Soutenance mémoire
Epidémiologie des infections à Bartonella
Technique sérologique
La technique sérologique employée est l’Immuno-Fluorescence Indirecte (IFI).
Antigène:
L’antigène utilisé est préparé selon la technique de Chomel (28) adaptée à Bartonella isolée de bovins. Il s’agit d’un antigène obtenu par infection de cellule de rein de singe (cellule VERO) par Bartonella sp. Souche A91-4, isolée à partir d’un bovin de l’élevage étudié et fixé dans l’acétone froid.
Réalisation technique
Les sérums de bovins ont été dilués dans du PBS pH 7,2 (Phosphate Buffer Saline). 30μL de chaque dilution ont été déposés dans les puits d’antigène. Les lames ont été incubées 30min. à 37° sous atmosphère humide puis lavées 3 fois dans du PBS sous agitation.Le conjugué (sérum de lapin anti-IgG (H+L) de bovin marqué à la fluorescéine) dilué au 1/100ème a été déposé. Après 30min. à 37° sous atmosphère humide et 3 lavages, la lame est montée sous lamelle fixée au Fluoprep (BioMérieux) et lue au microscope à fluorescence avec un objectif 100 à immersion (Olympus).Les lames ont fait l’objet d’un premier criblage à la dilution du 1/50ème puis, pour les positifs, la dilution titrage a été réalisée avec des dilutions variant du 1/50ème au 1/800èmeLes lames ont fait l’objet d’une lecture en double aveugle.Le système de lecture est celui de Chomel (28). Est considéré comme positif tout sérum présentant deux croix de fluorescence au 1/50ème.
Chaque lame comporte un témoin négatif (PBS) et un témoin positif (sérum de bovin positif dilué au 1/50ème).Les titres sont exprimés en inverse de dilution.
Identification bactérienne
Isolement des bactéries
Après décongélation, le sang est centrifugé 75 minutes à 3500 tours-minutes à température ambiante. Le surnageant est éliminé et le culot remis en suspension dans 250 microlitres de milieu pour culture cellulaire (RPMI 1640 ; GIBCO). La totalité du volume de suspension obtenue (entre 300 et 500 microlitres) est divisée en deux inoculums de tailles égales. Chaque inoculum est étalé sur une boite de gélose BHI (Brain Heart Infusion Agar ; DIFCOND) enrichie de 5% de sang de lapin,défibriné. Les géloses sont utilisées dans les 15 jours suivant leur fabrication. Les,boites sont ensuite mises à incuber à l’étuve (SANYOND) à 35°C sous atmosphère,enrichie à 5% de CO2. Chaque boite est contrôlée dans les deux jours suivants,l’ensemencement (pour dépister les éventuelles boites contaminées et les éliminer),puis une à deux fois par semaine pendant quatre semaines. Une colonie par animal,est repiquée puis congelée (dans du sérum de veau foetal) pour une identification ultérieure. L’isolat est à nouveau congelé après identification.
La culture des Bartonella est réalisée sur Gélose BHI ( Brain Heart Infusion Agar ; DIFCO ND) enrichie par 5% de sang de lapin défibriné. Les géloses sont,utilisées dans les 15 jours suivants leur fabrication.
Identification des bactéries
L’identification préliminaire des bactéries isolées au genre Bartonella est effectuée sur différents critères :
• Temps d’apparition des colonies en primo cultures, soit 7 à 30 jours.
• L’aspect des colonies en primo culture : grises, rugueuses, d’une taille de 1 à 2 millimètres de diamètre.
• L’aspect des bactéries après coloration de Gram, à savoir : des petits bacilles Gram négatifs.
L’identification définitive du genre est réalisée par amplification en chaîne (PCR : Polymerase Chain Reaction) de l’extrémité 3’ du gène glt a codant pour la,citrate synthétase. Les amorces utilisées, spécifiques du genre Bartonella, sont :
– BhCS 781 : ggg gAC Cag CTC Atg gTg g (19nt)
– BhCS 1137 : AAT gCA AAA AgA ACA gTA AAC A (22nt)
Le produit d’amplification obtenu présente une taille d’environ 380 paires de base. Il est mis en évidence par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. Sa présence établit l’identification au genre Bartonella.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Médecine Vétérinaire |
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Table des matières
TABLE DES FIGURES
TABLE DES TABLEAUX
ABREVIATIONS DES VARIABLES STATISTIQUES
INTRODUCTION GENERALE
I. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A. Bactériologie
1. Position taxonomique du genre Bartonella et classification
2. Culture
3. Identification
a) Macroscopique
b) Microscopique
c) Biochimique
d) Sérologique
e) Génétique
4. Epidémiologie des infections à Bartonella
a) Espèces infectées
b) Répartition géographique
c) Répartition par individus
d) Transmission
(1) Vecteur arthropode
(2) Effraction cutanée ou contact oculaire
(3) Transmission transplacentaire
B. Pouvoir pathogène
1. Pathogénie
a) Localisation des bactéries dans l’hôte
(1) Dans le sang
(2) Dans les tissus
b) Fixation aux cellules-hôtes
c) Pénétration dans les cellules
(1) Cellules sanguines
(2) Cellules endothéliales
d) Angiogénèse
e) Durée de la bactériémie
2. Pathologies induites
a) Chez l’homme
(1) La maladie des griffes du chat (MGC)
(2) La maladie de Carrion
(3) La fièvre des tranchées
(4) Angiomatose bacillaire (forme cutanée)
(5) Angiomatose bacillaire (autres formes)
(6) Bactériémie
(7) Endocardite
(8) Neurorétinite
(9) Autres maladies
b) Chez l’animal
(1) Bactériémie
(2) Autres atteintes
(a) Chez le Chat
(b) Chez le Chien
(c) Chez la Souris
C. Diagnostic de l’infection
1. Clinique
2. Histologie
3. Isolement
4. PCR
5. Tests sérologiques
D. Diagnostic nécropsique chez l’animal
1. Macroscopique
2. Histologique
E. Traitement
1. Chez l’homme
2. Chez le chat
F. Prévention
II. PARTIE EXPERIMENTALE
A. Matériels et méthodes
1. Prélèvements
2. Technique sérologique
a) Antigène
b) Réalisation technique
3. Identification bactérienne
a) Isolement des bactéries
b) Identification des bactéries
4. Définition des variables
a) Variables sérologiques
b) Variables bactériologiques
c) Variables décrivant le statut général des bovins
d) Variables décrivant les performances de reproduction
e) Variables portant sur la qualité cellulaire du lait produit
5. Calculs statistiques et méthode utilisée
B. Résultats
1. Résultats sérologiques
a) Résultats du criblage
b) Résultats du titrage
c) Répartition par classes d’âge
(1) Séropositivité
(2) Titres
d) Répartition chez les animaux de moins de trois mois au moment de la prise de sang
e) Répartition par statut de gestation
f) Répartition par trimestre de gestation
2. Résultats bactériologiques
a) Résultats de la première série de prélèvement
b) Résultats de la deuxième série de prélèvement
c) Description de la bactériémie dans le troupeau
(1) Bactériémie et âge
(2) Bactériémie et gestation
(3) Bactériémie et stade de gestation
(4) Bactériémie et délai entre le vêlage et la prise de sang
3. Comparaison entre immuno-fluorescence et culture
a) Comparaison entre séropositivité et bactériémie
b) Evolution avec l’âge
c) Evolution de la sensibilité avec l’âge
d) Evolution de la spécificité avec l’âge
e) Evolution de la valeur prédictive positive avec l’âge
f) Evolution de la valeur prédictive négative avec l’âge
4. Résultats descriptifs des paramètres zootechniques
a) Variables discontinues binaires
b) Variables discontinues à classes multiples
c) Variables continues
d) Conclusion
5. Résultats de l’analyse univariée
6. Résultats de l’analyse multivariée
a) Variables bactériologiques
b) Variables « intervalle vêlage 1ère IA » en phase 1 et 2
c) Variables « Intervalle Vêlage 1ère IF » en phase 1 et 2
d) Variables cellules du lait
e) Variable INTV1V2
f) Variables discontinues
(1) Cas de la variable ME2
(2) Cas des autres variables discontinues
III. DISCUSSION
A. Les limites des méthodes
1. Les limites de l’immunofluorescence
a) Dilutions
b) Subjectivité de la lecture des résultats
c) Seuil de positivité
d) Antigène utilisé
2. Les limites de la culture bactérienne
a) La contamination des prélèvements
b) Le choix du milieu de culture
3. Les limites des calculs statistiques.
a) Cas de la variable SEMIQ
b) Construction de la base de données
c) Décalage temporel entre prise de sang et certaines variables
d) Regroupement des animaux les plus vieux en une classe unique
e) La non prise en compte de certains paramètres
B. Bartonella dans le troupeau
1. Bactériémie au long cours
2. Mode de contamination
a) Contamination verticale.
b) Contamination horizontale sans intermédiaire vectoriel
c) Contamination horizontale vectorielle
3. Bactériémie et gestation
C. Bartonella et fonction de reproduction
D. Comparaison des résultats des cultures et de la sérologie
1. Animaux séropositifs mais non bactériémiques
2. Animaux séronégatifs mais bactériémiques
3. Application au diagnostic de l’infection
IV. CONCLUSION
V. BIBLIOGRAPHIE
VI. ANNEXE I
VII. ANNEXE II
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