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Fractionnement liquide – liquide
Dix grammes de l’extrait EHA ont été dissous dans 200 cc d’eau distillée, puis la solution ainsi obtenue a été partitionnée successivement avec 200 cc d’hexane et d’acétate d’éthyle dans une ampoule à décanter. La fraction hexanique ou acétate d’éthyle a été récupérée après décantation et le filtrat obtenu a été évaporé à sec. Le protocole suivi est présenté sur la figure 2 ci-après.
CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
Le but de ce criblage a été de déterminer qualitativement les principales familles chimiques présentes dans l’extrait EHA. La détermination des familles chimiques a été effectuée à l’aide des réactifs spécifiques et leur présence a été mise en évidence par l’apparition de précipité ou le changement de couleur.
La présence de la famille de saponines et celle des glucosides cyanogénétiques a été déterminée sur la poudre d’écorce.
La méthodologie adoptée lors de ce criblage est résumée dans le tableau I.
Diarrhée au sulfate de magnésium
Le test a été effectué dans le but de montrer l’activité des extraits de RAMS sur la diarrhée osmotique provoquée au sulfate de magnésium (DOHERTY, 1981).
Le protocole expérimental a été décrit par GALVEZ, 1993; puis repris par ZAVALA, 1998 et SAIRAM, 2003.
Les animaux ont été repartis en 5 lots de 6 souris. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée à raison de 0,5 ml par animal alors que ceux des lots traités ont reçu soit FA, soit EHA, soit FAE aux doses de 25, 50, 100, 200, 400 ou 600 mg/kg par voie orale. Le lopéramide (IMODIUM ®) a été administré chez le lot référence à la dose de 5 mg/kg par voie orale.
Quarante cinq minutes après l’administration des produits, du sulfate de magnésium à la dose 2g/kg a été administré par voie orale à chaque animal. Puis, chaque animal a été placé dans une cage à métabolisme avec un papier transparent au fond pour pouvoir compter le nombre des fèces molles ou liquide émis.
Le papier placé au fond de la cage a été changé toutes les 60 min. Le nombre total de fèces excrétés par chaque lot de souris, pendant quatre heures a été compté et comparé avec celui du lot témoin montrant 100 % de diarrhée.
Les résultats obtenus ont été exprimés en pourcentage d’inhibition de la diarrhée osmotique (ZAVALA et coll., 1998)
Diarrhée à l’huile de ricin
Pour évaluer l’activité antisécrétoire des extraits, de l’huile de ricin a été administrée chez des souris de race SWISS (AKAH, 1996).
Des souris de deux sexes ont été reparties en 5 lots de 6. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée tandis que ceux des lots traités ont reçu par voie orale les différents extraits EHA, FA et FAE aux doses de 25, 50, 100, 200, 400 ou 600 mg/kg.
Le diphénoxylate (DIARSED®) à la dose de 2,5 mg/kg a été administré par voie orale chez le lot référence (MELO et coll., 1988).
Trente minutes après l’administration des produits, 0,1 ml d’huile de ricin a été administré à chaque animal par voie orale (ZAVALA, 1998 et VITALI, 2005).
Chaque souris a été placée dans une cage à métabolisme. Des papiers transparents ont été placés au fond des cages d’observation pour pouvoir compter le nombre des selles émises.
Quatre heures après administration de l’huile de ricin, le nombre de fèces molles ou liquide excrétées par chaque lot de souris a été compté et comparé avec celui des témoins montrant 100 % de la diarrhée. Les résultats ont été ensuite exprimés en pourcentage d’inhibition de la diarrhée sécrétoire.
Enteropooling induite à l’huile de ricin chez le rat
L’enteropooling est défini comme étant l’accumulation de fluide dans la lumière de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum et iléon) (HAVAGIRAY et coll., 2004).
La méthode a été utilisée dans le but d’évaluer l’activité inhibitrice des extraits sur la sécrétion intestinale en utilisant l’huile de ricin comme agent sécrétoire (GERALD, 2007)
Des rats adultes de deux sexes, de souche WISTAR, pesant en moyenne 200 g ont été utilisés. Ils ont été privés de nourriture 24 heures avant l’expérience mais ont eu accès libre à l’eau.
Trois lots de 5 rats ont été repartis et placés dans des cages à métabolisme individuel. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’agar –agar à 2%, tandis que ceux du lot traité ont reçu par gavage l’extrait EHA dans de l’agar-agar à 2% (dissous dans de l’eau distillée chauffée à 100 °C) aux doses de 25, 50, 100, 200, 400 ou 600 mg/kg. Les animaux du lot référence ont reçu le lopéramide à la dose de 5mg/kg par voie orale.
Une heure après administration des produits, chaque animal a reçu 1 ml d’huile de ricin par voie orale.
Après trente minutes, les animaux ont été sacrifiés et l’intestin (du pylore à la jonction iléo-cæcale) a été soigneusement prélevé. Le volume du contenu intestinal a été collecté dans un tube gradué (ml) et les pourcentages de diminution du volume intestinal ont été calculés.
Test sur le transit intestinal
Ce test a été effectué dans le but de montrer l’activité des extraits de RAMS sur la motilité intestinale en utilisant la suspension du charbon actif comme traceur (IZZO et coll., 2001).
Les souris ont été reparties en lots témoin, traités et référence à raison de 6 souris par lot. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée tandis que ceux de 3 lots traités ont reçu respectivement FA, EHA et FAE aux doses de 25, 50, 100, 200, 400 ou 600 mg/kg administré par voie orale. Le lopéramide a été utilisé comme produit de référence à la dose de 5mk/kg.
Quarante cinq minutes après l’administration des produits, une suspension de charbon actif (10 % de charbon actif mélangé dans 5 % de solution aqueuse d’agar-agar chauffé à 100 °C) a été administrée à raison de 0,2 ml par voie orale à chaque animal (MARCAÏS -COLLADO et coll., 1987 ; BRUN, et coll., 1998).
Vingt minutes après l’ingestion de la suspension du charbon actif, les souris ont été sacrifiées par élongation cervicale. Une laparotomie a été effectuée et l’intestin (du pylore à la jonction iléo-cæcale) a été prélevé. La longueur de l’intestin a été mesurée à l’aide d’une règle graduée (cm) et la distance parcourue par le charbon a été exprimée en pourcentage selon la formule décrite par MUJUMDAR (1998).
Méthode de dilution
Cette méthode a été utilisée pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits de RAMS en mettant en contact les germes bactériennes (Bacillus cereus et Staphylococcus aureus) avec des concentrations croissantes des extraits à tester (MOREL, et coll., 2006).
Des solutions de concentrations allant de 25 mg/ml à 1,56 mg/ml ont été préparées à partir de la solution mère de 50 mg/ml.
Les disques papiers stériles de 6 mm de diamètre ont été imprégnés soit de l’extrait hydroalcoolique, soit de la fraction d’acétate d’éthyle aux concentrations de 25, 12,5, 6,25 et 3,125 mg/ml. Après séchage à l’étuve à 37°C, les disques ont été déposés soigneusement sur la gélose contenue dans les boites de Pétri en contact avec les microorganismes.
Les diamètres d’inhibition ont été mesurés, après 18 heures d’incubation à 37 °C. La CMI est indiquée par la plus faible concentration d’extrait présentant un halo d’inhibition.
TEST DE TOXICITE AIGUË
Ce test a été effectué dans le but de déterminer et quantifier les éventuels effets toxiques des extraits de RAMS chez la souris.
Pour évaluer la toxicité de l’extrait EHA, des souris de race SWISS, mâles ou femelles pesant entre 20 et 25 grammes ont été utilisées. Les animaux ont été répartis en 5 lots de 10 souris. Les souris du lot témoin ont reçu du solvant. Les souris de quatre autres lots ont été traitées avec l’extrait EHA dissous dans un mélange DMSO – eau (5/95) à des doses de 0,8 1,5, 3 et 6 g/kg. Le solvant et l’extrait EHA ont été administrés par voie orale à raison de 0,5 ml par souris. Le DMSO est utilisé dans ce cas pour permettre une bonne dilution des extraits à forte concentration.
Les animaux ont été observés immédiatement après administration des produits puis 30 min, 1h, 2h, 4h, et 6h. Pendant les 6 premières heures d’observation, les animaux n’ont reçu ni nourriture ni eau. L’observation des animaux a été poursuivie 24 h, 48 h et 72 h après l’administration de l’extrait (MALONE et ROBICHAUD, 1962).
SUBSTANCES UTILISEES
Pour les tests in vivo, différents agents diarrhéiques ont été utilisés à savoir le sulfate de magnésium H2O PROLABO, l’huile de ricin de l’Homeopharma et le charbon actif de marque SIGMA (France). Les produits de référence ont été le lopéramide (IMODIUM®) sous forme de gélule provenant du laboratoire G. GAM (France) et le diphénoxylate (DIARSED®) du SANOFI-SYNTHELABO (France).
Les solutions physiologiques utilisées pour les tests sur organes isolés ont été préparées avec des produits PROLABO : NaCl, KCl, MgCl2, NaHCO3, NaH2PO4, CaCl2, glucose. Les Substances de référence utilisées sont des produits de marque SIGMA : Acétylcholine chloride et Histamine dichloride.
ANALYSE STATISTIQUE
Les résultats ont été exprimés en moyenne ± e. s. m. avec n = 6 expériences.
Pour déterminer la signification statistique, le test « t » de student a été utilisé.
La valeur de p < 0,05 a été considérée statistiquement significative.
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Table des matières
MATERIELS ET METHODES
I. TESTS PYHTOCHIMIQUES
1. Matériel végétal
2. Préparation du matériel végétal
2.1. Extraction hydroalcoolique
2.2. Fractionnement liquide – liquide
3. Criblage phytochimique
II. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
1. Animaux d’expérience
2. Tests antidiarrhéiques, in vivo des extraits sur différents modèles de diarrhée expérimentale :
2.1. Diarrhée au Sulfate de magnésium
2.2. Diarrhée à l’huile de ricin
2.3. Enteropooling induite à l’huile de ricin chez le rat
2.4. Test sur le transit intestinal
3. Tests in vitro sur organes isolés
4. Evaluation in vitro de l’activité antibactérienne
5. Test de toxicité aiguë
6. Substances utilisées
7. Analyse statistique
RESULTATS
I. RESULTATS DES TESTS PHYTOCHIMIQUES
1. Rendement des différentes extractions
2. Criblage phytochimique
II. RESULTATS DES TESTS PHARMACOLOGIQUES
1. Tests antidiarrhéiques, in vivo
1.1. Effet inhibiteur des extraits sur la diarrhée au sulfate de magnésium
1.2. Activité inhibitrice des extraits sur la diarrhée à l’huile de ricin
1.3. Activité antientéropoling de l’extrait hydroalcoolique
1.4. Effet inhibiteur des extraits sur le transit intestinal
2. Tests sur organes isolés
2.1. Activité spasmolytique des extraits vis-à-vis de l’acétylcholine sur le duodénum isolé de rat
2.2. Effet spasmolytique de l’extrait hydroalcoolique vis-à-vis de l’histamine sur l’iléon isolé de cobaye.
3. Tests d’activité antibactérienne
3.1. Sensibilité des souches bactériennes
3.2. La concentration minimale inhibitrice
4. Test de toxicité aiguë
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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