Soutenance mémoire
Enzymes pectinolytiques
Purification des produits PCR
Cette étape de l’identification moléculaire est réalisée au CURI de Fès (Centre Universitaire
Régional d’Interface).
Elimination du Triton-X
Le Triton-X est un détergent ionique puissant qui entre dans la composition du tampon de la réaction PCR. Sa présence dans le produit d’amplification gêne le séquençage. Pour cette raison, son élimination est indispensable pour le bon fonctionnement du séquençage.
– Les produits d’amplification de chaque souche sont rassemblés (≈ 50 μl) dans un tube eppendorf (1,5 ml). Ensuite, le volume est complété à 360 μl par de l’eau bi-distillée stérile puis à 400 μl par NaCl 3 M.
– Après ajout de 800 μl d’éthanol absolu, une congélation à -20°C pendant 30 minutes est entamée suivie d’une centrifugation à 4°C durant 20 minutes à 10000 rpm.
– Le surnageant est éliminé, le culot est lavé dans un volume de 1ml d’éthanol à 70% puis re-centrifugé à la même vitesse pendant 5 minutes. Ce lavage est effectué deux fois.
– Le surnageant est éliminé et le culot est séché ensuite re-suspendu dans un volume de 20 μl de TE (pH=8) et conservé à 4°C.
Elimination des amorces
Fixation d’ADN
Dans chaque tube contenant 10 μl de produit PCR conservé dans du TE :
– Ajouter 100 μl de la solution Magnesil Yellow contenant des billes fixant l’ADN.
– Mélanger à l’aide d’une micropipette, laisser agir durant 45 secondes puis remélanger.
– Transférer les tubes dans un portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale
des billes pendant 10 secondes puis jeter le surnageant.
Lavage
– Récupérer les tubes du portoir magnétique et ajouter 200 μl d’éthanol à 80%.
– Mélanger à l’aide d’une micropipette, laisser agir durant 60 secondes puis re-mélanger.
– Transférer les tubes dans le portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes puis jeter le surnageant.
– Récupérer les tubes du portoir magnétique puis ajouter 100 μl d’éthanol à 80% et procéder comme auparavant. Cette étape de lavage est répétée deux fois. Ensuite, les tubes sont séchés 5 à 10 minutes à température ambiante.
Elution d’ADN
– Replacer les tubes dans un portoir normal
– Ajouter 100 μl d’une solution″water free nuclease″.
– Mélanger à l’aide d’une micropipette, laisser agir durant 60 secondes puis re-mélanger.
– Transférer les tubes dans le portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes puis récupérer le surnageant dans de nouveaux tubes.
– Transférer les tubes de nouveau dans le portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes restantes puis récupérer le surnageant dans de nouveaux tubes. Ces derniers sont conservés à 4°C.
Réaction de séquençage
Le séquençage est accompli sur les produits de PCR préalablement purifiés. Il est réalisé selon la technique automatisée de Sanger.
Cette méthode consiste à faire une amplification spécifique (PCR) dont laquelle on utilise des didésoxynucléosides triphosphates (ddNTP) généralement marqués par des fluorochromes.
L’incorporation de ce didésoxyribonucléotide par l’ADN polymérase bloque l’allongement de la molécule d’ADN en cours de copie. On a donc toute une famille de fragments d’ADN synthétisés avec des longueurs différentes selon qu’un désoxynucléoside monophosphate (dNMP) ou un didésoxynucléoside monophosphate (ddNMP) a été, au hasard, incorporé. Mais dans tous les cas, toutes les molécules se terminent obligatoirement par un ddNMP.
Ces fragments nucléiques sont séparés par électrophorèse selon leur longueur, les plus petits migrent le plus vite. Le pouvoir discriminant du gel de polyacrylamide est tel qu’il permet de différencier des brins d’ADN ne différant en longueur que par un seul nucléotide.
La séquence de l’ADN amplifié est alors lue par un balayage automatique qui permet de distinguer grâce à des fluorochromes différentes les quatre bases A, T, C ou G. L’utilisation de logiciels informatiques permet de fournir un tracé électrophorétique avec des couleurs différentes pour chaque base élémentaire.
L’identification est réalisée par comparaison de cette séquence avec les bases de données des séquences connues.
PCR de séquence
Mélange réactionnel
Le mélange réactionnel utilisé pour la réalisation de la PCR est consigné dans le tableau 7.
Tableau 7 : Mélange réactionnel pour la PCR de séquençage
Amplification
Après une pré-dénaturation à 96°C pendant 5 minutes, 25 cycles successifs sont entrepris, chaque cycle comprenant:
– Dénaturation à 96°C pendant 10 secondes.
– Hybridation à 55°C pendant 10 secondes.
– Elongation à 60°C pendant 4 minutes.
Purification des produits de séquençage
Afin d’éliminer tout matériel nucléique (amorce, ddNTP, dNTP) qui peut gêner la lecture de la séquence, une purification est réalisée selon le protocole suivant :
– Dans un tube eppendorf de 0.5 ml, déposer 10 μl de produit de séquence.
– Ajouter 90 μl de la solution Magnesil Green (fourni par la société Génome biotechnologie) contenant des billes fixant l’ADN.
– Mélanger à l’aide d’une micropipette, laisser agir durant 5 minutes puis re-mélanger.
– Transférer les tubes dans un portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes puis jeter le surnageant.
– Récupérer les tubes du portoir magnétique et ajouter 100 μl d’éthanol 90%.
– Mélanger à l’aide d’une micropipette, laisser agir durant 5 minutes puis re-mélanger.
– Transférer les tubes dans le portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes puis jeter le surnageant.
– Récupérer les tubes du portoir magnétique puis répéter l’étape de lavage avec l’éthanol 90% une deuxième fois. Ensuite, les tubes sont séchés 5 à 10 minutes à température ambiante.
– Resuspendre les particules dans 20 μl de Formamide, laisser agir 1 à 2 minutes puis remélanger.
– Transférer les tubes dans le portoir magnétique et mélanger jusqu’à l’adhésion totale des billes puis récupérer le surnageant contenant le Formamide et les produits de séquence dans de nouveaux tubes. Le séquençage peut ainsi être entamé.
Analyse informatique des séquences
La séquence ainsi obtenue par le séquençage est comparée à la banque de données. Après séquençage, les séquences du gène de l’ARNr 16S obtenues sont comparées à une base de données de séquences de ce même gène de différentes bactéries de référence. Le degré de parenté est alors déterminé en fonction des homologies de séquences. Cette comparaison est réalisée via le Centre National de l’Information pour la Biotechnologie (NCBI) en utilisant le programme BLAST
Dosage des sucres réducteurs par la méthode du DNS.
L’activité cellulase est mesurée via le réactif du DNS, par la méthode décrite par Miller (1969). Le dosage de l’activité cellulase est basé sur l’hydrolyse enzymatique des liaisons glycosidiques dans le carboxyméthyle cellulose (CMC).
Principe du dosage par le DNS
Le DNS (3,5-acide dinitrosalicylique) à chaud et en présence de sucres réducteurs développe un produit réduit de couleur rouge-brune l’acide 3-amino-5-nitrosalicylique.
La technique du DNS est un moyen de détermination de la teneur en sucres réducteurs libres présents dans les échantillons à doser.
Quant au dosage des sucres totaux, il faut d’abord procéder à une hydrolyse acide des polysaccharides (dans ce cas le saccharose) par l’acide sulfurique (H2SO4) pour qu’ils se transforment en monosaccharides réducteurs.
Préparation du réactif du DNS
Mettre 30 g de tartrate double de Na et K dans un flacon de 100ml, ajouter 1,6 g de NaOH.
Dissoudre complètement le mélange ( en chauffant doucement) dans 250 ml d’eau distillée.
Ajouter doucement 1 g de DNS. Couvrir avec du papier aluminium et attendre la dissolution du DNS. Laisser refroidir et compléter le volume à 100ml. Boucher hermétiquement et conserver à température ambiante et à l’abri de la lumière.
Préparation de la gamme d’étalonnage du glucose
La gamme étalon du glucose est établie avec une solution de glucose à des concentrations allant de 10-4 à 10-2 mol/l.
La concentration du glucose en solution est mesurée par le DNS, à une densité optique de 540 nm.
Conduite du dosage
Les souches actives sont mises en culture dans du LB liquide, après une nuit d’incubation (DO= 1,5), prélever un volume de 2 ml, puis centrifuger cette culture à 12000 RPM, pendant 20 minutes. Ensuite le culot est partagé entre un tube test et un tube témoin.
Le tube test contient 500 μl du surnageant et 500 μl du Substrat. Alors que le tube témoin est constitué de 500 μl du surnageant et 500 μl du tampon acétate de sodium (0,1 M pH 4,8).
Le zéro du spectrophotométre ou blanc contient 500 μl du tampon acétate de sodium (0,1 M pH 4,8) et 500 μl du Susbtrat ( CMC à 1%).
L’ensemble des tubes est incubé à 45°C pendant 30 minutes. Après incubation, on ajoute dans chaque tube 2 ml du réactif DNS . Par la suite porter, les tubes à ébullition pendant 5 min.
La densité optique est mesurée à une longueur d’onde 540nm. La différence entre la DO du tube test et du tube témoin pour chaque souche donne, par projection sur la courbe étalon, la concentration en glucose produit en mg/ml.
Effets des paramètres physico-chimiques sur l’activité enzymatique
Préparation du surnageant
Les isolats révélant une activité enzymatique sont cultivés dans un milieu LB liquide pendant 24 heures à 37°C, sous agitation et maintenant la culture en aération. La culture est ensuite centrifugée à 7000 rpm pendant 30 minutes, à 4°C. Ensuite, le surnageant est récupéré, après, on a effectué un lavage du culot avec le milieu de culture LB. Ensuite centrifuger 7000 rpm pendant 30 minutes. Regrouper les deux surnageants obtenus dans un seul flacon, puis filtrer le surnageant à travers une membrane filtrante ( 0,22 μm) en conditions stériles.
Effet de la température
La capacité des enzymes à résister à différentes températures est évaluée en procédant comme suit.
Tout d’abord, on a préparé un surnageant à partir d’une culture fraiche. Puis, le surnageant est réparti dans des tubes eppendorff. Chaque tube est incubé à une température déterminée (37°C, 55°C, 75°C,85°C, 95°C et 100°C) pendant 30 minutes. Ensuite, on a prélevé 50μl du surnageant, puis on a mis ce volume dans un puits sur milieu CMC-agar pour l’activité cellulase et sur milieu PGA-agar pour l’activité pectinase (par la mesure du diamètre des auréoles).
Effet de différentes concentrations d’urée
Une gamme de différentes concentrations d’urée allant de 1 mol/l à 8 mol/l est préparée afin d’évaluer l’influence de l’urée sur l’activité des enzymes présentes dans les surnageants des isolats bactériens étudiés. L’évaluation de l’activité cellulase est mise en évidence via le dépôt d’un volume de 50 μl du surnageant traité sur milieu CMC-agar et PGA-agar .
Effet du pH
Pour mettre en évidence l’influence du pH sur l’activité des enzymes cellulases, on a préparé des surnageants, puis leur pH est ajusté à différentes valeurs (1, 2 à 5, 7 et 10) . on a Laissé agir une heure, ensuite on a inoculé les boites CMC-agar et PGA-agar avec 50 μL de chaque surnageant.
Effet du SDS et β-mercaptoéthanol
Le SDS et le β-mercaptoéthanol, sont des dénturants des protéines. Pour évaluer leurs effets sur les enzymes étudiées, on a préparé des surnageants avec 1% SDS et 1% β-mercaptoéthanol.
Cette évaluation permet également de prévoir la nature des liaisons formant la structure de ces protéines.
|
Table des matières
Introduction
Revue bibliographque
I. Cellulases
1. Les enzymes et leur mode d’action
1.1. Endoglucanases
1.2. Exoglucanases
2. Substrat
3. Micro-organismes producteurs des cellulases
4. Production des enzymes cellulolytiques
5. Applications des cellulases dans différents domaines
5.1. Industrie du textile
5.2. Extraction de l’huile d’olive
5.3. Extraction des caroténoïdes
5.4. Industrie alimentaire
5.5. Industrie de l’alimentation animale
5.6. Industrie du papier
II. Pectinases
1. Substrat
2. Structure des substances pectiques
3. Enzymes pectinolytiques
3.1. Classification des enzymes pectinolytiques
3.1.1 Pectinestérases (PE) ou pectine-méthylestérases (PME).
3.1.2. Dépolymérases
3.2. Régulation des enzymes pectinolytiques
4. Applications biotechnologiques
4.1. Extraction des jus de fruit
4.2. Traitement du textile
4.3. Extraction des huiles
III. Effet des agents physico-chimiques sur l’activité enzymatique
1. Effet de la température
2. Effet de du pH
Matériel et méthodes
I. Matériel biologique
II. Criblage des souches productrices d’enzyme
1. Activité cellulase
1.1. Milieu de la révélation
1.2. Révélation de l’activité cellulase
2. Activité pectinase
2.1. Milieu de la révélation de l’activité pectinase
2.1. Révélation de l’activité pectinase
3. Estimation des activités enzymatiques
III. Identification biochimique
1. Test de coloration de Gram
2. Test amylase
3. Test de croissance sur milieu 6,5% NaCl
4. Test Clarck et Lubs
5. Test de Citrate et Simmons
4 . Coloration des spores
5. Formation d’acide à partir d’arabinose
6. Test mannitol
IV. Indentification moléculaire
1. Extraction de l’ADN
1.1. Préparation des solutions
1.2. Etapes de l’extraction
2. Amplification par PCR
2.1. Principe
2.2. Les conditions de la PCR
2.3. Révélation de l’ADN
2.4. Chargement des puits
3. Purification des produits PCR
3.1. Elimination du Triton-X
3.2. Elimination des amorces
4. Réaction de séquençage
5. Analyse informatique des séquences
V. Dosage des sucres réducteurs par la méthode du DNS
1. Principe du dosage par le DNS
2. Préparation du réactif du DNS
3. Préparation de la gamme d’étalonnage du glucose
4. Conduite du dosage
VI. Effets des paramètres physico-chimiques sur l’activité enzymatique
1. Préparation du surnageant
2. Effet de la température
3. Effet de différentes concentrations d’urée
4. Effet du pH
5. Effet du SDS et β-mercaptoéthanol
Résultats et discussion
I. Mise en évidence des souches productrices des enzymes
1. Criblage des souches productrices de cellulase
2. Criblage des souches productrices des pectinases
II. Identification des souches actives
1. Identification biochimique
2. Identification moléculaire
III. Effets des paramètres physico-chimiques sur l’activité des enzymes.
1. Effet de la température
1.1. Activité cellulase
1.2 Activité pectinase
2. Effet du pH
2.1. Activité cellulase
2.2. Activité pectinase
3. Effet de l’urée
3.1. Activité cellulase
3.2. Activité pectinase
4. Effet du SDS et du β-mercaptoéthanol
Discussion
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
Télécharger le rapport complet
