Soutenance mémoire
Organisation de la paroi végétale
Les cellules végétales possèdent à l’extérieur de leur membrane plasmique une enveloppe appelée paroi végétale, qui est impliquée dans le maintien de la plante et dans sa résistance à la déformation. Cette paroi est formée au cours du développement de la plante par le dépôt successif de plusieurs structures distinctes : la lamelle moyenne, la paroi primaire, et la paroi secondaire, constituée de trois couches . La lamelle moyenne, constituée de pectines et d’hémicelluloses, est située à l’interface entre deux cellules adjacentes. La paroi primaire, qui se forme durant la croissance de toutes les cellules végétales, contient des micro-fibrilles de cellulose emprisonnées dans une matrice de pectines et d’hémicelluloses, accompagnées de protéines (Figure 2B). Lorsqu’elles ont fini de croître, certaines cellules spécialisées développent une paroi secondaire (Figure 2C), où les micro-fibrilles de celluloses sont liées à des chaînes d’hémicelluloses et à des lignines par des interactions covalentes et non-covalentes (liaisons hydrogènes et forces de van der Waals) ; les couches S1, S2 et S3 qui composent la paroi secondaire diffèrent par l’orientation de leurs fibres de cellulose (Davin et al., 2008). La dernière étape de maturation de certains végétaux est celle de la lignification, au cours de laquelle la lignine remplace peu à peu l’eau qui se trouvait dans les tissus, en commençant au niveau de la lamelle moyenne, jusqu’à la paroi primaire puis la paroi secondaire, formant ainsi une matrice hydrophobe dans laquelle sont emprisonnés les composants cellulosiques et non-cellulosiques ainsi que les protéines (Iiyama et al., 1994). La lignocellulose qui compose la paroi végétale est donc un enchevêtrement de différents composants, dont des polysaccharides (cellulose, hémicelluloses et pectines) et des polymères phénoliques (lignines), qui sont décrits plus précisément dans les paragraphes suivants.
La cellulose
La cellulose est le biopolymère le plus abondant sur Terre, et le composé principal de la paroi végétale. Elle est produite non seulement par les plantes, mais aussi par certains animaux marins, les tuniciers, ainsi que par des algues, des champignons, des bactéries et des invertébrés (Lavoine et al., 2012). Il s’agit d’un homopolymère linéaire de résidus anhydro-D-glucose, reliés entre eux par des liaisons glycosidiques de type β-(1→4), ce qui le différencie de l’amidon où les résidus D-glucose sont liés en α-(1→4). Chaque monomère effectuant une rotation de 180° par rapport à ses voisins, l’unité de répétition de ce polymère est un dimère appelé cellobiose. Chaque chaîne de cellulose possède une extrémité réductrice, porteuse d’un hémiacétal sur le carbone anomérique (C1) du résidu de glucose, et une extrémité appelée non-réductrice, porteuse d’une fonction hydroxyle (voir Figure 3A). Le degré de polymérisation d’une chaîne de cellulose peut aller d’environ 8000 dans la paroi primaire jusqu’à plus de 20000 dans la paroi secondaire (Brown, 2004; Habibi et al., 2010). Dans la nature, les chaînes de cellulose sont assemblées entre elles pour former un ensemble hautement ordonné : approximativement 36 chaînes de cellulose sont assemblées en fibrilles élémentaires, qui elles mêmes se regroupent en micro-fibrilles, qui s’associent aux autres composants de la paroi pour former des fibres cellulosiques (Figure 3B). Les fibrilles élémentaires sont composées de régions cristallines, où les chaines sont étroitement liées entre elles par des forces de van der Waals et un réseau complexe de liaisons hydrogène inter- et intramoléculaires ; ces régions hautement ordonnées sont interrompues par des régions amorphes, probablement introduites par des tensions internes dans les fibrilles qui provoquent leur distorsion (Habibi et al., 2010).
Les hémicelluloses
Les hémicelluloses constituent un groupe hétérogène de polysaccharides complexes, souvent ramifiés, dont la chaîne principale est composée de xylose, de glucose et/ou de mannose, et qui peuvent porter des substitutions très diverses : hexoses (glucose, mannose, galactose, fucose), pentoses (xylose, arabinose), acides uroniques (acide glucuronique). La composition des hémicelluloses varie énormément selon les groupes de plantes et les types de cellules. On peut les classer en différents groupes qui sont représentés sur la Figure 5 :
– les xyloglucanes, les plus répandus, sont constitués d’une chaîne de glucose portant des unités xylose, elles-mêmes pouvant être substituées par plusieurs unités galactose, arabinose ou fucose ;
– les glucanes mixtes sont des polymères linéaires liés en β-(1→4), avec quelques liaisons β-(1→3) ;
– les xylanes possèdent une chaîne principale composée de résidus xylose, et peuvent porter différentes substitutions notamment composées d’acide glucuronique (qui peuvent être liés à la lignine lorsqu’ils sont méthylés) et d’arabinose (parfois estérifié par de l’acide férulique) ;
– les mannanes et les glucomannanes comportent des unités mannose liées en β-(1→4) dans leur chaîne principale, parfois alternés avec des unités glucose, et sont substitués ou non par des résidus galactose (galactomannane et galactoglucomannane).
Sources de biomasse lignocellulosique
L’appellation de « biomasse lignocellulosique » est utilisée pour désigner toute matière végétale contenant principalement de la lignocellulose. Cette appellation très large recouvre donc un grand nombre de produits, qui peuvent avoir différentes origines :
– résidus agricoles produits lors de la culture de différentes plantes destinées à l’alimentation ;
– déchets forestiers de bois dur ou de bois tendre, issus de l’industrie du bois ou des pâtes et papiers ;
– plantes énergétiques issues de cultures dédiées (herbes vivaces et taillis à courte rotation) ;
– déchets solides municipaux et industriels.
Des exemples de chacune de ces sources de biomasse sont présentés dans le Tableau 1. La plupart de ces matières sont considérées comme des déchets ou des sous-produits d’autres industries, et sont donc facilement disponibles, en très grandes quantités, sans accaparer de terres cultivables supplémentaires. Certains de ces sous-produits peuvent être utilisés comme source de chaleur et d’énergie, comme fourrage ou répandus dans les champs pour les fertiliser, mais ils sont aussi parfois simplement jetés ou brûlés ; il apparaît donc avantageux d’en transformer une partie en produits à plus haute valeur ajoutée (Gupta and Verma, 2015;Talebnia et al., 2010). Seules les plantes énergétiques font l’objet d’une culture dédiée, et bien qu’elles ne soient pas utilisées dans l’alimentation ou la production de fibres, elles pourraient être en compétition pour l’usage des terres. Cependant, leur capacité à pousser rapidement sur divers types de terrains, avec des besoins en eau limités ou une bonne tolérance aux basses températures, pourraient permettre leur exploitation sur des terres non-agricoles (García et al., 2014; Ho et al., 2014).
Principes de la classification CAZy
Les polysaccharides pariétaux précédemment cités, mais aussi tous les autres polysaccharides, notamment l’amidon (un polymère de glucose lié en α-1,4 trouvé dans les organes de réserve de nombreuses plantes) et la chitine (un polymère de N-acétyl glucosamine qui forme la carapace des insectes et crustacés et se trouve également dans la paroi fongique), ainsi que tous les glycanes et tous les sucres, sont regroupés sous le terme de carbohydrates. Les carbohydrates font partie des quatre principales classes de biomolécules, avec les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Il s’agit d’une classe de substrats extrêmement divers, étant donné le nombre de monosaccharides existants, les différentes manières dont ils peuvent s’assembler, et la variété des autres molécules auxquelles ils peuvent se lier (Lombard et al., 2014). Les organismes vivants, pour s’adapter à leur environnement, ont donc développé un panel d’enzymes actives sur ces carbohydrates (Carbohydrate-Active enZymes, ou CAZymes), qui contrôlent leur assemblage, leur modification et leur dégradation, et possèdent une très grande diversité de structures et de spécificités. Afin de faciliter la gestion d’une telle diversité, une classification des CAZymes, basée sur les différences structurelles plutôt que sur les seules spécificités de substrats, a été mise en place (Cantarel et al., 2009; Henrissat, 1991). Mise en ligne sous la forme d’une base de donnée depuis 1999 (www.cazy.org), et basée sur les similarités de séquences d’acides aminés et de structures secondaires, elle permet d’affecter une séquence de protéine de fonction inconnue à une famille comportant au moins une protéine caractérisée expérimentalement, permettant de faire dans certains cas une prédiction du type de substrats sur lesquels elle pourrait être active, ou sur son mécanisme. Elle prend également en compte le caractère modulaire de beaucoup de CAZymes, qui peuvent regrouper plusieurs modules catalytiques et non-catalytiques issus de familles différentes (Lombard et al., 2014). Cette base de donnée est complétée par une encyclopédie en ligne créée en 2007 appelée CAZypedia (www.cazypedia.org), qui rassemble des informations détaillées sur 170 familles de CAZymes et de modules associés, chaque famille faisant l’objet d’une page comportant un résumé des résultats les plus importants la concernant (Brumer et al., 2018). Sans cesse alimentée par de nouvelles séquences, la base de donnée CAZy comporte 435 familles de modules (au 1er janvier 2020), appartenant aux classes suivantes (Cantarel et al., 2009; Levasseur et al., 2013) :
– les glycoside hydrolases (GH), qui sont les plus représentées avec 165 familles, sont capables d’hydrolyser les liaisons glycosidiques et de réaliser des réactions de transglycosylation ;
– les glycosyl-transférases (GT) sont responsables de la formation de liaisons glycosidiques ;
– les polysaccharides lyases (PL) clivent elles aussi les liaisons glycosidiques (dans les polysaccharides contenant des acides uroniques) mais en utilisant un mécanisme de β-élimination ;
– les carbohydrate estérases (CE) permettent de cliver les O- et N-acylations des sucres estérifiés, facilitant ainsi l’accès des glycosyl-hydrolases aux polysaccharides ;
– les activités auxiliaires (AA) regroupent des enzymes oxydoréductrices qui agissent en synergie avec les autres CAZymes, avec d’une part des enzymes lignolytiques, qui améliorent l’accessibilité aux polysaccharides en dégradant la lignine environnante, et d’autre part des enzymes capables d’oxyder les sucres et les polysaccharides ;
– les modules de liaison aux carbohydrates (CBM) sont des modules non-catalytiques qui facilitent l’activité enzymatique des modules catalytiques associés en améliorant les interactions avec un substrat donné.Parmi ces familles, certaines enzymes sont plus particulièrement liées à la dégradation de la cellulose et à l’amélioration de son accessibilité, et donc particulièrement intéressantes pour la production de bioéthanol.
Utilisation des LPMO dans les cocktails cellulolytiques
Dès leur découverte, les LPMO ont éveillé l’attention par leurs possibles applications industrielles dans le domaine des biotechnologies ; en effet, les premiers découvertes concernant ces enzymes sont apparues dans des brevets industriels avant d’être publiées dans des journaux scientifiques, et elles ont rapidement été intégrées aux cocktails cellulolytiques commerciaux (Brown et al., 2008; Dotson et al., 2005; Harris et al., 2010; Johansen, 2016). Contrairement aux EG et aux CBH qui agissent sur des chaînes de cellulose isolées, les LPMO peuvent se fixer à la surface de la cellulose cristalline (Eibinger et al., 2014). Elles sont ainsi capables d’introduire des ruptures de chaînes dans des régions récalcitrantes, ce qui fragilise mécaniquement la structure des fibres de cellulose (Villares et al., 2017), et créé de nouveaux points d’attaques pour les hydrolases, ce qui améliore leur efficacité (voir Figure 19). Cette synergie se traduit par une importante amélioration de la saccharification de substrats lignocellulosiques industriels variés, tels que la paille de blé, la rafle de maïs, la bagasse de canne à sucre, le pin, le peuplier, le bouleau ou l’épicéa (Hemsworth et al., 2015; Karnaouri et al., 2017; Müller et al., 2018). Cependant, l’utilisation de LPMO dans des procédés industriels nécessite de repenser ces derniers et de les adapter pour tenir compte des conditions bénéfiques à l’activité des LPMO, notamment la présence de partenaires redox adaptés, ainsi que l’apport suffisant et contrôlé d’oxygène ou de peroxyde d’hydrogène (Müller et al., 2015; Müller et al., 2018).
Caractérisation de trois nouvelles LPMO de la famille AA16
Suite à la caractérisation d’une première protéine ayant entraîné la création de la famille AA16 dans la base de données CAZy, il était nécessaire de poursuivre les travaux sur cette famille afin de mieux comprendre son activité. Pour cela, trois nouvelles cibles ont été sélectionnées. La première cible (appelée AjAA16) est la protéine AA16 issue d’Aspergillus japonicus BRFM 405 ; elle possède une séquence assez proche de celle d’AaAA16, issue d’A. aculeatus, mais représente potentiellement mieux la protéine présente dans les sécrétomes d’A. japonicus étudiés dans la première partie du projet. Les deux autres cibles sélectionnées (appelées ApAA16-CBM1 et PfAA16A-CBM1) sont issues d’Aureobasidium pullulans et de Pestalotiopsis fici, et comportent toutes les deux, en plus du module catalytique AA16, un module de liaison à la cellulose (CBM1). Ces trois cibles ont été produites de manière recombinante chez Pichia pastoris en bioréacteur. Bien que leur caractérisation après purification ait révélé que l’histidine N-terminale impliquée dans le site actif n’était pas toujours intacte, ces trois protéines ont montré une activité de dégradation de la cellulose semblable à celle d’AaAA16, et même supérieure dans le cas d’AjAA16. Les trois nouvelles AA16, tout comme AaAA16, sont capables d’améliorer l’hydrolyse de cellulose par la CBHI de T. reesei lorsqu’elles sont utilisées pour prétraiter le substrat, et là encore AjAA16 est la plus performante. Cependant, ces quatre enzymes ont toujours un profil de produits solubles composé de très peu de produits oxydés, et ce phénomène reste inexpliqué. Les différents donneurs d’électrons testés n’ont pas permis la libération de produits oxydés supplémentaires. Afin d’avoir des informations sur la configuration du cuivre dans l’histidine brace, des expériences de spectroscopie par résonnance paramagnétique électronique ont été réalisées. Les spectres confirment la présence de cuivre (II) dans le site actif, dans une symétrie de coordination axiale, avec des paramètres semblables à ceux déjà observés pour les autres familles de LPMO. Les expériences en présence de réducteur n’ont cependant pas montré de diminution du signal, ce qui aurait dû se produire si le cuivre (II) était correctement réduit en cuivre (I). L’une des pistes pour expliquer la faible production de produits oxydés pourrait donc être liée à l’état redox des AA16, et la RPE serait un bon moyen d’apporter des réponses aux questions qui se posent à ce propos.D’autres informations essentielles sur la famille AA16 pourraient être déduites de la résolution de leur structure tridimensionnelle. Les cristaux testés n’ayant pas pour l’instant permis de collecter des données de diffraction, les structures 3D des quatre protéines étudiées ont été modélisées par homologie avec des protéines de séquences proches. Ces modèles révèlent une structure typique des LPMO, présentant des caractéristiques retrouvées dans les autres familles, notamment concernant les résidus proches du site actif
|
Table des matières
INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1 De la biomasse lignocellulosique au bioéthanol
1.1 Structure et composition de la lignocellulose
1.1.1 Organisation de la paroi végétale
1.1.2 La cellulose
1.1.3 Les hémicelluloses
1.1.4 Les pectines
1.1.5 Les lignines
1.2 Utilisation de biomasse lignocellulosique pour la bioraffinerie
1.2.1 Sources de biomasse lignocellulosique
1.2.2 Concept de la bioraffinerie lignocellulosique
1.3 Procédés de production de bioéthanol
2 Enzymes impliquées dans la dégradation des polysaccharides
2.1 Principes de la classification CAZy
2.2 Les cellulases
2.3 Les hémicellulases
2.4 Les LPMO
2.4.1 Découverte de leur activité
2.4.2 Classification actuelle
2.4.3 Structure tridimensionnelle des LPMO
2.4.4 Mécanismes proposés
2.4.5 Partenaires redox
2.4.6 Utilisation des LPMO dans les cocktails cellulolytiques
3 Utilisation de sécrétomes fongiques pour l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique
3.1 Classifications et modes de vie des champignons
3.2 Utilisation du sécrétome de Trichoderma reesei
3.2.1 Système cellulolytique de Trichoderma reesei
3.2.2 Etudes transcriptomiques et protéomiques
3.2.3 Ingénierie génétique des souches
3.2.4 Amélioration des enzymes
3.2.5 Mise en œuvre de l’hydrolyse enzymatique
3.3 Stratégies de supplémentation
3.3.1 Limitations du sécrétome de T. reesei
3.3.2 La biodiversité fongique comme source d’inspiration
3.3.3 Supplémentation par des sécrétomes fongiques
4 Enjeux et stratégie du projet de recherche
CHAPITRE II : MATÉRIEL ET MÉTHODES
1 Préparation des sécrétomes
1.1 Souches fongiques
1.2 Milieux de culture
1.3 Culture et récolte des sécrétomes
2 Tests de saccharification en supplémentation
2.1 Substrats utilisés
2.2 Cocktail enzymatique de référence
2.3 Tests de saccharification en tubes
2.4 Tests de saccharification en microplaques
2.5 Quantification des produits et calcul des rendements
3 Analyse du contenu protéique des sécrétomes
3.1 Identification des protéines par LC-MS/MS
3.2 Analyse des données
4 Analyse bioinformatique
5 Production de protéines recombinantes
5.1 Construction et transformation des vecteurs d’expression
5.2 Production des protéines
5.2.1 Milieux de culture
5.2.2 Production en plaques Deepwell
5.2.3 Production en fioles
5.2.4 Production en bioréacteurs
5.3 Purification des protéines
5.3.1 Purification par chromatographie d’affinité
5.3.2 Purification par chromatographie d’échange d’anions
5.4 Caractérisation biochimique des protéines produites
5.4.1 Analyse ICP-MS
5.4.2 Séquençage N-terminal
5.4.3 Analyse de masse globale
5.4.4 Tests Amplex Red
6 Caractérisation de l’activité des LPMO
6.1 Substrats utilisés
6.2 Tests de dégradation de substrats
6.3 Tests de synergies sur cellulose
6.4 Analyse des produits solubles de dégradation
6.4.1 HPAEC-PAD
6.4.2 Spectrométrie de masse
6.5 Spectroscopie du site actif
6.6 Modélisation des structures 3D par homologie
CHAPITRE III : IDENTIFICATION D’UNE NOUVELLE FAMILLE DE LPMO DANS DES SÉCRÉTOMES FONGIQUES
1 Résumé
2 Background
3 Results
3.1 Exploration of fungal secretomes to improve biomass saccharification
3.2 Comparative proteomic analysis of fungal secretomes
3.3 Bioinformatic analysis of a new LPMO family
3.4 Heterologous expression and purification
3.5 Substrate specificity and regioselectivity of cleavage
3.6 Synergy assays
4 Discussion
5 Conclusions
CHAPITRE IV : CARACTÉRISATION DE TROIS NOUVELLES LPMO DE LA FAMILLE AA16
1 Résumé
2 Background
3 Results and discussion
3.1 Selection and production of three novel AA16 enzymes
3.2 Activity of AA16 enzymes on cellulose
3.3 Redox partners
3.4 Synergy assays
3.5 Spectroscopic analysis of the active site
3.6 Structural data
4 Conclusions
CHAPITRE V : DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS
1 Discussion générale
1.1 Exploration des sécrétomes et choix des cibles enzymatiques
1.2 Production et purification des LPMO AA16
1.3 Particularités de l’activité des AA16
2 Conclusions et perspectives
ANNEXES
Télécharger le rapport complet
