Electrophorèse des ARN sur gel dénaturant de Formaldéhyde-Agarose (FA)

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LES PRINCIPAUX SYSTEMES DE LA PCR EN TEMPS REEL :

Deux types de marqueurs fluorescents sont utilisés pour la détection quantitative des amplicons : les agents intercalants se liant à l’ADN double brin et les sondes oligonucléotidiques fluorescentes :

AGENTS SE LIANT A L’ADN DOUBLE BRIN :

Les molécules qui se lient à l’ADN double brin peuvent être divisées en deux classes:
– les agents intercalant comme le bromure d’éthidium [HIGUCHI et al, 1992] et le YO-PRO-1 [ISHIGURO et Coll. 1995; TSENG et Coll. 1997].
– et les agents se fixant au sillon mineur comme le SYBR Green I et le Hoeschst 33258 (spécifique des zones riches en A-T) [SEARLE et EMBREY 1990; NIELSEN 1991].
L’émission fluorescente des ces molécules augmente lorsque ces dernières sont liées à l’ADN double brin.
Le SYBR Green I est l’agent le plus fréquemment utilisé (Figure 2). Il présente l’avantage d’être économique, facile à utiliser et plus sensible que le bromure d’éthidium.
Quand l’ADN est dénaturé, les molécules de SYBR Green sont libérées et la fluorescence est réduite. Au cours de la polymérisation, le SYBR Green s’insère dans les doubles brins formés provoquant une augmentation de la fluorescence (250 fois plus forte que la molécule libre). Cette augmentation est associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin naissant. Cette émission fluorescente décroît complètement lorsque l’ADN est dénaturé au cycle suivant. De ce fait, l’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun des cycles par un système de lecture intégré à l’appareil de PCR en temps réel qui permet de suivre l’augmentation de la quantité d’ADN amplifié durant la réaction [BUSTIN, 2000].

LES SONDES FLUORESCENTES :

La technologie Taqman

La technologie Taqman est basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde oligonucléotidique hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR et sur le principe du FRET ‘’Fluorescence Resonance Energy Transfer’’ (quand un fluorochrome à haute énergie est étroitement proche – 10 à 70 Å – d’un fluorochrome à faible énergie, il se produit un transfert d’énergie vers le fluorochrome à faible énergie.) (Figure 4).
Cette sonde d’hybridation est marquée avec deux fluorochromes : un fluorochrome émetteur (‘’reporter’’) à son extrémité 5’ et un second fluorochrome suppresseur (‘’quencher’’) à l’extrémité 3’.
Lors d’une stimulation, le fluorochrome émetteur transfert son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET. Ce fluorochrome suppresseur dépense cette énergie sous forme de chaleur au lieu d’émettre de la fluorescence [MACKAY et Coll., 2002]. Alors qu’au cours de la polymérisation, lorsque la Taq polymérase rencontre sur son passage la sonde hybridée, elle déplace et hydrolyse cette dernière avec son activité 5’-exonucléasique. Le reporter est alors libéré de l’environnement du suppresseur, et émet une fluorescence qui augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde. Étant donné que l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase est spécifique à l’ADN double brin, les sondes libres en solution demeurent intactes et aucune fluorescence n’est émise.
Ces marqueurs fluorescents sont choisis de manière à ce que le spectre d’émission de l’émetteur recouvre le spectre d’excitation du suppresseur (Figure 4). On peut citer comme exemples de couple d’émetteur-suppresseur avec leurs longueurs d’onde d’excitation et d’émission correspondantes : FAM(470/510)-BHQ1(480/580), JOE(530/555)-BHQ1(480/580), ROX(585/610)-BHQ2(550/650), et BHQ3(620/730)-Cy5(625/665).

Hybridation de 2 sondes 

Cette technologie repose sur l’utilisation de deux sondes linéaires complémentaires à une séquence cible [WITTWER et Coll. 1997)]. La première sonde porte en 3’ un fluorochrome donneur (exemple : JOE, FITC ou ‘’fluorescein isothiocyanate’’) qui produit une fluorescence lorsqu’il est excité par une source de lumière. La seconde sonde porte en 5’ un fluorochrome émetteur (exemple : TAMRA, Red640, Red705). En solution, les deux sondes sont libres et séparées. Il en résulte un bruit de fond du donneur.
Pendant l’étape d’hybridation, les deux sondes se fixent à leurs séquences cibles respectives localisées à moins de 10 nucléotides [MACKAY et Coll. 2002] dans un arrangement en tête-à-queue. La proximité des deux fluorochromes permet le transfert énergétique du fluorochrome donneur par le principe FRET au fluorochrome émetteur, et provoque l’émission fluorescente de ce dernier. L’accroissement de la fluorescence est proportionnel à la quantité d’ADN synthétisé durant la réaction.
Pendant l’étape de polymérisation, les deux sondes retournent de façon indépendante en solution ce qui supprime l’émission de fluorescence.

Balises moléculaires

Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN en forme d’épingle à cheveux. La séquence de la sonde qui compose la boucle est complémentaire à la séquence cible d’ADN. Le tronc de la balise moléculaire est formé de deux bras avec des séquences complémentaires [TYAGI et KRAMER 1996]. Un émetteur fluorescent (comme FAM, TAMRA, TET, ROX) est fixé à l’extrémité d’un des bras et un suppresseur ou ‘‘quencher’’ (comme 4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzène: DABCYL) est fixé à l’extrémité de l’autre bras.
Quand une sonde est libre, elle adopte une structure en épingle à cheveux permettant ainsi au suppresseur d’absorber le fluorochrome de l’émetteur. Pendant l’étape d’hybridation, lorsque la sonde rencontre une séquence qui lui est complémentaire, elle adopte une conformation transitoire qui force le tronc à se séparer libérant ainsi les 2 bras. La sonde s’hybride alors préférentiellement à sa séquence complémentaire cible sur la matrice. Dans cette conformation, le fluorochrome émetteur est éloigné de son suppresseur restaurant ainsi l’émission de fluorescence qui peut être détectée.

DOMAINES D’APPLICATION DE LA PCR EN TEMPS REEL : (Pour revue, TSE et CAPEAU 2003, TOURTE 2001, VANDENBROUCKE et Coll. 2001)

Depuis leur découverte, les techniques de PCR sont rapidement apparues comme des outils indispensables en biologie moléculaire. Entre autres, la quantification en temps réel constitue un élargissement des applications à de très nombreux domaines :
– En microbiologie, ces techniques offrent une détection et une quantification bactérienne et fongique bien plus sensible et rapide que les techniques traditionnelles. Ces dernières techniques, nécessitant la purification et la culture cellulaire, demandent quelques jours à quelques semaines pour avoir les résultats. Alors qu’on obtient les résultats le jour du prélèvement par les techniques de PCR.
– En virologie, elles permettent de réaliser la titration virale, comme dans le cas du SIDA ou des hépatites. C’est un grand intérêt dans les phases précoces de la maladie et dans le suivi des traitements antiviraux.
– En agroalimentaire, elles permettent la détection de mutations ponctuelles (‘’ single-nucleotide polymorphism ou SNP’’) pour la discrimination allélique, ainsi que la quantification des organismes génétiquement modifiés (OGM);
– En recherche biomédicale, elles permettent de rechercher les mutations et les résistances et aussi de faire un typage génétique (SNP);
– Dans le domaine de l’expression génique, les techniques de RT-PCR sont largement utilisées pour: (a) estimer le niveau d’expression d’un gène (exemple : étude de l’expression des gènes de stress au niveau transcriptionnel chez Oenococcus oeni par BELTRAMO et Coll. en 2003; (b) l’étude des ARNm variants résultant d’épissage alternatif; (c) valider les résultats des puces à ADN.

GENERALITES SUR LA TUBERCULOSE

DEFINITION :

La tuberculose est une maladie infectieuse chronique ou aiguë, due à une bactérie, Mycobacterium tuberculosis ou bacille de Koch (BK). Le nom de tuberculose vient des tubercules (ou follicules tuberculeux), qui se forment pour enserrer et piéger le bacille.
La tuberculose est le plus souvent pulmonaire (85% des cas) mais elle peut aussi être osseuse, ganglionnaire, cutanée, rénale, urogénitale, méningée …
M. tuberculosis est une bactérie aérobie stricte, parfois micro-aérophile, acido-alcoolo-résistante. C’est une bactérie à croissance lente : 3 à 4 semaines sur milieu solide avec un temps de génération environ 20h.

INFECTION PAR M. TUBERCULOSIS : (Pour revue, BOOM et Coll. 1992, OMS BK & VIH 1996, LAZAREVIC et Coll. 2002)

L’inhalation des bactéries en suspension dans l’air constitue le principal mode de contamination. Parmi les individus exposés, seulement 10-30% seront réellement infectés.
Lors de l’infection, les bactéries se déposent au niveau des alvéoles pulmonaires et sont phagocytées par des macrophages dans lesquels elles meurent, restent au repos ou se multiplient. Dans ce dernier cas, les macrophages sont détruits et les bactéries sont libérées puis de nouveau phagocytées par d’autres macrophages et d’autres cellules du système immunitaire telles que les monocytes. Les bactéries libres ou phagocytées vont migrer vers le sang périphérique, puis vers les ganglions lymphatiques où elles vont activer les différents types de lymphocytes T (CD4+ et CD8+) qui vont se multiplier localement. Ces lymphocytes T quittent le ganglion et vont migrer vers les foyers infectieux initiaux où ils reconnaissent les cellules infectées présentant les antigènes du bacille tuberculeux. L’interaction entre ces antigènes et les récepteurs des cellules T vont activer ces derniers. Ces lymphocytes sensibilisés vont proliférer et secréter les lymphokines médiatrices. Ces dernières vont activer les macrophages qui vont produire l’IL-12 orientant les lymphocytes T CD4+ et CD8+ vers une différenciation en lymphocytes TH1. Le TH1 sécrète l’interféron gamma (INFγ) et le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) qui sont les deux facteurs principaux dans l’enclenchement de l’activité bactéricide (comme la production de monoxyde d’azote ou NO) et phagocytaire des pathogènes intracellulaires comme le BK.
Dans la plupart des cas, le développement de cette immunité cellulaire spécifique limite la multiplication des bacilles et le sujet reste asymptomatique. Cet état est défini comme une «tuberculose infection». Un foyer infectieux local appelé tubercule se constitue progressivement. Il contient des macrophages vivants, dégénérés ou fusionnés, des bactéries et des lymphocytes. Ce tubercule peut devenir un granulome avec une nécrose centrale isolée où les bactéries en dormance réduisent leur activité métabolique facilitant leur survie en condition anaérobie et de carence de nutriments.
La clé du contrôle de la tuberculose est la mise en évidence des sujets infectés par Mycobacterium tuberculosis, à risque de développer une tuberculose active [ATS 2000]. Cette stratégie est efficace, car un traitement préventif des sujets infectés non malades diminue le risque de progression vers une tuberculose active ou tuberculose–maladie de près de 90 % [FEREBEE 1969].
L’intradermo-réaction (IDR) à la tuberculine (purified protein derivatives, PPD) est le test utilisé généralement pour diagnostiquer l’infection de tuberculose. Ce test est un test facile à mettre en place. L’injection de PPD en intradermique induit localement dans les 48 à 96 heures la formation d’un érythème et d’une induration lorsque l’individu est sensibilisé à des produits mycobactériens. Ce test repose exclusivement sur la réponse cellulaire médiée par les lymphocytes T. L’IDR est jugée négative lorsque le diamètre d’induration est < à 5 mm. Elle est jugée positive lorsque le diamètre d’induration ≥ 5 mm. Le virage de l’IDR se définit de la manière suivante : en l’absence de vaccination par le BCG une IDR ≥ 10 mm est en faveur d’une infection tuberculeuse. Chez les sujets vaccinés par le BCG, l’IDR est ≥ à 5mm dans les premières années qui suivent la vaccination. Dix ans après la vaccination par le BCG, une IDR ≥ 10 mm est le témoin d’une rencontre avec du bacille tuberculeux sauvage dans près de 90 % des cas. [SPLF: www.splf.org]. Le défaut de ce test est lié à sa fable spécificité, l’activité hétérospécifique avec le BCG et beaucoup de mycobactéries environnementales, et la pauvre sensibilité (seulement 75-90% dans la tuberculose active) [HANSTED 2007]. Dix à ving-cinq pourcent des adultes présentant une tuberculose maladie ont une IDR faussement négative. Ce pourcentage est de l’ordre de 10% chez les enfants immuno-compétents. Les valeurs sont plus faibles chez les sujets présentant des tuberculoses maladies sévères [HERRMANN 2006].
Une alternative au test IDR existe précocement. Il s’agit d’analyses in vitro, mesurant par ELISPOT (enzyme-linked immunospot) l’interféron-gamma produit par les lymphocytes T d’une personne précédemment exposée à la tuberculose lorsqu’ils sont mis en contact avec des antigènes de M. tuberculosis. Les antigènes utilisés sont plus spécifiques de M. tuberculosis que la tuberculine. La technique consiste à énumérer tous les spots formés à l’issue de l’incubation des cellules mononuclées circulantes avec les antigènes spécifiques.
Une faible proportion de personnes développe la maladie de façon apparente où il y aura caséification du granulome, c’est à dire une dégradation tissulaire aboutissant à la formation d’une matière jaune blanchâtre ressemblant à du fromage (caséum). Les lésions vont donc s’étendre. A ce stade, les symptômes commencent à apparaître : fièvre, fatigue, sueurs nocturnes, perte d’appétit (anorexie) et amaigrissement. Dans la tuberculose pulmonaire viennent s’ajouter la toux, des douleurs thoraciques et des crachats contenant du sang (hémoptysies).
Parmi les individus infectés, seulement 10% développeront une tuberculose active: 5 % développeront une maladie dans les deux ans et 5 % au cours de leur vie. En fait, après la primo-infection, le bacille peut rester longtemps dans l’organisme à l’état latent et attendre un affaiblissement des défenses immunitaires comme le vieillissement ou la co-infection avec d’autres agents pathogènes pour se multiplier.

APOPTOSE ET IMMUNITE ANTI-TUBERCULEUSE :

L’APOPTOSE :

DEFINITION :

L’apoptose est une forme de mort cellulaire, chez les animaux, programmée par une machinerie interne suivant une séquence d’événements cellulaires bien précis. Elle suit un programme génétique que la cellule utilisera par défaut lorsqu’elle reçoit un signal de mort comme un dégât cellulaire trop important ou un retrait d’un signal de survie. La mort apoptotique se manifeste par un ensemble de digestions d’origine interne sans libération des constituants cellulaires dans le milieu environnant [BENSA 2000].
Les cellules mettent en place un “mécanisme de suicide” qui se traduit par de nombreux changements morphologiques : la diminution du volume cellulaire, la formation de protubérances membranaires (Figure 7), la condensation de la chromatine avant d’être fragmentée en un profil caractéristique dit en “barreaux d’échelle” traduisant une fragmentation de l’ADN, l’inversion du feuillet membranaire avec exposition des phosphatidyl-sérines et la dégradation des protéines cellulaires.
Par opposition, la nécrose est une mort cellulaire passive non programmée. C’est une destruction accidentelle d’origine exogène (brûlures, agression cellulaire par des toxines microbiennes générant des trous dans la membrane ou de fortes compressions). La nécrose ressemble à une explosion car la cellule meurt en éclatant et son contenu s’éparpille dans le milieu environnant, provoquant une réaction inflammatoire. Tandis que l’apoptose s’apparente plutôt à une implosion avec formation de corps apoptotiques qui sont rapidement digérés par phagocytose soit par les cellules voisines, soit par les macrophages. [BENSA 2000].

LES MECANISMES MOLECULAIRES DE L’APOPTOSE :

Le déroulement de l’apoptose peut être subdivisé en 3 étapes:
– La signalisation ou initialisation;
– la phase effectrice ;
– et enfin la phase de dégradation.

La signalisation ou initialisation :

Il existe de multiples voies d’initialisation de l’apoptose. Dans certains cas, la signalisation peut survenir lors du retrait d’un signal de survie tel que le tarissement d’une hormone, d’un facteur de croissance ou d’un contact intercellulaire. Dans d’autres cas, l’apoptose peut être déclenchée par un très grand nombre de stimuli comme la sollicitation de récepteurs membranaires (Fas, TNF-R), ou nucléaires (glucocorticoïdes), ou comme l’exposition à des stress divers (radiations ionisantes, hypoxie, hyperthermie, xénobiotiques comme les agents anticancéreux) [BENSA 2000].

La phase effectrice :

Cette phase dépend à la fois du degré de stimulation reçu par les cellules d’un tissu (voie intrinsèque) et de leur état de sensibilité vis-à-vis de l’environnement dans lequel elles sont intégrées (voie extinsèque).

Voie intrinsèque :

Nombreux mécanismes comme l’hypoxie, l’absence d’un facteur de croissance, une attaque de la chaîne respiratoire par des radicaux oxygénés comme le NO, provoquent l’ouverture des pores de transition de perméabilité (pores PT) (Figure 8) au niveau de membranes mitochondriales et la libération de molécules apoptogènes telles que le cytochrome C, les caspases 2, 3 et 9 ainsi que le facteur AIF (Apoptosis Inducing Factor) et la protéine Smac/DIABLO (‘’second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP-binding protein with low pI’’). [LY et coll. 2003; MALISSEIN 2005 ; RICCI 2006].
Ces molécules protéiques mitochondriales libérées lors du processus apoptotique sont regroupées sous le nom générique de SIMP (‘’Soluble Inter Membrane Mitochondrial Proteins’’) et possèdent toutes une activité pro-apoptotique. Elles sont associées soit à une voie mitochondriale caspase-dépendante, soit à une voie mitochondriale caspase-indépendante [MALISSEIN 2005].
VDAC : canal anionique voltage-dépendant ; ANT : translocase des nucléotides adényliques ; Cyp-D :cyclophiline D ; ME : membrane externe ; MI : membrane interne [MALISSEIN 2005].

Voie mitochondriale caspase-dépendante :

On distingue principalement le cytochrome C et la protéine Smac/DIABLO comme une première classe de SIMP déclenchant la voie apoptotique dépendante des caspases. Une fois libéré dans le cytosol, le cytochrome C interagit avec la protéine Apaf-1, et la pro-caspase-9, via des domaines CARD (‘’caspase recruitement domain’’); ils forment ainsi un complexe multiprotéique à l’origine de l’activation de la pro-caspase-9. Cette dernière activera à son tour des caspases exécutrices comme les caspases 3 ou 7 [SLEE et coll. 1999 ; MALISSEIN 2005]. (Figure 9)
Pour la protéine murine Smac et son orthologue humain DIABLO, elle agit sous forme de dimères et contribuent à l’activation des caspases en séquestrant les protéines inhibitrices de l’apoptose ou IAPs (‘’inhibitors of apoptosis’’).

Voie mitochondriale caspase-indépendante :

L’AIF et des endonucléases, après un stimulus apoptotique, sont libérées par la mitochondrie, transloquées dans le noyau des cellules en apoptose et induisent, en coopération, le clivage de l’ADN en fragments de haut poids moléculaires d’au moins 50 kpb [SUSIN et Coll. 1999 ; LI et Coll. 2001 ; VAN LOO et Coll. 2001].
En outre, on peut citer la protéase Omi/HtrA2 (protéase mitochondriale libérée dans le cytosol après un stimulus apoptotique) qui peut induire une mort soit dépendante soit indépendante des caspases [VAN LOO et Coll. 2002 ; VERHAGEN et Coll. 2000]. En effet, Omi/HtrA2 présente une dualité fonctionnelle. Elle peut soit se lier et inhiber les IAPs déclenchant alors la cascade de caspases, soit elle dégrade, grâce à son activité de sérine protéase, des protéines intracellulaires nécessaires à la vie de la cellule [MALISSEIN 2005].

La voie extrinsèque :

La voie extrinsèque déclenchée par des signaux provenant de l’environnement de la cellule, fait intervenir les récepteurs membranaires spécifiques : les récepteurs de mort ou « death receptors » (DR) (Figure 10) faisant partie de la superfamille des TNF-R (‘’tumor necrosis factor receptor’’).

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Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITES
I – Généralités sur la RT-PCR en temps réel
I- 1- Définition
I- 2- Les principaux systèmes de la PCR en temps réel
I- 2- 1- Agents se liant à l’ADN double brin
I- 2- 2- Les sondes fluorescentes
I- 2- 2- 1- La technologie Taqman
I- 2- 2- 2- Hybridation de 2 sondes
I- 2- 2- 3- Balises moléculaires
I- 3- Domaines d’application de la PCR en temps réel
II. Généralités sur la tuberculose
II- 1- DEFINITION
II- 2- INFECTION PAR M. tuberculosis
III- APOPTOSE ET IMMUNITE ANTI-TUBERCULEUSE
III- 1- L’APOPTOSE
III- 1- 1- Définition
III- 1- 2- Les mécanismes moléculaires de l’apoptose
III- 1- 2- 1- La signalisation ou initialisation
III- 1- 2- 2- La phase effectrice
III- 1- 2- 2- 1- Voie intrinsèque
a)-Voie mitochondriale caspase-dépendante
b)-Voie mitochondriale caspase-indépendante
III -1- 2-2-2- La voie extrinsèque
III -1- 2- 3- La phase de dégradation
III- 2- Rôle de l’apoptose dans l’immunité anti-Tuberculeuse
III- 2- 1- L’apoptose utilisée comme protection de l’hôte contre M. tuberculosis
III- 2- 2- L’apoptose utilisée par M. tuberculosis comme un moyen d’évasion
MATERIELS ET METHODES
I- SUJETS DE L’ETUDE ET MATERIELS BIOLOGIQUES
I – 1- Recrutement des sujets
I – 2- Prélèvement sanguin
I – 3- Considérations éthiques
II- Dosage des ARNm du sang par RT-PCR en temps réel
II- 1- Réactifs et matériels
II- 1- 1- Extraction des ARN
II- 1- 1- 1- Kit PaxgeneTM Blood RNA (PreAnalytixTM)
II- 1- 1- 2- Autres réactifs
II- 1- 2- Dosage des ARN extraits
II- 1- 3- Electrophorèse des ARN sur gel dénaturant de Formaldéhyde-Agarose (FA) 27
II- 1- 4- La transcription reverse
II- 1- 4- 1- Le kit Omniscript® Reverse Transcription
II- 1- 4- 2- Amorce oligo(dT)
II- 1- 4- 3- L’inhibiteur de RNase
II- 1- 5- La PCR en temps réel
II- 1- 5- 1- Les ADN standard
II- 1- 5- 2- Les amorces et les sondes
II- 1- 5- 3- Le Master mix
II- 2- METHODES
II- 2- 1- L’extraction des ARN
II -2- 1- 1- Principe
II -2- 1- 2- Mode opératoire (kit Paxgene™ Blood RNA)
II -2- 1- 2- 1- Obtention des acides nucléiques cellulaires
II – 2- 1- 2- 2- Isolement des ARN totaux
III- 2- 1- 2- 3- Traitement à la DNase I
III – 2- 1- 2- 4- Elution des ARN
II- 2- 2- Dosage des ARN extraits
II -2- 2- 1- Principe
II- 2- 2- 2- Mode opératoire
II- 2- 3- Détermination de l’intégrité des ARN extraits par électrophorèse sur gel dénaturant de Formaldéhyde-Agarose (FA)
II – 2- 3- 1- Principe
II – 2- 3- 2- Méthode
II- 2- 4- La transcription reverse
II – 2- 4- 1- Principe
II – 2- 4- 2- Méthode
II- 2- 5- La PCR en temps réel
II- 2- 5- 1- Principe
II- 2- 5- 1- 1- Courbe standard (ou étalon)
II- 2- 5- 1- 2- Quantification des ARNm par rapport à un contrôle endogène
II- 2- 5- 2- Méthode
II- 2- 5- 2- 1- Préparation du mélange réactionnel pour la PCR
II – 2- 5- 2- 2- Profils des essais PCR en temps réel pour chaque marqueur utilisé
II- 2- 5- 2- 3- Analyse de la PCR en temps réel
III- ANALYSE DES DONNEES
RESULTATS
I – Qualité des ARN extraits
II – Utilisation du gène HuPO comme gène de référence interne
III – Description des sujets de l’étude
IV – Expression des marqueurs de l’apoptose chez les sujets
IV- 1- Analyse globale de tous les groupes de sujets par analyse de variance de KruskalWallis
IV- 2- Comparaison de l’expression des marqueurs entre groupes de sujets pris deux à deux (test de Kruskal-Wallis pour 2 groupes)
V- Expression des marqueurs apoptotiques selon la réponse IDR
VI- EXPRESSION DES MARQUEURS DE L’APOPTOSE SELON LA REPONSE AU TESTS IFNγ-ELISPOT
VII – Expression des marqueurs avant (J0) et après traitement (M12) chez les patients
VII – 1 – Comparaison de l’expression des marqueurs à J0 et M12 chez les patients
VII – 2 – Comparaison de l’expression des marqueurs à J0 et M12 chez les patients selon la réponse du test IDR
VII – 3 – Comparaison de l’expression des marqueurs à J0 et M12 chez les patients selon la réponse du test INFγ-ELISPOT
VII – 4 – Récapitulation des résultats
DISCUSSION ET CONCLUSION
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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