Soutenance mémoire
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Premières observations
Lorsque l’on observe la locomotion de C. elegans sur une boîte de Petri NGM-Agar recouverte uniformément de bactéries E. coli OP50, on peut discerner deux modes d’activité du ver (voir 3.3, [Fujiwara et al., 2002]). On observe d’une part des phases de mouvement sinusoïdal rapide et dirigé durant lesquelles le ver peut parcourir de grandes distances (cm), et d’autre part desphases de faible mobilité durant lesquelles le ver eectue de nombreux aller-retours et possède au nal un déplacement moyen quasi nul (Figure 4.1). La phase active a été appelée phase de « roaming » par Fujiwara et al alors que la phase inactive a été nommée « dwelling ». Durant la phase de dwelling, le ver semble se nourrir, il n’est pas immobile, eectue de nombreux mouvements saccadés de la tête et aucune phase de quiescence n’est observable. Aux sites de dwelling on observe généralement également la présence d’oeufs.
Ce comportement semble donc être couplé avec d’autres comportements fondamentaux pour l’animal (prise de nourriture, ponte). Fujiwara et al ont par ailleurs montré que ce comportement biphasique était régulé par la perception sensorielle de l’animal [Fujiwara et al., 2002].
Méthode d’analyse quantitative
La vitesse semble être un des paramètres de la trajectoire déterminant pour pouvoir quanti er la proportion de temps passé dans chaque phase d’activité. J’ai donc calculé pour chaque trajectoire la vitesse du ver en fonction du temps (Figure 4.4). Bien que la distribution des vitesses paraisse bimodale, il est dicile de dénir un critère permettant de discriminer les deux phases dans ces conditions en utilisant uniquement la mesure de vitesse (voir l’histogramme Figure 4.4). J’ai donc choisi d’utiliser deux paramètres du mouvement pour discriminer les deux phases d’activité : la vitesse et un paramètre représentatif du taux de réorientation. 30 4. Analyse du comportement de C. elegans en présence de nourriture.
En eet, dans la phase de dwelling, le ver possède une vitesse faible et un fort taux de réorientation alors que dans la phase de roaming, le ver a une vitesse élevée et se réoriente très peu. J’ai ainsi déni le paramètre de courbure Theta comme la variation d’angle entre 3 points successifs de la trajectoire, donc 3 positions successives du centre de masse du ver (Figure 4.5). Ce paramètre représente bien la réorientation du ver au cours de son mouvement. Si à un instant t le ver eectue un demi-tour, Theta(t) sera égal à 180, si au contraire il se déplace en ligne droite, Theta(t) sera égal à zéro. L’histogramme du paramètre de réorientation Theta laisse clairement apparaître deux pics correspondant aux deux phases d’activité du ver (Figure 4.5).
Comportement du ver sauvage en conditions standard
On obtient le pourcentage de temps passé dans la phase de roaming Pr par la méthode pré- cédente appliquée aux diérents enregistrements eectués pour la souche sauvage N2 dans les conditions standard (boite NGM recouverte de bactéries OP50 en grande quantité, 20C).
Pour le système mono-ver : Pr = 19 2% (107h de suivi, 50 vers).
Pour le système multi-vers : Pr = 21 2% (88h de suivi, 40 vers).
Pour le ver sauvage, les résultats obtenus par les deux méthodes de suivi sont donc cohérents et les deux systèmes peuvent donc être utilisés indiéremment. Les résultats sont également cohérents avec les mesures des études précédentes [Fujiwara et al., 2002]. Bien qu’il soit dans des conditions quasi optimales (grande quantité de nourriture, température adéquate, etc…), il faut noter que C. elegans attribue tout de même une proportion non négligeable de son temps à l’exploration de son environnement.
Par ailleurs on peut également analyser plus précisément la distribution des intervalles de temps passé dans chaque phase d’activité (Figures 4.8, 4.9). En supposant une décroissance exponentielle de la distribution en exp (t= ), on observe un temps caractéristique de l’ordre de 300s pour les phases de dwelling et de 60s pour les phases de roaming pour le ver sauvage en conditions standard.
Inuence de la concentration en nourriture
En présence d’une grande quantité de bactéries OP50 (en conditions standard), C. elegans passe 20% de son temps dans la phase active et 80% dans la phase inactive. Au contraire, en absence de bactéries, la phase de dwelling n’est pas observée et le ver est constamment actif. On observe ainsi une phase inactive en présence de bactéries qui semble inexistante en l’absence de nourriture. On peut donc se demander quelle concentration de bactéries est nécessaire pour initier ce comportement, et si celui-ci est modulé par la concentration en bactéries de l’environnement. J’ai donc mesuré la proportion du temps passé en phase de roaming de vers sauvages pour une large gamme de concentrations en bactéries.
Pour cela, il est nécessaire d’enregistrer la trajectoire de vers N2 sur des boites NGM ensemenc ées avec une quantité contrôlée de bactéries qui ne varie pas dans le temps. J’ai utilisé des bactéries traitées à la streptomycine, un antibiotique de la famille des aminosides qui bloque la traduction en se xant sur les ribosomes. La concentration de streptomycine utilisée ici (50g/ml) bloque la multiplication des bactéries mais ne les lysent pas. Les bactéries traitées sont ensuite comptées et étalées sur des boîtes NGM-streptomycine. On obtient ainsi des boîtes NGM recou36
Effets des conditions environnementales et de l’expérience de l’animal
vertes d’une concentration contrôlée de bactéries (de 0 à 108 bactéries par cm2, voir Annexe A). La mesure de la proportion du temps passé en phase de roaming pour des vers de la souche N2 sur ces boites à 20C donne les résultats suivants (Figure 5.1).
Eet de l’expérience alimentaire antérieure de l’animal
Après une période de famine, C. elegans ralentit fortement lorsqu’il retrouve une zone de nourriture (voir 3.2.1, [Sawin et al., 2000]) et ce comportement est contrôlé par la sérotonine.
L’expérience alimentaire passée du ver peut donc moduler son comportement en présence de nourriture.
Pour mesurer le rôle de l’état de satiété de C. elegans sur l’alternance des phases d’activité, j’ai enregistré la trajectoire de vers sauvages N2 en présence de bactéries après une période d’une heure sans nourriture. Les vers sont donc aamés pendant une heure sur une boîte NGM sans bactéries puis transférés juste avant l’enregistrement sur une boite NGM contenant des bactéries OP50. Les vers aamés sont suivis à 20C pendant une heure seulement. En eet, comme leur état de satiété évolue au cours de l’expérience, les vers commencent à perdre la « mémoire » de la période de famine au bout d’une durée de l’ordre de l’heure.
On observe que C. elegans divise par deux la probabilité d’être dans la phase active s’il a vécu une période de famine dans son passé récent (Figure 5.2).
Pr(N2 aamés) = 10 2% (34h de suivi, 30 vers).
Pr(N2 bien nourris) = 21 2% (88h de suivi, 40 vers).
Corrélation avec le comportement de ponte
Il est surprenant que C. elegans consacre 20% de son temps à des déplacements rapides possiblement couteux en énergie alors qu’il se trouve en environnement très favorable (grande 40 5. Effets des conditions environnementales et de l’expérience de l’animal quantité de nourriture, température physiologique). Une des hypothèses pourrait reposer sur l’intérêt du ver à répartir ses oeufs à diérents endroits pour que ses descendants ne soient pas en compétition.
C. elegans pond des oeufs par clusters. Il alterne des périodes d’à peu près 20 minutes pendant lesquelles il ne pond pas et des périodes durant lesquelles il pond des oeufs avec une constante de temps courte de l’ordre de 20s entre deux oeufs [Waggoner et al., 1998]. Il a été montré par ailleurs qu’une accélération précédait chaque évènement de ponte [Hardaker et al., 2001]. La ponte et le comportement locomoteur semblent donc liés. Avec le système de tracking monover il est possible de mesurer à quels moments ont lieu les évènements de ponte par rapport à l’alternance des deux phases. J’ai observé qualitativement que les événements de ponte coïncident avec la n des périodes de roaming. Le circuit neuronal de la ponte pourrait donc avoir un rôle dans le contrôle de l’alternance des phases de roaming et de dwelling.
Pour tester cette hypothèse, j’ai enregistré la trajectoire de mutants egl-1(n487). La mutation egl-1(n487) entraîne un dysfonctionnement des neurones HSN qui contrôlent la ponte. Ces vers ont un pattern temporel de ponte très perturbé et sont anormalement remplis d’oeufs (phénotype Egl) [Desai et al., 1988]. On observe cependant que la proportion de temps passée en phase de course n’est pas signicativement diérente du ver sauvage.
Pr(egl-1(n487), 20C) = 16 4% (30h de suivi, 20 vers).
Il semble donc que le pattern temporel de ponte n’inuence pas signicativement la proportion de temps passée dans chaque phase d’activité locomotrice.
Importance de l’état de fécondation de l’animal
Il est possible également que la probabilité de se déplacer dans un environnement donné dépende du besoin de trouver un partenaire reproducteur. C. elegans est hermaphrodite et n’a donc pas besoin de trouver un partenaire. On observe cependant que les mâles de C. elegans, qui doivent trouver un individu hermaphrodite pour se reproduire, sont bien plus mobiles que les hermaphrodites. La probabilité de quitter un patch de bactéries est notamment bien plus élevée pour un mâle que pour un hermaphrodite [Lipton et al., 2004].
Pour tester l’importance de la reproduction sur l’alternance des phases de courses et d’arrêts, j’ai enregistré la trajectoire de femelles de l’espèce Caenorhabditis remanei phylogénétiquement proche de Caenorhabditis elegans à 20C en présence de bactéries. Les femelles C. remanei doivent en eet trouver un partenaire mâle pour se reproduire (voir 1.2). On observe que les femelles C. remanei fécondées ont un comportement similaire à celui des hermaphrodites C. elegans (Figure 5.3). A l’inverse, les femelles C. remanei isolées la veille de l’expérience au stade larvaire L4 sans mâles ne sont pas fécondées et sont beaucoup plus mobiles. La proportion du temps passé en phase de roaming pour ces femelles vierges est multipliée par 2 par rapport aux femelles fécondées (Figure 5.3, Table 5.3). Il semble donc bien que l’état de fécondation de l’animal module l’alternance des deux phases d’activité.
Comportement des mutants du développement ou du fonctionnement des neurones des amphides
La perception olfactive et gustative de la présence de bactéries n’est donc pas susante pour induire le comportement de dwelling. Il a cependant été montré que l’information sensorielle perçue par les amphides du ver est nécessaire pour réguler l’alternance des phases d’activité de C. elegans [Fujiwara et al., 2002]. En eet les mutants che-2(e1033), osm-6(p811) et che-3(e1124) chez qui la structure des cils des neurones des amphides est défectueuse passent beaucoup plus de temps dans la phase de dwelling que le ver sauvage. De plus, l’expression de l’allèle sauvage de che- 2 sous le contrôle des promoteurs gpa-3 et tax-4 chez le mutant che-2(e1033) est susante pour supprimer l’eet de la mutation [Fujiwara et al., 2002]. Les gènes gpa-3 et tax-4 sont exprimés dans les neurones des amphides AWC, ASE, ASK, ASI, ASJ et AFD notamment et un sousensemble de ces neurones doit donc participer au contrôle du comportement biphasique du ver.
De plus, Shtonda et Avery ont montré que l’interneurone AIY et le neurone sensoriel ASI était importants pour réguler ce comportement, et que notamment AIY était nécessaire pour allonger les périodes de roaming [Shtonda and Avery, 2006].
Pour étudier le rôle de la perception sensorielle, j’ai tout d’abord quantié le comportement du mutant che-2(e1033) en conditions standard. Ces mesures montrent une absence quasi-totale de la phase de roaming pour ce mutant. La perception sensorielle semble bien être nécessaire pour induire la phase de roaming en présence de nourriture.
Pr(che-2(e1033), 20C) = 1:3 0:3% (30h de suivi, 20 vers).
Pr(che-2(e1033), aztreonam, 20C) = 42:5 8% (20h de suivi, 30 vers).
J’ai ensuite quantié le comportement du mutant che-2(e1033) en présence de bactéries traitées à l’aztreonam. Dans ces conditions le mutant che-2 passe 42% du temps dans la phase de roaming. On observe donc que les mutants ayant une perception sensorielle altérée sont d’une part capables de percevoir la présence de bactéries nutritives et n’ont par ailleurs pas de défauts locomoteurs basiques. Le phénotype de ce mutant est donc lié au contrôle de l’alternance des phases d’activité et non à un défaut de mobilité. Ceci dit, le comportement du mutant che-2 est tout de même signicativement diérent du ver sauvage même en présence de bactéries non nutritives. Il semble donc que la perception sensorielle soit nécessaire pour induire la phase de roaming en présence et en absence de bactéries nutritives.
Modulation par les voies de signalisation de l’insuline et des TGF-beta
Les voies de signalisation de l’insuline et des TGF-beta sont impliquées dans le choix du passage au stade larvaire Dauer en conditions défavorables, notamment en absence de nourriture prolongée (voir 2.1.4, 3.1.2). Elles sont par ailleurs importantes dans la régulation du métabolisme du ver et sont liées à la signalisation de la présence de nourriture.
Figure 6.4 Implication des voies de signalisation insuline et TGF-beta dans le contrôle du comportement de dwelling/roaming. Les résultats sont présentés comme la moyenne l’erreur standard. *Diérent du ver sauvage, t-test du Student p<0.001. **Diérents entre eux p<0.001. 50 6. Modes de perception et voies de signalisation impliquées.
Pour mesurer l’importance de ces voies de signalisation dans le contrôle du comportement de dwelling/roaming, j’ai analysé la trajectoire de mutants du récepteur DAF-2 de l’insuline et du gène DAF-7 codant pour le peptide TGF-beta impliqué dans le contrôle du passage au stade Dauer. On observe que diérents mutants des gènes daf-2 et daf-7 passent signicativement moins de temps dans la phase de roaming que le ver sauvage (voir Figure 6.4, Table 6.2). Il est intéressant de noter que ce défaut de comportement de daf-2 augmente de l’allèle m41 à l’allèle e1391, l’allèle e1370 ayant un phénotype intermédiaire. Cet ordre correspond bien à l’importance de la perte de fonction du gène daf-2 mesurée par d’autres méthodes pour ces allèles [Gems et al., 1998].
Le récepteur DAF-2 est exprimé dans de nombreux types cellulaires et est très pléiotropique. Il agit essentiellement par la voie transcriptionnelle inhibant la localisation du facteur de transcription DAF-16 dans le noyau. Lorsque DAF-2 est inactif, DAF-16 se localise dans le noyau et entraîne la transcription de nombreux gènes eecteurs. Pour vérier que l’eet observé est bien dépendant de la voie transcriptionnelle DAF-2/DAF-16, j’ai donc quantié le comportement de mutants daf-16 et de double mutants daf-2/daf-16. On observe que le défaut du mutant daf-2 disparaît quand daf-16 est muté également. Par ailleurs, le mutant daf-16 a un phénotype sauvage pour ce comportement. L’alternance des phases d’activité de C. elegans est donc contrôlée par la voie de signalisation DAF-2/DAF-16.
Corrélation de l’activité calcique des neurones AVA et du comportement de C. elegans
De nombreux résultats antérieurs indiquent donc que les neurones de commande AVA contrôlent le comportement de recul du ver. Cependant, il n’existe pas d’enregistrement direct de l’activité de ces neurones au cours du comportement libre de C. elegans. En utilisant le système développé ici, j’ai donc enregistré l’activité calcique des neurones AVA au cours du mouvement de vers se déplaçant librement sur une boite NGM standard recouverte de bactéries durant une dizaine de minutes. Pour cela, j’ai utilisé la souche AQ2139 construite au laboratoire de WR Schafer et exprimant la protéine caméléon D3cpv essentiellement dans les neurones AVA sous le contrôle du promoteur pnmr-1. Cette souche possède également la mutation lite-1 et est donc peu sensible à la lumière bleue d’excitation de uorescence.
D3cpv exprimée dans les neurones AVA au cours du mouvement d’un ver libre (bleu foncé) et évènements de recul du ver (bleu clair). (B) Variations de uorescence réciproques dans les canaux d’émission de uorescence à 485nm (bleu) et à 535nm (vert).
On observe la présence de signaux d’activité calcique des neurones AVA lors du mouvement du ver. Ces signaux reètent eectivement l’activité neuronale et ne sont pas des artefacts liés au mouvement du ver. En eet, on peut observer l’inversion des signaux de uorescence dans les deux canaux d’enregistrement à 535nm et à 485nm caractéristique du transfert de uorescence (Figure 8.3). Pour corréler l’activité des neurones AVA au comportement du ver, j’ai relevé en aveugle à partir du lm en transmission du comportement du ver la position temporelle des événements de recul. J’ai considéré qu’un ver recule quand sa tête recule par rapport à l’orientation dénie par le corps de l’animal. Deux images sont donc susantes pour dénir le recul et la durée des évènements de recul est donc dénie avec une résolution de 150ms (une image). Les oméga-turns et les phases d’arret ne sont par ailleurs pas comptées comme évènements de recul. J’ai ainsi pu montrer que les mouvements de reculs spontanés de C. elegans lors de son déplacement sur une boite standard étaient extrêmement bien corrélés aux signaux d’activité calcique dans les neurones AVA (15 vers, 200 évènements de recul, Figures 8.3, 8.5).
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Table des matières
I Eléments de neurobiologie du nématode Caenorhabditis elegans
1 Le nématode C. elegans : Généralités
1.1 Choix du modèle
1.2 Ecologie et phylogénie
1.3 Cycle de vie
2 Système nerveux de C. elegans
2.1 Structure du réseau de neurones de C. elegans
2.1.1 Structure sensorielle : les amphides
2.1.2 Mécanosensation et locomotion
2.1.3 Signalisation aminergique
2.1.4 Insuline et facteurs de croissance TGF-beta
2.2 Méthodes d’analyse fonctionnelle du système nerveux
2.2.1 Ablation de neurones
2.2.2 Imagerie calcique
3 Stratégies alimentaires
3.1 Recherche de nourriture
3.1.1 Chimiotactisme et thermotactisme
3.1.2 Adaptation aux périodes de famines : la larve Dauer
3.2 Adaptation à la présence de nourriture
3.2.1 Ralentissement en présence de nourriture
3.2.2 Comportement social
3.2.3 Quiescence
3.3 Dwelling et Roaming, un comportement à deux états
II Bases sensorielles et moléculaires d’un comportement alimentaire de C. elegans
4 Analyse du comportement de C. elegans en présence de nourriture
4.1 Premières observations
4.2 Méthode d’analyse quantitative
4.3 Comportement du ver sauvage en conditions standard
5 Eets des conditions environnementales et de l’expérience de l’animal
5.1 Inuence de la concentration en nourriture
5.2 Eet de l’expérience alimentaire antérieure de l’animal
5.3 Inuence de la température
5.4 Couplage avec la reproduction
5.4.1 Corrélation avec le comportement de ponte
5.4.2 Importance de l’état de fécondation de l’animal
6 Modes de perception et voies de signalisation impliquées
6.1 Inuence de la perception sensorielle
6.1.1 La perception métabolique interne de la présence de bactéries nutritives est nécessaire pour déclencher la phase de dwelling
6.1.2 Comportement des mutants du développement ou du fonctionnement des neurones des amphides
6.2 Modulation par les voies de signalisation des amines
6.3 Modulation par les voies de signalisation de l’insuline et des TGF-beta
6.4 Conclusions
III Un nouveau système d’imagerie calcique pour la mesure simultanée de l’activité neuronale et du comportement de C. elegans
7 Méthode expérimentale
7.1 Motivation
7.2 Dispositif expérimental
8 Résultats
8.1 Circuit neuronal de contrôle de la locomotion de C. elegans
8.2 Corrélation de l’activité calcique des neurones AVA et du comportement de C. elegans
8.3 Les pics d’activité spontanée des neurones PLM corrèlent avec des pics d’accélé- ration de C. elegans
8.4 Mesures d’activité calcique de l’interneurone AIY
8.5 Conclusions
IV Conclusions et perspectives
V Annexes
A Protocoles de culture de Caenorhabditis elegans
A.1 Protocoles standard
A.1.1 Souches utilisées
A.1.2 Milieux de culture
A.1.3 Culture de C. elegans
A.1.4 Congélation
A.2 Préparation des expériences
A.2.1 Expériences standard
A.2.2 Expériences après une période de famine
A.2.3 Expériences à concentration de bactéries contrôlée
A.2.4 Expériences en présence de bactéries traitées à l’aztreonam
A.2.5 Tests en présence de microbilles
B Biologie moléculaire et transformation par microinjection
B.1 Construction du plasmide pOHD3
B.2 Transformation par microinjection
C Méthodes d’imagerie de C. elegans
C.1 Systèmes d’enregistrement de trajectoires
C.1.1 Système mono-ver
C.1.2 Système multi-vers
C.2 Imagerie calcique
C.2.1 Marqueurs de l’activité calcique
C.2.2 Système d’imagerie calcique
C.2.3 Analyse du signal
VI Articles
D Article 1
E Article 2
Bibliographie
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