1h et 5h) soit dès l’établissement de jonctions gap fonctionnelles ce qui se traduit par un ralentissement, l’effet inhibiteur se dissipant au-delà de 5h.
Cette première partie des résultats semble démontrer la présence de jonctions gap fonctionnelles qui participent activement au processus d’agrégation des cellules MCF7.
Connaissant le rôle du cytosquelette d’actine dans la localisation et la stabilisation des jonctions gap à la membrane (Ambrosi et al., 2016), nous avons étudié l’effet de sa désorganisation sur la formation de jonctions gap fonctionnelles et le processus d’agrégation grâce à l’utilisation de la Latrunculine A (Figure 37A). Le traitement des MCF7 avec ce composé inhibe significativement le transfert de calcéine au cours du temps par les jonctions gap de manière comparable à ce qui est observé avec les inhibiteurs Méclofenamate et Tonabersat, ainsi que l’agrégation durant les cinq premières heures. De plus la combinaison Méclofenamate plus Latrunculine A ne provoque pas d’effet additif de l’inhibition de transfert de calcéine suggérant que les deux molécules agissent sur le même mécanisme.
Nous avons aussi étudié l’impact du trafic vésiculaire sur les deux processus étudiés, au vu de son rôle décrit dans la bibliographie dans l’acheminement des connexines à la membrane (qui formeront les futures jonctions gap, Smyth et al., 2012). Pour cela nous avons eu recours à la Bréfeldine A qui inhibe le transport du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi et déstructure ce même appareil de Golgi (Figure 37B). La Brefeldine A inhibe le transfert de calcéine et l’agrégation des cellules de manière dépendante de la concentration. Contrairement à la Latrunculine A et aux inhibiteurs de jonctions gap l’effet de la Bréfeldine aux concentrations efficaces se prolonge sur toute la durée de l’essai d’agrégation.
La capacité de la Latrunculine A et de la Bréfeldine A à inhiber l’établissement de jonctions gap à la membrane des MCF7 est confirmée par les résultats obtenus par immunofluorescence indirecte lorsque l’on observe la connexine 43. Sa localisation membranaire qui permet la formation des jonctions gap est perdue lorsqu’on traite les cellules avec ces deux composés.
Effet d’anticorps bloquants dirigés contre la P-cadhérine et la E-cadhérine, seuls ou en combinaison, au cours de l’essai d’agrégation
Après avoir montré la présence de P-cadhérine à la surface des cellules HCT116 et MCF7 au cours de l’agrégation nous avons examiné si un anticorps bloquant de la P-cadhérine (le même que celui utilisé pour la cytométrie : clone NCC-CAD-299) avait un impact sur l’agrégation de ces lignées. Nous avons précédemment montré l’effet de l’anticorps bloquant de la E-cadhérine (clone HECD-1) sur les cellules MCF7 et HCT116 et son effet additif avec l’inhibition des protéines desmosomales (Saias et al., 2015). Nous avons donc utilisé cet anticorps comme contrôle et en combinaison avec celui dirigé contre la P-cadhérine.
Pour la lignée MCF7 on peut voir que l’anticorps bloquant la P-cadhérine n’a aucun effet sur l’agrégation des cellules contrairement à l’anticorps anti E-cadhérine (Figure 43A et 43B), les cellules agrègent de manière identique au contrôle (pas de traitement) et à la condition anticorps non-relevant (anticorps reconnaissant une cible cytoplasmique et utilisé à la même concentration). De manière logique la combinaison des deux anticorps bloquants a un effet identique à celle de l’anticorps anti E-cadhérine seul, ces résultats sont visibles aussi bien sur les courbes d’agrégation (Figure 43A) que sur les galeries d’images associées (Figure 43B). Afin de vérifier que cette absence d’effet n’était pas due à l’anticorps lui-même nous avons utilisé un deuxième anticorps bloquant de la P-cadhérine (clone 6A9). Là encore, on n’observe pas d’effet de l’inhibition de l’établissement de jonctions P-cadhérine sur l’agrégation des cellules MCF7 (Figure 44A et 44B). Concernant la lignée HCT116 on observe que l’anticorps P-cadhérine (clone NCC-CAD-299) inhibe fortement l’agrégation des cellules (Figure 45A et 45B) dès les premières heures puis tout au long de l’essai et de manière comparable à l’anticorps anti E-cadhérine (clone HECD- 1) avec une agrégation inhibée d’environ 50% (aire normalisée=0,40 pour le contrôle et 0,76 avec l’anticorps anti P-cadhérine, voir tableau Figure 45A). Cependant l’effet inhibiteur apparait de façon plus rapide avec l’anticorps anti P-cadhérine, en effet on observe une différence significative dès 2h par rapport au contrôle (t-test et Welch’s correction, p=0,0018) contrairement à l’anticorps anti E-cadhérine (Mann-Whitney test, p=0,1337).
Rôle et interaction de la E- et P-cadhérine dans l’agrégation des cellules MCF7 et HCT116
Nous avons ensuite voulu déterminer si à cette expression de P-cadhérine à la membrane s’ajoutait un rôle de la P-cadhérine dans l’agrégation des cellules MCF7 et HCT116.
De manière intéressante le blocage de la P-cadhérine n’inhibe pas l’agrégation des cellules MCF7 contrairement à ce qui a été décrit pour la E-cadhérine et malgré le fait que la P-cadhérine soit bien présente à la membrane de ces cellules.
On peut supposer que la E-cadhérine compense complètement l’absence de jonctions médiées par la P-cadhérine, les résultats de cytométrie suggérant en effet une expression plus élevée de la E-cadhérine que de la P-cadhérine à la surface des MCF7. De plus la détection de la P-cadhérine à la membrane ne permet pas d’affirmer qu’elle est fonctionnelle. Il a en effet été démontré sur des cellules tumorales d’origine colorectale COLO205 qui exprime à sa surface une E-cadhérine normale mais rendue inactive par une modification allostérique ce qui empêche l’agrégation de ces cellules (Aono et al., 1999; Petrova et al., 2012). Une telle modification conformationnelle pourrait aussi empêcher la fonction bloquante des anticorps anti P-cadhérine testés bien qu’ils reconnaissent la protéine comme le démontrent les résultats de cytométrie.
Il est également possible que la P-cadhérine ne participe pas à l’agrégation des MCF7 dans nos conditions expérimentales. En effet, cette protéine a un rôle très controversé dans la bibliographie quant à son rôle dans la progression tumorale selon le contexte et le modèle étudié. Elle est aussi bien décrite comme favorisant l’adhésion des cellules tumorales (Usui et al., 2014) que comme participant à leur migration (Plutoni et al., 2016b; Vieira et al., 2014; Vieira et Paredes, 2015), notamment concernant les cancers mammaires et les modèles qui en sont issus (Albergaria et al., 2011).
L’effet du blocage de la P-cadhérine a pour conséquence une forte inhibition de l’agrégation des cellules HCT116 de manière comparable au blocage de la E-cadhérine en termes d’amplitude et de durée, et même un peu plus précoce et importante. La P-cadhérine aurait donc un rôle plus prépondérant que la E-cadhérine au cours de l’agrégation, en accord avec l’expression plus élevée de P-cadhérine détectée à 0 et 5 heures durant l’agrégation par cytométrie pour les cellules HCT116 (à l’inverse des MCF7). A T0 environ la moitié des cellules n’ont pas encore de E-cadhérine à la membrane, à 5 heures plus de 80% des cellules sont E-cadhérine positives à la membrane mais cela reste inférieur à la P-cadhérine : la quasi-totalité des cellules sont P-cadhérine positives dès T0, cela pourrait expliquer pourquoi la P-cadhérine a un rôle plus prépondérant que la E-cadhérine sur l’agrégation des HCT116. Cependant, pour cette lignée cellulaire aucune des deux cadhérines ne peut compenser le blocage de la deuxième cadhérine, du moins complètement, puisque les cellules n’agrègent que partiellement dans les deux conditions. De ce fait on aurait pu s’attendre à ce que le blocage simultané des deux cadhérines provoque un effet additif comme précédemment observé avec l’inhibition combiné de la E-cadhérine et des desmosomes (Saias et al.). L’absence d’un tel effet additif pourrait s’expliquer par la formation des jonctions adhérentes E et P-cadhérines mixtes hétérophiliques lors de l’agrégation des HCT116 (Figure 50), comme précédemment décrit dans la bibliographie avec d’autres modèles (Duguay et al., 2003; Foty et Steinberg, 1997). Pour vérifier cette hypothèse il faudrait avoir recours à de la microscopie de type super-résolution pour explorer à l’échelle de la protéine avec un marquage différent pour chaque cadhérine.
Une autre hypothèse serait qu’il y ait seulement des jonctions adhérentes homophiliques spécifiquement E-cadhérines dépendantes et P-cadhérines dépendantes mais que la présence d’un des deux types de jonction homophilique soit nécessaire pour que l’autre puisse se former et ainsi participer à l’agrégation des cellules, sachant qu’elles utilisent les mêmes mécanismes et les mêmes acteurs protéiques pour former des jonctions adhérentes. Dans ce cas de figure on peut donc aussi se demander si la présence des anticorps bloquants fixés spécifiquement sur une des deux cadhérines ne crée pas un encombrement stérique du à leur taille qui empêcherait aux jonctions médiées par la deuxième cadhérine de se former.
Implication d’autres protéines de jonction dans l’agrégation des cellules HCT116 et MCF7
Nos précédents résultats nous ont permis d’identifier plusieurs acteurs de l’agrégation cellulaire tumorale impliquées dans la formation des jonctions adhérentes (E et P-cadhérine), des desmosomes (Saias et al., 2015) (Figure 52) et des jonctions gap, mais pas de protéines appartenant à un autre grand type de jonction intercellulaire des cellules épithéliales, les jonctions serrées (Figure 52). Ils ne nous ont pas non plus permis d’identifier de protéines intracellulaires dites « intermédiaires » qui font le lien entre les protéines transmembranaires et le cytosquelette telle que la plakoglobine (Figure 52).
Nous avons donc décider d’orienter nos travaux vers l’identification de nouveaux régulateurs de l’agrégation parmi les protéines appartenant aux jonctions serrées et les protéines intracellulaires intermédiaires de jonctions intercellulaires notamment depuis la mise en évidence du rôle d’une de ces protéines dans la formation de clusters de cellules tumorales circulantes mammaires (Aceto et al., 2014).
Afin d’identifier les acteurs potentiels de l’agrégation des cellules HCT116 et MCF7 nous avons recherché les niveaux d’expression de protéines candidates en utilisant la base de données CellMiner (Reinhold et al., 2012). Cette ressource permet d’accéder au niveau d’expression transcriptomique d’un très grand nombre de protéines sur le panel de lignées cellulaires tumorales NCI60 auquel appartiennent les cellules MCF7 et HCT116 (Figure 53A). Ce résultat nous a conduits à choisir des protéines transmembranaires et des protéines intracellulaires appartenant aux trois types de jonctions et dont le Z-score de l’ARNm est positif dans les deux lignées modèles pour les invalider par interférence à l’ARN (siRNA) (Figure 53B).
Etablissement d’une signature des propriétés agrégatives des lignées cellulaires tumorales
Notre premier objectif a été de déterminer quels sont les paramètres qui décrivent le mieux les capacités d’agrégation des lignées cellulaires tumorales. Ces paramètres doivent être objectifs, représentatifs mais aussi discriminants puisque ce sont eux qui vont nous permettre d’établir une classification. Nous avons donc choisi et fixé des paramètres qui traduisent la dynamique d’agrégation (amplitude et vitesse) issus des courbes d’agrégation mais aussi la cohésion des agrégats obtenus, afin d’établir un profil d’agrégation le plus complet et précis possible.
Définition et méthode de détermination des paramètres d’agrégation
Paramètres caractérisant la dynamique d’agrégation
Les paramètres descripteurs de la dynamique d’agrégation que nous avons retenus sont les suivants :
– Aire Minimale (ou A min) (Figure 57A) : C’est le niveau d’agrégation maximal que peut atteindre une lignée en 24h durant cet essai, ce niveau correspond à la valeur minimale de l’aire relative occupée par les cellules (plus les cellules sont agrégées plus l’aire projetée qu’elles occupent est faible). Plus cette aire sera faible plus les cellules seront capables d’agréger de manière importante entre elles et auront une grande amplitude d’agrégation.
– Temps d’Aire Minimale (ou T A min) (Figure 57A) : Il s’agit du temps nécessaire pour atteindre le maximum d’agrégation ou l’aire minimale. Si les cellules atteignent un plateau on prendra le temps auquel démarre celui-ci. Si les cellules n’ont pas atteint cette phase de plateau à la fin de l’essai (au bout de 24h) alors on prendra le temps final (24h). Plus ce temps sera faible plus les cellules atteindront rapidement leur maximum d’agrégation / aire minimale.
– Aire à 2h, 5h et 10h (A T2h, A T5h, AT10h) (Figure 57B). Les deux premiers paramètres sont importants mais ne suffisent pas à décrire la dynamique au cours de l’essai. C’est pourquoi nous avons aussi défini comme paramètres d’agrégation l’aire occupée par les cellules à des temps plus ou moins précoces durant la première partie de l’essai : 2, 5 et 10 heures. Nous avons choisi ces temps car pour les lignées que nous avions étudiées antérieurement l’agrégation se déroule essentiellement durant les 10 premières heures.
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Table des matières
INTRODUCTION
1) L’apparition de métastases : une cascade d’évènements complexes
a) Les étapes du processus métastatique
i. Détachement et invasion
ii. Intravasation
iii. Cellules tumorales circulantes : survie, adhérence à l’endothélium et extravasation
iv. Colonisation et formation de métastases
b) La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) : un rôle clé dans le processus métastatique
i. Mécanismes de l’EMT
ii. L’EMT : un processus plastique, transitoire, réversible et partiel
2) Comportements collectifs cellulaires lors de la cascade métastatique
a) Migration cellulaire collective (CCM) tumorale
i. Définition et mécanismes
ii. Implication des jonctions intercellulaires
iii. Hétérogénéité des cellules lors de la migration cellulaire collective
b) Clusters de cellules tumorales circulantes
i. Découverte et premières observations
ii. Techniques de capture, d’isolement et d’identification permettant la caractérisation morphologique et la fréquence des clusters de CTC
iii. Origine(s) et formation
iv. Expression de marqueurs épithélio-mésenchymateux au sein des clusters de CTC
v. Potentiel métastatique et mécanismes associés
vi. Application clinique
vii. Perspectives
3) Modèles d’étude de l’agrégation cellulaire tumorale en conditions ancrage-indépendantes. 58
a) Les essais d’agrégation décrits dans la bibliographie
b) Développement d’un essai d’agrégation original
i. Concept de l’essai d’agrégation
ii. Validation de l’essai et identification de protéines membranaires régulatrices de l’agrégation cellulaire tumorale
RESULTATS
PARTIE 1/ ETUDE DE L’IMPLICATION DES PROTEINES DE JONCTIONS CELLULAIRES DANS L’AGREGATION CELLULAIRE TUMORALE EN CONDITIONS ANCRAGE-INDEPENDANTES
1) Implication des jonctions communicantes (ou jonctions gap)
a) Introduction et résumé de l’article
b) Article:
c) Résultats complémentaires
i. Etude de l’expression membranaire de Cx43 par cytométrie de flux
ii. Rôle de la E-cadhérine sur la formation des jonctions gap et l’agrégation
d) Discussion
i. Mise en évidence de la présence de jonctions gap fonctionnelles lors de l’agrégation
ii. Inhibition des jonctions gap au cours de l’agrégation
iii. Contribution et rôle des jonctions gap au cours de l’agrégation
iv. E-cadhérine et jonctions gap
2) Implication de la P-cadhérine (et de la E-cadhérine) au cours de l’agrégation des lignées HCT116 et MCF7
a) Expression de la E-cadhérine et de la P-cadhérine au cours de l’agrégation des HCT116 et des MCF7
b) Effet d’anticorps bloquants dirigés contre la P-cadhérine et la E-cadhérine, seuls ou en combinaison, au cours de l’essai d’agrégation
c) Discussion
i. Expression de la E- et P-cadhérine à la surface des cellules MCF7 et HCT116
ii) Rôle et interaction de la E- et P-cadhérine dans l’agrégation des cellules MCF7 et HCT116
iii) Blocage et inhibition de la P-cadhérine par anticorps bloquant : plus qu’une inhibition de l’agrégation ?
iv) Implication d’autres protéines de jonction dans l’agrégation des cellules HCT116 et MCF7
PARTIE 2/ CLASSIFICATION DE LIGNEES CELLULAIRES TUMORALES SELON LEURS PROPRIETES AGREGATIVES EN CONDITIONS ANCRAGE INDEPENDANTES
1) Etablissement d’une signature des propriétés agrégatives des lignées cellulaires tumorales
a) Définition et méthode de détermination des paramètres d’agrégation
i. Paramètres caractérisant la dynamique d’agrégation
ii. Paramètres caractérisant la cohésion des agrégats : le flush assay
b) Quantification des paramètres définissant la signature des propriétés agrégatives du panel des lignées cellulaires tumorales
i. Caractérisation quantitative de la dynamique d’agrégation
ii. Cohésion des agrégats : Flush assay
iii. Etablissement des signatures d’agrégation des lignées cellulaires à partir des différents
paramètres d’agrégation
3) Classification des lignées cellulaires tumorales selon leurs paramètres d’agrégation
a) Détermination des classes (nombre et composition)
b) Caractéristiques et profils d’agrégation des classes identifiées
i) Description des capacités agrégatives de chaque classe
ii) Profil d’agrégation de chaque classe
c) Etude de la proximité entre les paramètres d’agrégation
d) Corrélation entre profil d’agrégation et propriétés des lignées cellulaires tumorales
e) Discussion
CONCLUSION ET DISCUSSION GENERALE
1) Ciblage thérapeutique des métastases : un enjeu majeur
2) Impact des régulateurs et des capacités d’agrégation sur la progression tumorale
a) Les régulateurs de l’agrégation cellulaire
b) Quel modèle de lignée cellulaire ?
c) Diversité des capacités d’agrégation des cellules tumorales
d) Lien entre propriétés d’agrégation et potentiel métastatique
3) Enjeux et perspectives
MATERIEL et METHODES
1) Culture cellulaire
2) Essai d’agrégation
a) Préparation des cellules
b) Acquisition des images par vidéomicroscopie
c) Traitement des images et quantification
3) Immunofluorescence indirecte Cx43
4) Détection de Cx43, E-cadhérine et P-cadhérine par cytométrie de flux
5) Transfection des siRNA
6) RTqPCR
7) Flush assay
8) Classification
a) Classification non-supervisée ascendante hiérarchique (Ward)
b) Classification par ré-allocation dynamique (nuées dynamiques) ou agrégation autour des centres mobiles (kmeans)
9) Analyses statistiques
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