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La voie digestive
L ingestion d éléments nutritifs, contenant du DBP, ayant librement diffusé depuis leurs emballages, constitue le mode le plus représentatif des voies d expositions. En effet, plusieurs études ont montré sa présence dans différents produits alimentaires ainsi que dans l eau de bouteille. Cela montre que, le DBP avait migré depuis ses contenants. Cette migration peut avoir lieu notamment au moment du conditionnement et du stockage de denrées alimentaires (Page & Lacroix, 1995; Petersen & Breindahl, 2000; Heudorf et al., 2007).
La voie respiratoire
L inhalation de particules contaminées contenant du DBP, constitue le deuxième mode d exposition. Différentes études ont démontré la présence du DBP dans l air ainsi que dans les poussières domestiques provenant majoritairement des matériaux de construction et des éléments synthétiques tels que, les revêtements de sol ou les peintures (Clausen et al., 2004; Fromme et al., 2004; Bornehag et al., 2005).
La voie cutanée
Une contamination transdermique est également possible dans le cas d utilisation des produits cosmétiques contenant du DBP. Toutefois, cette forme d exposition est largement minoritaire. Il est à noter qu un taux élevé du DBP avait été dosé dans les poches de sang médicales (Wormuth et al., 2006). La transfusion sanguine peut dès lors constituer une forte source ponctuelle de contamination.
Toxicocinétique
Absorption
L absorption des phthalates dépend de plusieurs facteurs. Parmi ces derniers, la dose et la voie d exposition ainsi que la masse moléculaire du composé lui-même sans pris de considération. Le DBP, est un produit stable et d une grande liposolubilité. Il est absorbé facilement quand il est ingéré ou lorsqu il entre en contact avec la peau. Il a été démontré que le DBP est aussi bien absorbé par inhalation (INRS, 2003).
chez les rats, il est a été mentionné que le DBP serait bien absorbé par la voie digestive, puisque 48h après son administration orale, 90% de la dose du DBP s est retrouvé dans les urines (Foster et al., 1982). Chez les hamsters, 73% de la dose oralement administrée du DBP a été excrété dans l’urine en 24 heures (Foster et al., 1982). Même l absorption du DBP par la voie cutanée était rapide chez le rat. Il semble que ? la peau semble constituer un réservoir de ce composé chimique (Payan et al., 2001).
Comparé à l Homme, l absorption cutanée du DBP qui est de (0,07µ g/cm2/h) est bien inférieure à celle mesurée chez le rat (9,33µg/ cm 2/h) (Scott et al., 1987).
Distribution
Dans l organisme, la distribution du DBP est rapide vers, les poumons, la rate, les tissus adipeux et plus particulièrement vers le foie et les reins. Des études ont montré qu après 4 heures d administration orale du DBP, son taux le plus faible a été relevé dans le cerveau (0,03%), alors que le taux le plus élevé a été mesurée au niveau des riens (0,66%). Il a été prouvé que le pic sanguin atteint son maximum au bout de 2 h. Après 4 h, la substance est distribuée dans tout l’organisme. Mais au-delà de 48 h, il s avère qu il ne subsiste dans l organisme qu a l état de traces (<0,01%) (INRS, 2003).
Cela veut dire que le DBP ne s accumule pas dans l organisme du fait de sa demi-vie courte, qui est-il faut le dire variable selon les espèces animales (Tanaka et al., 1978; Williams & Blanchfield, 1975).
Les métabolites du DBP peuvent se trouver également dans le tractus gastro-intestinal, le foie et les reins. Ces derniers sont considérés comme un système d excrétion et non comme un dépô t (Williams et al., 1975). Une partie des métabolites se retrouve aussi dans les tissus adipeux (Okada et al., 1978), le cerveau, le c ur, les testicules, les poumons, les muscles (INRS, 2003). Au cours de la grossesse, les métabolites ont la capacité de passer via la barrière placentaire, ce qui produit leur accumulation chez le f tus (INRS, 2003).
Métabolisme
Le DBP, comme tout xénobiotique, va subir des réactions de biotransformations destinées à l’éliminer de l’organisme. Ce processus est classiquement formé de trois grandes étapes:
a) la phase I : oxydation, réduction ou hydrolyse, destinée à rendre le xénobiotique polaire.
b) la phase II : réaction de conjugaison à l’origine d’un composé hydrosoluble.
c) la phase III : élimination.
Dans l organisme, le DBP est rapidement métabolisé au cours d une succession de réactions enzymatiques. Lors de la réaction de la phase I, le DBP est hydrolysé au niveau d une des chaînes carbonées de sa structure en MBP (monobutyl phthalate) (Fig. 2). Ce métabolite primaire est considéré comme le composé biologiquement actif de DBP et serait responsable de sa toxicité (Heindel & Powell, 1992).
Cette première phase de métabolisation a lieu majoritairement au niveau gastro-intestinal et aussi au niveau des différents organes parenchymateux. Il sera catalysée par des lipases et estérases hépatique, pancréatique et intestinale avant d être absorbé (Calafat & McKee, 2006; Rusyn et al., 2006; Frederiksen et al., 2007). Cette hydrolyse peut survenir après l absorption au niveau hépatique et rénal (INRS, 2003). Dans le sérum du rat, 80-90% du MBP total est libre, alors que le reste est glucoroconjugué (Fennell et al., 2004). Cependant, la situation est inversée chez les humains où 25 à 30% du MBP total dans le sérum est libre et le reste est représenté par le glucuronide conjugué (Silva et al., 2003).
Le MBP subit une série de métabolisations secondaires (principalement composées d hydroxylation et d oxydation) sur leur chaîne aliphatique carbonée, produisant une grande variété de monoesters secondaires. Ces métabolites secondaires sont facilement conjugables (Albro et al., 1982; Astill, 1989) sous l action de l uridine 5 -diphosphoglucoronyle transférase, qui fixe un élément glucoronide au niveau du groupement alcool du MBP. Il existe 6 métabolites secondaire formés à partir du MBP, dont le principale est un dérivé glucuro-conjugué (Silva et al., 2003). La conjugaison augmente le pouvoir hydrosoluble du métabolite ce qui facilite son excrétion dans les urines (Silva et al., 2003; Koch et al., 2005).
Le produit qui apparaît dans l’urine, est principalement MBP conjugué avec l’acide glucuronique, avec des niveaux plus bas de MBP non-conjugué, de divers produits d’oxydation du MBP et un peu de l’acide phtalique libre (Foster et al., 1982; Kawano, 1980; Tanaka et al., 1978; Williams & Blanchfield, 1975).
Les études in vitro, indiquent qu’un métabolite de DBP, le MBP est probablement la forme principale absorbée par l’intestin (Takahashi & Tanaka, 1989). Le MBP formé dans le tractus gastro-intestinal, est rapidement absorbé par le système circulatoire, puis il sera largement distribué dans le corps, c est un métabolite qui ne bio-accumule pas dans les tissues (Fennell et al., 2004; Saillenfait et al., 1998; NIEHS, 1994, 1995; Tanaka et al., 1978; Williams & Blanchfield, 1975).
Les principaux effets toxiques du DBP
Les principaux effets du DBP qui ont été rapportés dans plusieurs études expérimentales réalisées chez différentes espèces animales (rat, hamster, souris, lapin…), et chez les deux espèces (mâle et femelle). On cite, l atrophie testiculaire, l atteinte hépatique, une augmentation de la masse des reins, la baisse de la fertilité, une diminution du poids f tal, une activité anti-androgène ainsi que des effets tératogènes (Blount et al., 2000 ; IPCS, 1997).
Effets du DBP sur le foie
Le foie a été identifié comme l un des organes cible de l effet délétère du DBP. Chez les rongeurs adultes, l effet le plus évident d une contamination chronique au DBP par voie orale se traduit par une prolifération des péroxysomes hépatiques (Lake et al., 1975; Reddy et al., 1976). Il s agit de l effet néfaste le plus sensible qu il soit. Il a été reconnu que cette sensibilité hépatique ne concerne pas l Homme, mais elle est spécifique seulement au rongeur (INRS, 2003).
Cette réponse hépatique bénigne a été observée chez les rats et les souris qui ont été exposés par voie orale au DBP pour des durées aiguës (2- 4 jours) ou intermédiaires (15-20 jours). Parmi ces effets on note, une augmentation du poids du foie, celles aussi de l’activité des enzymes microsomales. Aussi l inhibition de la respiration mitochondriale (phénomène d hypoxie cytopathique), une nécrose du foie et la prolifération des peroxysomes (INRS, 2003). La plus basse dose à ces effets est observée à 348 mg/kg/j (ATSDR, 2001).
Effets du DBP sur la thyroïde et le système immunitaire
Outre le foie, cible privilégiée du DBP, ce composé est également connu pour son incidence néfaste sur d autres fonctions biologiques de l organisme. Il n existe toutefois qu une faible documentation relative à ces effets.
Au niveau de la thyroïde, deux études montrent que l exposition de rats adultes au DBP induit une diminution de la production d hormones thyroïdiennes T3 et T4 (Hinton et al., 1986; O’Connor et al., 2002).
Chez l Homme, seules quelques études épidémiologiques mettent en évidence une corrélation entre des taux de DBP élevé et un dysfonctionnement de la fonction thyroïdienne. Huang et al., (2007) ont montré une corrélation entre les taux de MBP chez la femme enceinte et une diminution de l hormone T4 libre et totale.
Le DBP est également suspecté d agir sur le système immunitaire. En effet, dans un modèle de souris favorables aux réactions allergiques, le traitement au DBP de femelles gestantes entraîne sur la descendance mâle une accélération de la différenciation des cellules impliquées dans la réaction allergique (Koike et al., 2009). Une seconde étude montre que l effet adjuvant du DBP chez la souris adulte est strictement restreint à la surproduction d anticorps de types IgG (impliqués dans la cytotoxicité des anticorps) (Larsen & Nielsen, 2008).
Effets du DBP sur la reproduction
Chez la femme
Il a été démont ré par les chercheurs que l exposition au DBP (500 mg/kg/jour) in utero chez les rats provoquerait une augmentation de la mort des f tus accompagnée de cas d avortements spontanés (Tomita et al., 1986; Gray et al., 2006; Howdeshell et al., 2008). On observe également un allongement des cycles d strus des rattes de 20 jpp (jours post partum) ainsi que l apparition d ovaires polykystiques, l anovulation et une infertilité des animaux. Ces symptô mes s accompagnent d une réduction des taux plasmatiques d stradiol et de progestérone (Davis et al., 1994; Lovekamp-Swan & Davis, 2003; Svechnikova et al., 2007).
Chez l homme
En ce qui concerne la fonction de la reproduction masculine, il a été démontré dans plusieurs recherches notamment dans les pays industrialisé que l exposition au DBP chez l homme entraine des effets néfastes sur la fonction de la reproduction. Parmi ces effets critiques les plus fréquents sont les altérations des testicules et de la prostate, ainsi que d’une réduction du nombre de spermatozoïdes (Henley et al., 2004). Des études ont révélé qu au niveau de la gonade, le DBP administré (500 mg/kg/jour) provoque une diminution du poids des testicules et une baisse de la qualité et quantité du sperme, corrélée à une baisse de la fertilité (Mylchreest et al., 2000; Fisher et al., 2003; Mahood et al., 2005; Foster, 2006; Wilson et al., 2007; Alam et al., 2010) .
Altération de la fonction stéroïdienne
Le DBP qui est classé comme toxique pour la fonction de la reproduction, est également classé en tant que perturbateur endocrinien chez les rongeurs, de par l altération de la synthèse des stéroïdes qu il entraîne. En effet, l exposition de rattes gestantes au DBP (pour des doses de 100 à 1000 mg/kg/jour) entraîne une diminution de la production de la testostérone en fin de la vie f tale. Ces observations ont été réalisées aussi bien pour une exposition au diester (Akingbemi et al., 2001; Fisher et al., 2003; Lehmann et al., 2004; Thompson et al., 2004; Borch et al., 2006; Culty et al., 2008; Lin et al., 2008; Alam et al., 2010) que pour une exposition au métabolite monoesterique principal (Shono et al., 2000).
Il est intéressant de noter que Thomson et al., (2004) ont montré qu en fin de vie f tale, 48h après arrêt du traitement par gavage au DBP, les f tus mâles présentaient un début de récupération du taux de testostérone. Ceci met en avant la potentielle de réversibilité de l effet du DBP sur la fonction stéroïdiennes (Xiao-feng et al., 2009).
En parallèle de la diminution de production de testostérone, l exposition au DBP (dès 500 mg/kg/jour) entraîne chez le rat un phénomène d agrégation des cellules de Leydig (Parks et al., 2000; Mahood et al., 2005; Scarano et al., 2010). Cette agrégation peut être accompagnée d une diminution du nombre total de cellules de Leydig (Lin et al., 2008) ainsi que leurs hyperplasie (Fisher et al., 2003; Borch et al., 2006; Culty, 2009).
Altération de la fonction gamétogénèse
Le DBP agit sur les cellules de Sertoli qui ont le rô le d être un support du développement des cellules germinales, provoquant une diminution du nombre de ces dernières (Scott et al., 2007) ainsi que leur prolifération (Auharek et al., 2010). Ces données peuvent expliquer la réduction du nombre de cellules germinales observée durant la vie f tale, comme à l âge adulte. En effet, le traitement in utero de rats aux phtalates entraîne une diminution du nombre de cellules germinales à la fin de cette période (Ferrara et al., 2006).
De plus, plusieurs études expérimentales ont mis en évidence l impact du DBP sur l interaction entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales. D une part, le DBP provoque une altération de filaments de Vimentine qui représente la communication intercellulaire (entre ces cellules). D autre part, il agit également sur la protéine NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) et les Cadhérines, provoquant une modification au niveau de leur localisation reflétant une altération de la structure des cordons séminifères (Kleymenova et al., 2005).
Enfin, d autres études in utero ont mis en évidence chez le rat l apparition de gonocytes plurinucléés après le traitement au DiBP ou DBP chez le rat (Kleymenova et al., 2005; Borch et al., 2006). Ce phénomène particulier semble être transitoire, puisqu à l heure actuelle la présence de ces cellules n a pas été démontrée à l âge adulte (Ferrara et al., 2006; Boekelheide et al., 2009).
Effet du DBP sur le développement
Bien que le DBP puisse agir directement chez l individu adulte sur la fonction de la reproduction, il semblerait que ce composé agit plutô t en altérant le développement de cette fonction au cours de la vie f tale (Borch et al., 2004). Les effets les plus importants sur le développement ont été observés au niveau de l’appareil reproducteur mâle. Parmi ces effets, notons: la diminution de la distance anogénitale, une cryptorchidie, hypospadias, une hypoplasie ou agénésie épididymaire, une hypospermie, une dysgénésie testiculaire focale et une persistance mamelonaire (Saillenfait et al., 2009 ; Saillenfait et al., 2011).
Swan et al., (2005) ont démontré chez les humains, l existence d une relation significative entre la concentration du DBP dans les urines des mères pendant la grossesse et les anomalies de l appareil génital mâles observés chez les nouveau-nés (diminution de la distance anogénitale, trouble de la migration testiculaire, hypoplasie scrotale).
Selon le plan histologique et fonctionnel, l exposition In utero au DBP allant de 100 à 1000 mg/kg/jour à la fin de la vie f tale et début de vie post-natale, entraîne des lésions testiculaires importantes aussi (troubles de la migration, lésions dégénératives des tubes séminifères, diminution des spermatocytes, hyperplasie des cellules interstitielles, voire adénomes). D autres lésions ont été également énumérées comme celles des lésions de l’épididyme, des vésicules séminales et de prostate (Borch et al., 2004; Tyl et al., 2004; Borch et al., 2005; Christiansen et al., 2010; Saillenfait et al., 2011).
De plus, l exposition de rattes gestantes au DBP (500 mg/kg/jour) entraîne l apparition de zones de dysgénésie des cordons séminifères (Fisher et al., 2003), avec des cordons incomplètement formés comprenant même des zones locales de cellules de Leydig enchâssées au sein de ces cordons (Mahood et al., 2005). En plus, L exposition in utero au DBP entraîne une diminution de la production de testostérone ainsi qu une altération histologique dans la répartition des cellules de Leydig (Borch et al., 2006).
Génotoxicité
Récemment, plusieurs travaux ont été menés sur la capacité des phtalates à altérer l’expression génique. l étude de Gwinn et al., (2007) a montré que le traitement par le DBP de quatre souches de cellules épithéliales mammaires humaines normales a induit après 5 à 10 heures, une altération des gènes pendant leurs expression. Cette altération peut provoquer une toxicité sur : la reproduction, la transduction du signal, la réponse immunitaire, la prolifération cellulaire, l’organogénèse , et l oncogène.
Effet Cancérigène
Il a déjà été suggéré , que les phtalates ont un impact sur la tumorigénèse et par conséquent induisant le cancer (Kleinsasser et al., 2001; Anderson et al., 1999). Par contre, d autres études ont indiqué qu il n’y a pas eu de mise en évidence d’un risque du cancer lié à l’exposition du DBP.
De nombreuses études ont montré chez les rongeurs que, le DBP était capable d induire la prolifération des peroxysomes. Or, il est actuellement admis que ce mécanisme est responsable chez les rongeurs, d effets cancérogènes hépatiques observés dans les études de longitudinale. Des investigations récentes ont apporté la preuve que, les substances responsables de la prolifération de peroxysomes exerçaient leurs effets via l activation du récepteur PPAR et que le gène responsable de cette activation ne s exprimait que chez les rongeurs. En conséquence, les effets cancérogènes observés sont spécifique pour les rongeurs, et ils sont considérés comme nom extrapolables à l homme (INRS, 2003).
Mécanismes d action du DBP
Selon le plan endocrinien, le DBP est considéré comme un pe rturbateur endocrinien de type strogénique car, il avait été trouvé lors d’études cellulaires in vitro qu il avait une faible action agoniste des récepteurs ostrogéniques. Cependant, certaines études évoquaient le fait que les phtalates pouvaient interagir avec les récepteurs aux androgènes (Jobling et al., 1995 ; Harris et al., 1997). Ce caractère androgénique a été mentionné au vu des effets observés chez le rat et la souris mâle sur le développement et la fonction de l’appareil reproducteur (Mylchreest et al., 1999). Cependant, le mécanisme d’action anti-androgénique du DBP n est pas lié au blocage des récepteurs androgéniques mais à une diminution importante de la sécrétion de testostérone (65 -70% dans le testicule) (Mylchreest, 2002).
Selon le plan cytologique, il est clair que le DBP provoque une atteinte au niveau des cellules de Sertoli. Car, cette atteinte altère la sécrétion paracrines de ces cellules, dont leurs rô les est de réguler la différenciation et la fonction des cellules de Leydig, qui ne sont pas elles, régulées par la LH pendant la période f tale (Ward et al., 1998). Au niveau de l hypophyse, la FSH peut agir avec le DBP, elle interfère avec son récepteur qui situe sur les cellules de Sertoli (NTP, 2000).
chez l individus adulte, les cellules de Sertoli jouent essentiellement un rô le d’assistance à la spermatogenèse qui se présente par : différentiation, croissance et fonctions des cellules germinales (Hoeben et al., 1994). Lorsque ces cellules sont touchées par la toxicité du DBP, il s engendre des malformations des spermatozoïdes (la prolifération de gonocytes multinuclées). Il est connu que les cellules de Sertoli, jouent un rô le important pendant la vie f tale, par la sécrétion de facteurs impliqués dans la régression mü llérienne (hormone antimü llérienne), la morphogenèse des tubes séminifères et la différenciation des gonocytes (De Rooij et al., 1998). L étude de Imagima et al., (1997) suggèrent que le MBP, sous sa forme non conjuguée, principal métabolite du DBP, soit l’agent responsable des effets testiculaires toxiques (Gray et al., 1982).
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Table des matières
Introduction générale
CHAPITRE I- PARTIE THEORIQUE
1. Le Di-n-butyl Phthalate
1.1. Définition et utilisation du DBP
1.2. Les caractères physico-chimiques du DBP
2. Les voies d exposition au DBP
2.1. La voie digestive
2.2. La voie respiratoire
2.3. La voie cutanée
3. Toxicocénitique du DBP
3.1. Absorption
3.2. Distribution
3.3. Métabolisme
3.4. Elimination
4. Toxicité générale du DBP
4.1. Toxicité aiguë
4.2. Toxicité subchronique
4.3. Toxicité chronique
5. Les principaux effets toxiques du DBP
5.1. Effets du DBP sur le foie
5.2. Effets du DBP sur la thyroïde et le système immunitaire
5.3. Effets du DBP sur la reproduction
5.3.1. Chez la femme
5.3.2. Chez l homme
5.3.2.1. Altération de la fonction stéroïdienne
5.3.2.2. Altération de la fonction gamétogénèse
5.4. Effets du DBP sur le développement
5.5. Génotoxicité
5.6. Effet cancérigène
CHAPITRE II-PARTIE MATERIELS & METHODES
1. Matériels
1.1. Matériel biologique
1.2. Condition d élevage
1.3. Classification de l animale
2. Méthodologie
2.1. Traitement (la solution du dosage)
2.2. Protocole expérimentale
3. Préparation des prélèvements
3.1. Prélèvement sanguin
3.2. Prélèvement des organes
4. Etudes de quelques paramètres de la reproduction
4.1. Concentration des spermatozoïdes
4.2. Mobilité des spermatozoïdes
4.3. Vitesse de spermatozoïdes
4.4. Vitalité des spermatozoïdes
4.4.1. Test de coloration vitale des spermatozoïdes
4.4.2. Test du gonflement hypo osmotique des spermatozoïdes
5. Dosage hormonal
5.1. Dosage de la testostérone
6. Dosage des paramètres biochimiques
6.1. Dosage du glucose
6.2. Dosage des protéines totales
6.3. Dosage d albumine
6.4. Dosage des triglycérides
6.5. Dosage du cholestérol
6.6. Dosage de la créatinine
6.7. Dosage de l urée
6.8. Dosage de la bilirubine totale
6.9. Dosage du fer sérique
6.10. Dosage d Aspertate-Aminotransférase
6.11. Dosage d Alanine-Aminotransférase
7. Dosage des paramètres du stress oxydant
7.1. Dosage de l activité enzymatique du glutathion peroxydase (GSH-PX)
7.2. Dosage de malondialdéhyde (MDA)
7. Techniques histologiques
9. Etude statistique
CHAPITRE III-PARTIE RESULTATS
1. Les paramètres de croissance
1.1. Poids corporel
1.2. Poids absolu de certains organes
1.2.1. Poids absolu des testicules
1.2.2. Poids absolu de l épididyme
1.2.3. Poids absolu du foie
1.2.4. Poids absolu des reins
3. Les paramètres hématologiques
4. Etude biologique des spermatozoïdes
4.1. Variation de la concentration des spermatozoïdes (x106/ml)
4.2. Variation du taux de la mobilité des spermatozoïdes (%)
4.3. Variation de la vitesse des spermatozoïdes (µm/sec)
4.4. Variation de la vitalité des spermatozoïdes (%)
4.4.1. Coloration vitale des spermatozoïdes
4.4.2. Les malformations morphologiques des spermatozoïdes
5. Paramètre hormonal
5.1. Variation du taux plasmatique de la testostérone
6. Etude biochimique
6.1. Taux plasmatique du glucose
6.2. Taux plasmatique des protéines totales
6.3. Taux plasmatique d albumine
6.4. Taux plasmatique des triglycérides
6.5. Taux plasmatique du cholestérol
6.6. Taux plasmatique de la créatinine
6.7. Taux plasmatique de l urée
6.8. Taux plasmatique de la bilirubine totale
6.9. Taux plasmatique du fer sérique
6.10. Taux sérique d Aspertate-Aminotransférase
6.11. Taux sérique d Alanine-Aminotransférase
7. Etude des paramètres du stress oxydant
7.1. Taux du glutathion peroxydase (GSH-px) dans l épididyme
7.2. Taux de malondialdéhyde (MDA) dans l épididyme
8. Etude histologique
8.1. Etude histologique des testicules
8.2. Etude histologique de l épididyme
8.3. Etude histologique du foie
CHAPITRE IV-DISCUSSION
Discussion
Conclusions générales et perspectives
Références bibliographiques
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