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Utilisation des additifs nitrés dans la charcuterie et risques associés à leur présence
Les nitrites de sodium et de potassium sont des additifs alimentaires utilisés intentionnellement dans la charcuterie pour améliorer le gout, la couleur et inhiber le développement de certaines bactéries.
Selon le Codex, l’additif alimentaire se définit comme toute substance qui n’est pas normalement consommée en tant que denrée alimentaire, ni utilisée normalement comme ingrédient caractéristique d’une denrée alimentaire qu’elle ait ou non une valeur nutritive, et dont l’addition intentionnelle à une denrée alimentaire dans un but technologique (y compris organoleptique) à une étape quelconque de la fabrication, de la transformation, de la préparation, du traitement, du conditionnement, de l’emballage, du transport ou de l’entreposage de la dite denrée entraine, ou peut, selon toute vraisemblance, entrainer directement ou indirectement) son incorporation ou celle de ses dérivés dans cette denrée ou en affecter d’une autre façon les caractéristiques (Codex, 1995)
Le nitrite de sodium est classé par la commission du Codex alimentarius dans le groupe des additifs alimentaires conservateurs et fixateurs de couleur et lui a attribué un numéro SIN E251 pour le système international de numérotation.
Effet sur la couleur, le goût et la qualité microbiologique
Lorsque du sel nitré est ajouté à la charcuterie, l’ion nitrite NO2 se fixe lui-même sur la myoglobine de la viande formant une nitroso-metmyoglobine de couleur brune. En condition anaérobie, la nitroso-metmyoglobine peut ensuite être convertie lentement en nitrosomyoglobine de couleur rouge sombre.
Lorsqu’elle est soumise à la chaleur, cette nitrosomyoglobine se transforme en nitroso-hemochrome de couleur rose. Ainsi après salaison, la viande peut avoir plusieurs teintes : brune, rouge sombre, rose, la couleur dépendant de la concentration des pigments héminiques et de leur état chimique (Parthasarathy et al., 2012).
L’ajout de nitrate ou de nitrite à la viande s’accompagne de réactions enzymatiques de protéolyse et de lipolyse responsables de la formation de composés sapides (Durand et al., 1989).
L’action des nitrites sur les microorganismes résulte de la formation intracellulaire de monoxyde d’azote qui bloque la croissance de la cellule microbienne. Le pouvoir antimicrobien des nitrites est reconnu à l’égard d’un grand nombre de souches bactériennes notamment les Clostridium (Mescle, 2002).
Toxicologie des nitrites
Les études de cinétique et de métabolisme sont compliquées du fait que le nitrite est également synthétisé par voie endogène indépendamment des sources d’aliments ou d’eau potable.
Apres leur ingestion via les aliments ou l’eau, les nitrates et les nitrites sont rapidement absorbés dans l’intestin grêle et transportés dans le sang avec une biodisponibilité d’au moins 92 % (Mensinga et al., 2003). Les nitrates et nitrites absorbés sont remis sélectivement en circulation par les glandes salivaires.
Les concentrations plasmatiques de nitrite sont normalement plus basses que celles des nitrates en raison de la plus faible exposition et de la ré oxydation du nitrite en nitrate par l’hémoglobine oxygénée dans le sang.
Sur les 25 % du nitrate exogène, 20 % sont réduits en nitrite par les bactéries buccales (Walker, 1996). Lorsque la salive est avalée, l’estomac réduit le nitrite salivaire en acide nitreux, puis en oxyde d’azote notamment en oxyde nitrique (Lundberg et al., 2004, 2008). Cet oxyde d’azote peut se fixer au niveau de l’hémoglobine et former de la méthémoglobine bloquant ainsi la fixation de l’oxygène et par conséquent l’oxygénation des tissus.
Les nitrites peuvent aussi engendrer in vivo, par réaction avec les amines secondaires, des nitrosamines dont certains sont connus pour leur pouvoir cancérigènes (Magee et Barnes, 1956). Chez les humains, quelle que soit la dose ingérée, l’élimination des nitrites est essentiellement rénale.
Effets des nitrates et des nitrites chez l’homme
Une vaste gamme de doses orales de nitrates et nitrites létales pour l’homme est rapportée et est probablement due à la grande variabilité de la sensibilité individuelle. La dose orale létale estimée pour les nitrites est comprise entre 1,6 et 9,5 g.
La méthémoglobinémie est l’effet indésirable le plus signalé de l’exposition au nitrite. Certains groupes d’individus sont particulièrement susceptibles à la formation de méthémoglobine notamment les fœtus, les nourrissons de moins de 6 mois et les sujets présentant un déficit génétique en NADH-cytochrome b5-méthémoglobine réductase.
Ward et al. (2010) ont observé que la prévalence de l’hypothyroïdie était de 24 % plus élevée chez les femmes dans le quartile le plus élevé pour l’apport en nitrates. Parallèlement, une étude de Kilfoy et al. (2010) a mis en évidence un lien statistique entre les apports en nitrates et le risque de cancer de la thyroïde chez l’homme. Un rapport de Santé Canada établit en 2013, a indiqué que l’exposition aux nitrates altère la fonction thyroïdienne humaine en inhibant de façon compétitive l’absorption de l’iodure par la thyroïde, ce qui diminue la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Toujours selon Santé Canada (2013), il existe une association entre l’apport en composés contenant de l’azote et le risque de diabète insuline dépendant de type 1.
Le principal problème associé à l’exposition prolongée aux nitrites est la formation de composés N-nitroso dont bon nombre sont cancérigènes. A pH bas, les nitrites peuvent entrer dans des réactions de nitrosation formant alors des nitrosamines ou des nitrosamides (Honickel, 2008). La sécrétion acide chlorhydrique dans l’estomac diminue le pH à 2. Ces conditions favorisent la formation de nitrosamines et de nitosamides au niveau gastrique (Kuhnle et al, 2007).
Les nitrosamides, cancérigènes puissants, sont des agents alkylants directs qui agissent sur le site de formation ou d’application. C’est pourquoi elles sont capables de former des adduits avec l’ADN sur leur site de formation (Vermeer et Maanen, 2001). Les nitrosamines quant à elles exercent leur pouvoir cancérigène suite à une activation métabolique prônée par les oxydases à fonction mixte microsomales (Mirvish, 1995 et Gangolli et al., 1994). Leur action se fait donc essentiellement via la formation d’intermédiaires qui réagissent avec les groupes nucléophiles des macromolécules cellulaires telles que l’ADN, l’ARN et les protéines (Montesano et Bartsch, 1976).
Ainsi, la détermination des taux de nitrite contenus dans la charcuterie est essentielle pour une bonne prévention de leurs effets nocifs pour les consommateurs. De nombreuses techniques de dosage des additifs nitrés dans les produits à base de viande sont élaborées.
Dosage des nitrites
Plusieurs méthodes de dosage des nitrites existent, la plupart repose sur la réaction de Griess. Le principe de cette réaction est basé sur la formation d’un composé azoïque en présence d’acide sulfanilique et de N-naphtyléthylènediamine.
Le groupe du Comité Européen de Normalisation chargé des nitrites a recensé une vingtaine de méthodes différentes dont les 2 tiers sont des variantes de la méthode de Griess. A l’issu de six années de travail, ce groupe n’a pas réussi à normaliser une méthode multi matrice pour remplacer la méthode de Griess dite horizontale applicable à tous les types de produit alimentaires (Riz, 1995).
L’une des méthodes de dosage des nitrites dans les produits carnés retenue par le CNE selon la norme NF ENV 12014-3 repose sur la réaction de Griess et est validée pour une teneur en nitrite comprise entre 10 à 50 mg/kg (Riz et Guillard, 1999).
La méthode de référence ISO/dis 2918 de dosage des nitrites dans la viande et les produits à base de viande traitée mise au point par le codex depuis 1975 utilise également la réaction de Griess. Dans notre étude, la méthode de quantification utilisée repose sur le principe de la réaction de Griess dont les différentes étapes seront explicitées dans la méthodologie.
Règlementation sur l’emploi des nitrites dans les produits carnés
Codex alimentarius
La commission du Codex alimentarius à travers le comité mixte FAO/OMS d’experts sur les additifs alimentaires fixe les niveaux admissibles de nitrates ( comme source de nitrites) dans les produits de viande et de volaille entre 250 et 500 mg/kg.
Cependant, la norme codex sur les additifs alimentaires établie depuis 1995, suggérait d’adopter en 2014 pour les nitrites dans les produits de viande transformés une limite maximale de 80mg/kg. La norme codex pour le jambon cuit codex stand 96 1981 fixe les limites de nitrite aux valeurs du tableau III.
Union européenne
La directive 95/2/CE limitait les nitrites dans les produits de viande à 150 mg/kg La législation européenne sous la détective 95/2 de l’union européenne suggère de limiter les additifs et impose une limite résiduelle de 250 mg de nitrates par kg de viande. Le tableau IV suivant donne les valeurs limites fixées par l’Union Européenne.
Sénégal et UEMOA
Au Sénégal, il n’existe pas encore de texte règlementaire sur les produits de charcuterie. En effet selon Diouf et al. (2011), les produits carnés sont entourés par un vide juridique.
L’analyse des textes du Sénégal montre qu’ils sont muets sur l’utilisation des additifs alimentaires dans les denrées d’origine animale en général et en particuliers dans les produits à base de viande.
L’UEMOA quant à elle dispose d’un règlement n°0072007/CM/UEMOA qui ne cite pas nommément les additifs alimentaires. Néanmoins, l’article 5 dudit règlement précise que les états membres fondent leurs mesures sanitaires sur les normes, directives et autres recommandations internationales notamment celles du Codex alimentarius.
Prélèvements et transport des échantillons
Pour le saucisson, les 2 premières marques (A et B) ont été achetées dans le même magasin et ont été prélevées au niveau du rayon de charcuterie-boucherie. Il s’agit d’échantillons obtenus à l’aide d’une trancheuse et conditionnés par le charcutier dans un papier spécial. Leur poids était de 100 g chacun. La troisième marque de saucisson (C) a été achetée dans un autre magasin. Elle était conditionnée dans un boyau en plastique et conservée au réfrigérateur, son poids était de 500 g.
Pour les jambons, les 3 marques ont été achetées dans le même magasin et conditionnées de la même manière que les 2 premières marques de saucissons. Leurs poids étaient aussi de 100 g.
Pour les merguez, les deux marques étudiées ont été déjà conditionnées dans des plateaux fermés à l’aide de para film et ont été prélevées des réfrigérateurs des magasins. Elles avaient un poids de 500 g chacune.
Tous les échantillons ont été transportés dans un sachet en plastique en moins de 15 mn au laboratoire et ont été conservés à +4°C durant toute la période d’analyse.
Matériel et méthode
Matériel
Le matériel utilisé pour la préparation des échantillons et le dosage des ions nitrites comprenait :
– une balance
– un mortier et un pilon
– des fioles jaugées de 100 ml
– des fioles jaugées de 25 ml
– des pipettes de 2 ml, 10 ml
– un entonnoir
– du papier filtre
– des erlen meyer
– un agitateur électrique
– des cuves à spectrophotométrie
– et un spectrophotomètre
Le spectrophotomètre utilisé est un UV-visible de marque Cary 60. Il est couplé à un logiciel de traitement de données Cary win UV. Cet appareil permet de mesurer l’absorbance d’une solution à une longueur d’onde donnée ou sur une région donnée du spectre. L’absorbance est directement proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se déplacer à la longueur d’onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux. Le spectrophotomètre possède une gamme spectrale allant de 180 à 1100 nm, avec une précision de 0,5 nm. Il possède 2 détecteurs de diodes en silicium. La précision photométrique est de 0,005 pour l’absorbance.
Méthodologie
Préparation des échantillons
Pour chaque marque, trois échantillons provenant de trois tranches différentes du même produit sont prélevées. Chaque charcuterie est découpée aseptiquement à l’aide d’un couteau en petit morceaux puis 2 à 5 g sont pesés et mis dans un flacon en verre hermétiquement fermé à l’aide de para film puis numéroté selon un code pour faciliter l’identification. Au total, 24 échantillons sont obtenus.
Préparation des réactifs
Les réactifs sont préparés extemporanément pour chaque manipulation.
Ferrocyanure de potassium à 15 %
Le ferrocyanure de potassium à 15 % est obtenu par dissolution de 15 mg de ferrocyanure de potassium dans 100 ml d’eau distillée.
Sulfate de zinc à 20 %
Le sulfate de zinc à 20 % est préparé par dissolution de 20 mg de sulfate de zinc dans 100 ml d’eau distillée.
Réactif de Saltzman (réactif des ions nitrites)
La préparation du réactif des ions nitrites est effectuée de la manière suivante : après dissolution de 2,5 g d’acide sulfanilique dans 400 ml d’eau distillée, 70 ml d’acide acétique concentré et 10 ml de la solution aqueuse de N-naphtyle-éthylenediamine à 0,1% (10 mg dans 10 ml) ont été ajoutés à la préparation. De l’eau distillée a ensuite été utilisée dans le but d’obtenir un volume final de 500 ml.
Méthode d’analyse chimique
Principe du dosage des ions nitrites : Réaction de Griess
Le principe de cette méthode repose sur la formation d’un complexe coloré par réaction de diazotation entre l’ion nitrite, une amine primaire aromatique, la sulfanilamide et une autre amine aromatique, le dihydrochlorure de N-(1-naphtyl)-éthylene diamine (NED).
La réaction de Griess se produit en 2 étapes : l’ion nitrite réagit avec l’acide sulfanilique pour former un composé diazoique (sel de diazonium) qui se combine ensuite en milieu acide (ph inférieur à 2) avec le NED pour former un composé rosé dont l’absorbance à540 nm est proportionnelle à la concentration en ions nitrites.
Mode opératoire
L’échantillon prélevé est broyé au mortier avec 3 fois 20 ml d’eau distillée. Avant l’ajout de la deuxième fraction d’eau distillée mais également de la troisième, le surnageant est transvasé dans une fiole de 100 ml. Lors de la dernière phase de trituration, 20 ml d’eau distillée sont à nouveau utilisés, puis le surnageant et le broyat sont transvasés dans la fiole, un volume final de 100 ml sera obtenu après ajout d’eau distillée. L’extrait est agité 15 mn sur un agitateur électrique. Apres décantation, 20 ml de surnageant sont transvasés dans une fiole de 25 ml. 1 ml de ferrocyanure de potassium à 15 % et 1 ml de sulfate de zinc à 20 % y sont par la suite ajoutés. La solution ainsi obtenue est agitée pendant quelques secondes puis complétée à 25 ml avec de l’eau distillée. Apres filtration, 5 ml de cet extrait final sont mis en réaction dans un tube à essai avec 5 ml de réactif de Saltzman. Les absorbances et les concentrations sont lues au spectrophotomètre après 20 mn de coloration.
Discussion
L’emploi des nitrites comme conservateurs des produits de viande est essentiel à leur bonne qualité organoleptique et microbiologique. Malgré leur rôle important pour assurer une sécurité et une durée de vie meilleures à la charcuterie, les nitrites ne sont pas sans risque pour la santé des consommateurs. Ces additifs font l’objet de règlementation dans beaucoup de pays européens. Cependant, la plupart des états africains en particulier le Sénégal ne disposent pas de loi relative à la bonne utilisation des nitrites en dépit d’une production locale non négligeable des produits de charcuterie. Notre travail a porté sur la détermination des niveaux résiduels de nitrite de sodium de divers produits de charcuterie commercialisés à Dakar, avec pour objectif l’évaluation de la teneur en nitrites dans trois matrices de charcuterie à savoir le saucisson, le jambon et la merguez.
Le principe de la méthode utilisée repose sur la réaction de Griess qui est une réaction de diazotation par les nitrites de l’acide sulfanilique. Il se forme un sel de diazonium qui est ensuite couplé avec une amine (réaction avec le N-naphtyléthylene diamine), ce qui donne un composé azoïque rose qui absorbe à 540nm.
Beaucoup de méthodes de dosage des nitrites dans la viande utilisent la réaction de Griess. C’est le cas de la méthode de référence iso/dis 2918 pour le dosage des nitrites dans la viande et les produits à base de viande traitée et aussi de la méthode 973.31 de l’association of official analytical chemist qui est une méthode colorimétrique de dosage des nitrites dans les produits carnés.
Ces diverses méthodes sont différenciées par la technique d’extraction des nitrites de la matrice à étudier qui influe sur la quantité de nitrites libres.
Dans notre étude, l’extraction est effectuée à température ambiante avec 100 ml d’eau distillée avec adjonction de ferrocyanure de potassium et de sulfate de zinc pour enlever les graisses et clarifier la solution à doser.
Dans le cas où ce sont des sels de nitrate qui sont employés lors de la fabrication, ces derniers sont réduits en nitrites par le nitrate réductase des bactéries de la charcuterie. Des nitrates libres peuvent encore être présents et le dosage nécessite alors une réduction préalable de ces nitrates en nitrites.
D’autre part, une étude des niveaux résiduels de nitrites des produits de viande salés conduite en Roumanie par Lonescu et al.(2006) a montré qu’une extraction alcaline avec l’eau distillée et une solution de NaOH à 2 % conduit à des teneurs résiduelles en nitrites plus élevées par rapport à la méthode de référence. Ainsi, la méthode d’extraction du nitrite du substrat a un rôle décisif sur la quantification des niveaux résiduels.
La courbe de calibration de la méthode employée est réalisée par l’utilisation d’une gamme d’étalonnage composée de 5 standards de concentration comprise entre 0 et 100 mg/L de nitrite de sodium. La gamme d’étalonnage est validée avec un coefficient de corrélation (r2= 0,838998). La gamme a permis d’avoir une courbe d’étalonnage à partir de laquelle sont calculées les différentes concentrations en nitrites des échantillons.
Les résultats obtenus sont validés par le test de Cochran qui compare les variances des valeurs inter jours des mêmes extraits. Pour les saucissons, le test de Cochran donne une valeur de 0,67 pour la marque A, 0,52 pour la marque B et 0,5 pour la marque C. Les tests de Cochran des échantillons de jambon sont de 0,6 pour A, 0,7 pour B et 0,51 pour C. Les valeurs obtenues pour les merguez sont respectivement de 0,55 et 0,95 pour les marques A et C.
Ces valeurs sont toutes inférieures à 1, ce qui signifie que les tests sont non aberrants. La détermination des teneurs en nitrites dans les différentes charcuteries étudiées est effectuée dans trois échantillons du même produit pour chaque matrice.
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Table des matières
Introduction
Première partie
I. Quelques aspects nutritionnels des produits de charcuterie et impacts sanitaires decoulant de leur consommation régulière
II. Utilisation des additifs nitres dans la charcuterie et risques associes à leur présence
II.1. Effet sur la couleur, le gout et la qualité microbiologique
II.2. Toxicologie des nitrites
II.3. Effets des nitrates et des nitrites chez l’homme
III. Dosage des nitrites
IV. Règlementation sur l’emploi des nitrites dans les produits carnés
IV.1. Cas du Codex alimentarius
IV.2. Cas de l’union européenne
IV.3. Cas de l’UEMOA et du Sénégal
Deuxième partie
I. Prélèvements et transport des échantillons
II. Matériel et méthode
II.1. Matériel
II.2. Méthodologie
II.2.1 Analyse chimique
II.2.2.Préparation des réactifs
II.2.3.Méthode d’analyse chimique
III. Résultats
III.1. Dosage des nitrites dans les différents échantillons de saucisson
III.2. Dosage des nitrites dans les échantillons de jambon
III.3. Dosage des nitrites dans les échantillons de merguez
Discussion
Conclusion
Bibliographie
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