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EFFETS INDIRECTS DE BACILLUS THURINGIENSIS SUR LES RTÉBRÉSETLESVERTÉBRÉS
Effets indirects sur les invertébrés
Depuis quelques années, les pesticides chimiques font l’objet de nombreuses critiques auprès des environnementalistes. L’utilisation de pesticides bio quant à elle est de plus en plus souhaitée. Avec l’utilisation grandissante des insecticides biologiques tels des formulations à base de B. thuringiensis, il est impératif de connaître ses effets indirects sur les invertébrés non visés par celles-ci. Dans les diverses formules commerciales de B. thuringiensis, il existe des souches dont les propriétés insecticides s’étendent à un large éventail d’insectes. Ceci est principalement dû au fait qu’une seule souche de B. thuringiensis peut produire différentes protéines Cry. Les études faites sur le terrain et en laboratoire démontrent que B. thuringiensis n’a seulement qu’un impact limité sur les invertébrés non ciblés. Ceci pourrait s’expliquer par la nécessité pour la toxine d’avoir la présence d’un récepteur spécifique qui existerait que chez l’insecte. Le contrôle des doses de B. thuringiensis utilisées, les facteurs environnementaux, le ciblage des zones à traiter ainsi que l’étude des espèces d’insectes en présence sont des facteurs qui peuvent réduire l’impact de B. thuringiensis sur des insectes non visés. Les facteurs environnementaux ne peuvent tous être recréés dans un laboratoire, c’est donc . dire que les résultats obtenus en laboratoire sur les effets indirects de B. thuringiensis sur les invertébrés ne sont que partiellement transposables du laboratoire au terrain. Dans l’environnement, B. thuringiensis est soumis à plusieurs conditions peu favorables à sa croissance et à la survie de ses toxines tels que les variations de température, la présence de rayons UV, le manque de nutriments ainsi que plusieurs autres facteurs.
Lors d’études de certains écosystèmes, il a été démontré qu’après une année d’application de B. thuringiensis en forêt pour contrer les lépidoptères, la population d’insectes visés diminue durant près de deux ans. Après deux ans sans traitement, un retour à la normal au niveau du nombre des lépidoptères est observé (Glare et 0′ Callaghan 2000). Dans une étude similaire, après deux semaines de traitements pour contrer le lépidoptère Ceanothus velutinus, une différence marquée dans le nombre de lépidoptères a été rapporté, et ce, jusqu’à un an suivant l’aspersion. Par la suite, aucun changement dans la population de cet insecte ne fut observé (Miller, 1992). La perte de toxicité des formulations de B. thuringiensis dans l’environnement après un certain temps est un facteur important puisqu’il réduit la probabilité d’avoir des effets indirects sur les invertébrés. Cette perte de toxicité dans le temps, jumelée à une quasi absence d’implantation de B. thuringiensis dans l’environnement en font un insecticide plus sécuritaire, possédant un impact insignifiant sur la population d’insectes non visés.
Effets indirects sur les vertébrés
Poissons et oiseaux
Lors de l’épandage de B. thuringiensis, il est important de connaître les effets indirects non seulement sur les invertébrés, mais également sur les vertébrés tels les poissons et les oiseaux. Bon nombre d’études ont été réalisées afin de vérifier la toxicité de B. thuringiensis sur différentes espèces de poissons. La WHO a révisé des études faites en laboratoires et sur le terrain. Elle a démontré qu’aucune toxicité n’a été rapportée envers les populations de poissons (WHO «Environment Health Criteria 217 », 1999).
Il en va de même pour les oiseaux, aucune toxicité n’a été rapportée sur différentes espèces. Plusieurs études ont démontré que B. thuringiensis, même lorsqu’administré à hautes doses, ne représente aucun danger pour les oiseaux. Les effets de B. thuringiensis sur les oiseaux se font plutôt sentir indirectement. Étant donné que les utilisations commerciales de B. thuringiensis servent à réduire la population d’insectes nuisibles, la nourriture disponible pour les oiseaux insectivores s’en trouve affectée. La réduction de nourriture due à l’application de B. thuringiensis peut aussi mener à une réduction de la nidification chez certains oiseaux (Rodenhouse and Holmes 1992). Outre les poissons et les oiseaux, les effets sur les mammifères étaient une source de grande préoccupation au sein de la population.
Mammifères
Dû à son utilisation répétée depuis des dizaines d’années et à sa proximité génétique avec Bacillus anthracis et Bacillus cereus, plusieurs études ont été menées à savoir si B. thuringiensis représente un danger pour les mammifères. En 1998, l’agence américaine «Environmental Protection Agency» (EP A), basée sur une revue de l’ensemble des études publiées, stipule qu’aucun effet néfaste n’a été observé sur la santé des mammifères (Mcclintock, Schaffer et al., 1995). Ces études ont été menées selon différentes voies d’expositions telles que l’exposition orale, pulmonaire, cutanée, oculaire et intrapéritonéale. Une autre étude indépendante a utilisé B. thuringiensis subsp. israelensis sur les mêmes voies d’expositions mentionnées ci-haut en ajoutant les voies intracérébrale et en aérosol. Ils arrivent à la conclusion que seule la voie intrapéritonéale peut être mortelle pour le rat à très haute dose (107 bactéries par rat), ce qui ne constitue pas un résultat significatif pour traiter B. thuringiensis comme un pathogène des mammifères (Siegel and Shadduck 1990).
Effets sur les humains
Suite à l’utilisation grandissante de bio insecticides à base de B. thuringiensis, les effets sur la faune et la flore environnante étaient une des plus grandes préoccupations de l’industrie et de la population. La proximité de la population avec les différentes zones traitées n’a fait qu’accroître cette inquiétude. Entre autres, les conséquences des contacts de B. thuringiensis sur les humains étaient au coeur de ces préoccupations.
Quelques cas d’intoxications ont été rapportés au cours des années d’utilisations de B. thuringiensis, quoique aucune étude ne démontre un réel risque pour la santé des humains (Mcclintock, Schaffer et al., 1995). Dans les formules commerciales de B thuringiensis, les ~-exotoxines sont interdites, ce qui réduit grandement les risques d’effets toxiques. Les études épidémiologiques de l’ exposition des populations à B. thuringiensis prouvent également le très faible risque de maladies liées à l’épandage (Green, Heumann et al., 1990; Drobniewski 1994). Chez les travailleurs destinés à l’épandage, lors d’expositions à fortes doses durant une période prolongé, -les effets rapportés sont liés à une légère irritation temporaire de la peau, des lèvres, des yeux et des voies respiratoires (Green, Heumann et al. , 1990).
Les résultats d’une étude ayant été menée auprès de 18 sujets afin de vérifier les effets de B. thuringiensis par inhalation (109 spores/jour) et par voie orale (100 mg de Thuricide pendant cinq jours), aucun effet nocif n’a été rapporté (Fisher and Rosner 1959). Dans la littérature médicale, seulement deux cas d’infections ont été attribuables à B. thuringiensis. Dans le premier cas, un fermier a reçu des éclaboussures de Dipel (formulation commerciale à base de B. thuringiensis) lui causant un ulcère. Des spores de B. thuringiensis ont été retirées de l’ulcération, mais celles-ci n’ont pas été formellement identifiées en tant qu’agent causal de l’ulcère (Samples and Buettner, 1983). Dans le second cas, un étudiant s’est accidentellement injecté une suspension contenant du B. thuringiensis subsp. israelensis et de l’ Acinetobacter calcoaceticus, causant ainsi une infection qui fût guérie après un traitement antibiotique (Warren, Rubenstein et al., 1984).
En combinant différentes études menées par les industries et laboratoires indépendants, la conclusion générale émanant de ces recherches est que B. thuringiensis constitue un insecticide sans risques pour les humains. Les dizaines d’années d’utilisation de B. thuringiensis sans réel épisode infectieux sur les humains sont là pour le démontrer. Lors d’études où il y a eu mortalité de petits mammifères, des doses à très hautes concentrations étaient administrées par voies invasives, ce qui est impossible dans l’environnement (Siegel, 2001). Quant aux humains, les seuls incidents rapportés sont liés à l’exposition prolongée des travailleurs dans des conditions précises ou à une mauvaise manipulation des produits commerciaux de B. thuringiensis (WHO « Environment Health Criteria 217 », 1999). En regard des études et des faits exposés dans la littérature, la WHO conclue que l’utilisation commerciale de B. thuringiensis est sans risque pour les humains (WHO « Environment Health Criteria 217 », 1999).
Définition d’une parasporine
B. thuringiensis est connue depuis des dizaines d’années en tant qu’insecticide biologique grâce à l’action toxique de ses protéines Cry. Cependant, le rôle de B. thuringiensis dans la nature est mal connu, d’autant plus que le nombre de souches de B. thuringiensis possédant un pouvoir insecticide est inférieur à celles n’en possédant pas. Le ratio des souches non insecticides versus les souches insecticides est d’environ 90 % (Ohba, Mizuki et al., 2009). Ce ratio a motivé plusieurs travaux de recherches afin de trouver un autre ou le vrai rôle biologique de B. thuringiensis. Lors d’une étude menée auprès de plus de 1700 souches, il a été découvert que plus de 40 souches noninsecticides possédaient une action toxique sur des cellules leucémiques MOLT-4 (Mizuki, Ohba et al., 1999). Ces nouvelles protéines Cry anti cancéreuses seront par la suite désignées parasporines (Mizuki, Park et al., 2000). Les parasporines sont, par définition, des protéines Cry non insecticides et non hémolytiques possédant une activité toxique sur des cellules cancéreuses (Crickmore et al., 2014, http://www.btnomenc1ature.infoD·
Parasporines découvertes jusqu’à présent
Il existe présentement 19 parasporines regroupées en un total de six familles (PS1-PS6) (Crickmore et al., 2014, http://www.btnomenc1ature.infoD. Plusieurs de ces parasporines possèdent des séquences d’acides aminés comparables (Figure 5.1).
Mécanismes d’action des parasporines sur les cellules cancéreuses humaines
Le mécanisme d’action des parasporines n’est pas universel. Il diverge entre les parasporines, mais aussi entre les différentes lignées cellulaires cancéreuses (Ohba, Mizuki et al., 2009). C’est donc dire qu’une même parasporine peut avoir un mécanisme d’action différent selon le type de cancer et selon la concentration à laquelle elle se retrouve. L’étape universelle dans le mécanisme d’action des parasporines est leur liaison avec un récepteur situé à la surface des cellules cancéreuses. Chez l’insecte, le mécanisme d’action des protéines Cry implique nécessairement une altération de la membrane de la cellule, menant ainsi à la lyse et à la mort de celui-ci. En contrepartie, certaines parasponnes semblent démontrer des mécanismes d’actions autres que la formation de pores dans la membrane des cellules cancéreuses humaines (Katayama, Kusaka et al., 2007). Les familles PSI et PS2 ont été les plus étudiées quant à leur mode d’action.
Dans la famille PSI, la parasporine-IAai (pSIAaI) a été la plus investiguée au niveau des mécanismes de mort cellulaire. Cette protéine de 81 kDa est connue pour former un hétérodimère de 15 kDa et 56 kDa après son activation par la trypsine (Katayama, Yokota et al., 2005). Suite à l’activation de la protoxine, l’hétérodimère se lie à récepteur couplé à une protéine G, ce qui induit une entrée de calcium à l’intérieur de la cellule cancéreuse. Ce débalancement ionique à l’intérieur de la cellule serait à l’origine du déclenchement de l’apoptose. La présence conftnnée de protéines clivées étant reliées à l’apoptose comme la caspase-3 ainsi que la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) prouvent que le mécanisme d’action de la PSIAai est apoptotique d’autant plus que l’activité toxique de la PSIAai est inhibée lors de l’ajout d’inhibiteur de caspases (Katayama, Kusaka et al., 2007). Ce mécanisme d’action ne suggère aucune formation de pores dans la membrane des cellules, contrairement à la parasporine-2Aai (pS2AaI).
À l’inverse, la PS2Aai appartenant à la famille PS2 est une protéine de 37 kDa formatrice de pores et ayant un mode d’action supposément non apoptotique (Kitada, Abe et al., 2006). Selon la littérature, la protoxine de 37 kDa est activée par la protéinase K pour former une toxine de 30 kDa qui se lie possiblement à des protéines GPI ancrées situées dans les rafts lipidiques de la cellule. Il s’ensuit un oligomérisation des PS2Aai au niveau de la membrane menant à la formation de pores et à la perméabilisation de celle-ci, pour ensuite aboutir à la lyse et la mort de la cellule (Ito, Sasaguri et al., 2004; Kitada, Abe et al. , 2006). Récemment, il a été démontré que les protéines ancrées GPI seraient impliquées dans la cytotoxicité de PS2Aai au niveau des cellules cancéreuses (Kitada, Abe et al., 2009). Le type exact de protéines GPI ancrées impliquées dans la spéciftcité et la cytotoxicité n’est pas défmi et l’existence de corécepteurs de la toxine et de co-facteurs n’est pas exclue (Kitada, Abe et al., 2009). Ces protéines GPI ancrées semblent aussi impliquées dans l’ oligomérisation, contribuant à la cytotoxicité de la PS2Aa1. Les étapes menant à la mort des cellules sont les suivantes:
un gonflement cellulaire, une altération de la structure du cytosquelette, une perméabilisation de la membrane cellulaire et la fragmentation des organelles (Kitada, Abe et al., 2006). Il s’agit d’un mécanisme de mort cellulaire autre que l’apoptose, sans doute nécrotique, qui semble être impliqué.
L’apoptose
Le tenne apoptose a été proposé pour la première fois en 1972 afin de décrire des motifs morphologiques spécifiques à la mort cellulaire dans les tissus (Kerr, Wyllie et al., 1972). Les principaux changements morphologiques d’une cellule en apoptose sont: le rétrécissement de la cellule, une réduction du noyau (pycnose), une fragmentation du noyau (karyorrhexis), le maintien de intégrité des organelles, une rétraction des pseudopodes, la fonnation de bulles dans la membrane plasmique ainsi que la séparation des fragments cellulaires en corps apoptotiques (Fink and Cookson, 2005; Elmore, 2007; Kroemer, Galluzzi et al., 2009). Les corps apoptotiques sont par la suite phagocytés par les macrophages et dégradés via les phagosomes. Du point de vue biochimique, les changements lors de l’apoptose sont l’activation des cystéine-protéases (caspases), l’exposition de phosphatidylsérine à l’extérieur de la membrane plasmique, la fragmentation de l’ADN, une dégradation du cytosquelette, l’activation de protéines pro-apoptotiques (exemple : famille Bcl-2) et l’expression de ligand pour la phagocytose (Elmore 2007; Wong 2011).
L’apoptose est bien connue en tant que mort cellulaire programmée servant notamment à conserver l’homéostasie cellulaire des tissus en accord avec la prolifération cellulaire. Le débalancement dans une cellule entre l’apoptose et la prolifération cellulaire peut mener à plusieurs maladies, notamment le cancer. À l’inverse de la nécrose, l’ apoptose peut aider le système immunitaire en éliminant les cellules endommagées ou infectées sans provoquer de réponse inflammatoire. C’est pourquoi plusieurs médicaments anticancéreux ciblent des mécanismes visant à déclencher l’apoptose puisque cette mort programmée est moins dommageable pour les tissus environnants. L’absence de réponse inflammatoire est due au fait qu’il n’y a pas de relargage de matériel intracellulaire hors de la cellule et que celle-ci est rapidement phagocytée (Elmore, 2007). L’apoptose peut être déclenchée en réponse à une multitude de stimuli et les caspases jouent un rôle fondamental dans l’initiation et l’exécution de cette mort programmée.
Il existe deux VOles principales pour l’activation des caspases soit; la VOle intrinsèque et la voie extrinsèque.
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Table des matières
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1 L’espèce Baci/lus thuringiensis
1.2 Historique de Baci/lus thuringiensis
CHAPITRE II
CARACTÉRISATION DE BACILLUS THURINGIENSIS
2.1 Méthodes de caractérisation de Bacillus thuringiensis
2.1.1 Le sérotypage
2.1.2 Méthodes phénotypiques et biochimiques
2.1.3 Méthodes moléculaires
CHAPITRE III
LES TOXINES ET MÉTABOLITES DE BACILLUS THURINGIENSIS
3.1 Les exotoxines, les exoenzymes et les métabolites
3.1.1 Les Bêta-exotoxines
3.1.2 Les hémolysines, les entérotoxines et les exoenzymes
3.1.3 Les protéines insecticides végétatives (Vips)
3.1.4 Les antibiotiques et les antifongiques produits par B. thuringiensis
3.2 Les delta-endotoxines (protéines Cry et Cyt)
3.2.1 Ancienne nomenclature
3.2.2 Nouvelle nomenclature
3.2.3 Les protéines Cyt
3.2.4 Les protéines Cry
3.2.5 L’expression et la régulation des protéines Cry
3.2.6 Séquences et structures similaires entre les protéines Cry
3.2.7 Mécanismes d’actions des protéines Cry
CHAPITRE IV
EFFETS INDIRECTS DE BACILLUS THURINGIENSIS SUR LES IN »VERTEBRES ET LES VERTEBRES
4.1 Effets indirects sur les invertébrés
4.2 Effets indirects sur les vertébrés
4.2.1 Poissons et oiseaux
4.2.2 Mammifères
4.2.3 Effets sur les humains
CHAPITRE V
LES PARASPORINES ET LEUR ACTION SUR LES CELLULES CANCEREUSES HUMAINES
5.1 Définition d’une parasporine
5.2 Parasporines découvertes jusqu’à présent
5.3 Mécanismes d’action des parasporines sur les cellules cancéreuses humaines
CHAPITRE VI
MÉCANISMES DE MORT CELLULAIRE CHEZ LES CELLULES HUMAINES
6.1 La nécrose
6.2 L’apoptose
6.2.1 La voie extrinsèque
6.2.2 La voie intrinsèque
CHAPITRE VII
PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS DE RECHERCHE
7.1 Problématique
7.2 Les hypothèses de recherche
7.3 Les objectifs de recherche
CHAPITRE VIII
PARASPORIN-2Aal FROM A NEW BACILLUS THURINGIENSIS 4R2 STRAIN » INDUCES CASPASES ACTIVATION AND APOPTOSIS IN » HUMAN CANCER CELLS
Abstract
Introduction
Materials and methods
Bacterial strain and culture media
Cells and culture conditions
Total DNA isolation
PCR amplification
DNA sequencing
Preparation of activated parasporal proteins
Assay of cytotoxicity
Light microscopy observation
Antibodies and reagents
Western blot
Measurement of Annexin V!PI cells
Statistical analyses
Results
Characterization of Bacillus thuringiensis 4R2 cristal protein
Cytotoxicity ofPS2Aal in cancer and normal cells
Morphological changes in cancer cells induced by PS2Aal
PS2Aal induces cell death by apoptotic mechanisms
Regulation of different survival pathway during treatment with PS2Aal
Discussion
References
Figures
CHAPITRE IX
DISCUSSION
9.1 L’identification de la PS2Aal chez B. thuringiensis 4R2
9.2 La toxicité sélective de la PS2Aal
9.3 La PS2Aal induit l’apoptose chez les cellules cancéreuses
9.4 Perspectives de recherche
CHAPITRE X
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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