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Criblage phytochimique
La détermination qualitative des différentes familles chimiques contenues dans les différents extraits de la plante a été effectuée rpacriblage phytochimique selon la méthode de FONG (1977). Ce criblage est basé soit sur la réaction de précipitation par la formation de complexes insolubles, soit sur la réaction de coloration par la formation de complexes colorés, en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque amillef chimique (Tableau I).
Pour quantifier les familles chimiques, leur absence (-) ou leur présence à l’état de trace (+) ou à moyenne concentration (++) ou à forte concentr ation (+++), ont été notées.
Animaux d’expérience
Des rats de souche WISTAR pesant entre 200 à 250g et des souris de souche SWISS pesant en moyenne 30 grammes de sexe mâle ou femell e ont été utilisés pour tous les tests in vivo. Les animaux ont été mis à jeun 24 heures avant chaque expérience mais ont eu accès libre à l’eau pour la commodité des examens de l’estomac.
Pour les tests in vitro, des cellules leucémiques P 388 prélevées sur des souris atteintes de cancer de sang ont été utilisées.
Etude de l’activité antiulcéreuse
Les produits ont été administrés par voie orale etle volume administré a été fixé à 1ml/100g de poids corporel pour les rats et 0,5ml/30g de poids corporel pour les souris.
Ulcère provoqué par l’éthanol 95 % chez leatr
L’objectif de cette expérience est de mettre en évidence et d’évaluer l’activité antiulcéreuse de E.A en provoquant des ulcères au niveau de la muqueuse stomacale du rat par un agent agressif qui est l’éthanol 95% (MORIMOTO et coll., 1991 ; Al-BEKAIRI et coll., 1992 ; HIRUMA-LIMA et coll., 2000 ; SAIRAM et coll., 2002).
Six lots de 6 rats ont été utilisés, un lot témoinareçu de l’eau distillée et un autre lot a reçu de l’Oméprazol (OMIZEC*) à dose de 20mg /kg utilisée comme produit de référence.
Les 4 autres lots ont été traités par E.A aux dosesde 125, 250,500 et 750mg/kg de poids. Une heure après l’administration des produits, les animaux ont reçu 1ml d’éthanol (95%) par voie orale (SAIRAM et coll., 2002).
Une heure après l’administration de l’éthanol, les animaux ont été sacrifiés. Leur estomac a été prélevé, ouvert suivant la grande courbure, étalé pour faciliter la mesure de l’hyperhémie gastrique.
Les résultats ont été exprimés par la moyenne de longueurla des hyperhémies en divisant leur longueur totale au niveau de la muqueuse stomacale par le nombre d’animaux dans chaque lot. La moyenne a été utilisée pour calculer le pourcentage d’inhibition des hyperhémies observées chez les animaux traités par rapport auxanimaux témoins.
Etude de l’activité cytotoxique
L’objectif de ce test était de mettre en évidence ni vitro le ou les extraits de HX ayant une activité cytotoxique sur des cellules hématopoïétiques P 388 de la leucémie de souris sensibles à la doxorubicine ( WINCKLER J., 1974 ; BORENFREUND E. et coll., 1985 ; TEEPE R.G.C. et coll., 1993).Ces cellules ont été rélevép chez des souris atteintes de leucémie. Ce sont des cellules qui poussent en suspension dans un milieu de culture adéquat qui n’est autre que du RPMI, du sérum de veau fœtal (SVF) et du betamercaptoéthanol. La cryoconsérvation a été réalisé sur des cellules parfaiten état morphologique dans un milieu RPMI avec 10% DMSO et 90% SVF.
Etude expérimentale de l’apoptose (Zhou N. et coll. 1997)
Les résultats obtenus après un test de cytotoxicitéd’un produit (ou d’un extrait de plantes) peuvent être positifs (produit cytotoxique) ou négatifs. Les réponses positives qui se traduisent par la mort des cellules peuvent être no spécifiques (résultats « faux positifs ») ou alors spécifiques (résultats biologiquement significatifs). Dans le premier cas, ce sont les cellules qui sont tuées directement et on parle de réaction de nécrose. Dans le deuxième cas, la mortalité des cellules intervient après un déclenchement de programme (synthèse de DNAse) de mort cellulaire appelé apoptose ( en quelque sorte, la cellule se suicide).
Dans le cas de la nécrose, les modifications cellulaires se situent essentiellement au niveau de la membrane cytoplasmique et le noyau est peu affecté. Dans le cas de l’apoptose, le dommage principal et spécifique est une fragmentation des chromosomes et de l’ADN.
Le principe de l’expérience consiste donc à confirmer la cytotoxicité d’un produit par la mise en évidence de la réaction spécifique d’apoptose etpar conséquent la fragmentation de l’ADN cellulaire. Il y a réaction d’apoptose lorsque l’on observe une migration de différents fragments de DNA des cellules tuées à l’électrophorèse sur gel d’agarose (Photographie 14). Les DNA des cellules non tuées ne sont pas fragmentés et ne pourront pas migrer. Ils resteront au niveau du dépôt.
Etude de la toxicité aiguë
Des études de toxicité aigüe ont été réalisées surles souris de souche SWISS pesant en moyenne 30 grammes (SOUZA et coll., 1998 ; BLANCA et coll., 2004). Quatre lots de 6 souris ont été mis à jeun 12 heures avant l’expérience. Les animaux des 3 lots traités ont reçu en une seule administration de E.A aux doses respectives de 1000, 2000, et 3000 mg/kg tandis que le lot témoin a reçu de l’eau distillée, tous à raison de 0,5ml par 30mg de poids. On a observé soigneusement les animaux à 5, 15, 30minutes et à 1, 2, 4, 6 heures après le traitement. Pendant ces six premières heures d’observation, les animaux n’ont pas reçu d’aliment mais ont eu accès libre à l’eau.
Ils ont été ensuite observés une fois par jour jusqu’au 14è jour. Les signes d’intoxication, la variation de poids corporel, et des observations comportementales ont été enregistrés quotidiennement pendant 14 jours après le traitement (RENATA et coll., 2009). Pendant cette période, ils ont été nourris à volonté avec de larovendep et de l’eau. Expiré ce délai, tous les animaux ont été sacrifiés. Leur estomac a été prélevé et étalé pour observation.
Analyse des résultats
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne±e.s.m. La signification statistique de la différence entre les groupes a été évaluée en employant le test « t » de student.
La valeur de p < 0,05 a été considérée comme significative.
Effet de E.A sur l’ulcère provoqué par unagent ulcérogène
L’administration par voie orale de l’éthanol absoluest nocive pour l’estomac puisqu’il affecte la muqueuse gastrique en perturbant sa barrière et en provoquant des changements microvasculaires prononcés (hyperhémie) quelques minutes après son application (SOLL A.H. ,1990 ; KONTUREK et coll., 1998) (Photographie 9).
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Table des matières
MATERIELS ET METHODES
I – Etude phytochimique
I-1- Matériel végétal
I-2 – Préparation de l’extrait
I-3 – Criblage phytochimique
II – Etude pharmacologique
II-1 – Animaux d’expérience
II-2 – Etude de l’activité antiulcéreuse
II-3 – Etude de l’activité cytotoxique
II-4 – Etude expérimentale de l’apoptose
II-5 – Etude de la toxicité aigüe .
III – Analyse des résultats .
RESULTATS
I – Phytochimie
II – Tests pharmacologiques
II-1 – Effet de l’E.A sur les deux types d’ulcère
II-2 – Effets cytotoxique et apoptotique de EDCM sur les cellules leucémiques P 388 des souris
II-3 – Toxicité aigüe
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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