Dynamique du cytosquelette de la bordure en brosse des entérocytes

L’épithélium intestinal 

Afin de mieux comprendre l’importance de l’étude des phénomènes de transport ayant lieu au niveau de la muqueuse intestinale, et donc la portée de ce travail de thèse, nous allons voir dans cette première section, la structure de l’intestin humain et son fonctionnement lors de la digestion et de l’absorption des aliments. En effet, l’intestin joue un rôle fondamental dans la digestion des aliments et leur assimilation par l’organisme. C’est là que se produisent les dernières étapes de la digestion et l’essentiel de l’absorption des nutriments (glucides, protides et lipides). L’accomplissement de ces fonctions implique une structure particulière, très spécifique de l’intestin, dont l’élément ultime est la bordure en brosse des entérocytes que nous décrirons également.

L’intestin

Anatomie de l’épithélium
Afin d’augmenter l’efficacité d’assimilation des nutriments, la structure de l’intestin offre une surface d’échange maximale entre les aliments se trouvant dans la lumière intestinale (c’est-à-dire la cavité du tube digestif) et l’épithélium tapissant sa paroi. On distingue trois niveaux d’organisation de la muqueuse intestinale :
– les plis circulaires transversaux de 1 cm de haut (valvules conniventes) ;
– les villosités intestinales de 0.5 à 1 mm de haut ;
– les microvillosités de la bordure en brosse 1 des entérocytes de 1 à 2 m de haut.

Les valvules conniventes sont des replis permanents de la paroi intestinale qui forcent le chyme  à tourner sur lui-même afin de le mélanger avec le suc intestinal (mélange d’enzymes protéolytiques) et permettre l’absorption complète des nutriments.

A la surface de ces plis se trouvent les villosités intestinales, extensions de la muqueuse en forme de doigts, qui comportent en leur coeur un réseau de capillaires sanguins et un vaisseau lymphatique spécialisé appelé vaisseau chylifère. Chaque villosité possède également une bande de muscle lisse lui permettant des contractions et allongements successifs qui augmentent encore l’absorption par un contact accru et font circuler la lymphe des vaisseaux chylifères. Les villosités sont recouvertes d’un épithélium prismatique simple  constitué essentiellement d’entérocytes (80 % des cellules de l’épithélium). Ces cellules comportent la dernière spécialisation structurale augmentant la surface d’absorption : la bordure en brosse. Elle est formée d’une multitude de petites protrusions cytoplasmiques appelées microvillosités.

Les entérocytes sont issus des cellules souches qui se trouvent par groupes de 4 à 16 au fond des cryptes de Lieberkühn  représentées sur la figure I.1.2. Ces cellules forment également par division rapide les trois autres types de cellules de ce tissu :
– les cellules caliciformes, sécrétant du mucus lubrifiant et protégeant la muqueuse ;
– les cellules de Paneth, sécrétant des substances antimicrobiennes dont le lysozyme, une enzyme antibactérienne ;
– les cellules neuroendocrines qui sécrétent des hormones agissant sur la muqueuse, le foie et le pancréas.

Les cellules épithéliales, une fois formées par division des cellules souches, migrent le long des villosités tout en se différenciant  , jusqu’au sommet où elles seront éliminées dans la lumière de l’intestin (desquamation), entraînant le renouvellement de l’épithélium tous les 3 à 6 jours. Le stade de différenciation des entérocytes change donc suivant leur position sur la villosité [Marieb, 1999].

Physiologie de la digestion et absorption 

Nous allons examiner maintenant la transformation des aliments en nutriments assimilables par l’organisme et leur absorption par la muqueuse intestinale. Avant de parvenir à l’intestin, les aliments ont subi des transformations mécaniques et chimiques successives dans la bouche et l’estomac. Dans la bouche a lieu la mastication des aliments (digestion mécanique) et le mélange de ceux-ci à la salive qui contient des enzymes comme l’amylase salivaire amorçant la dégradation des sucres  en fragments plus petits (digestion chimique). Dans l’estomac, la plupart des protéines sont dénaturées par le pH faible du suc gastrique (entre 2 et 3). Des enzymes (la pepsine) commencent la dégradation chimique des protéines tandis que seules certaines molécules comme l’alcool, l’aspirine et d’autres médicaments peuvent être absorbées  .

L’intestin, aidé par le foie, la vésicule biliaire et le pancréas, a donc pour rôle de finir la digestion des sucres, des protéines et de digérer l’essentiel des lipides. Il doit en outre assurer l’absorption de ces nutriments ainsi que celle de l’eau (principalement dans le côlon). Les dernières phases de la digestion se passent à la surface des entérocytes, au niveau de la bordure en brosse où sont présentes de nombreuses enzymes. Toute l’absorption se fait également parla bordure en brosse, d’où l’importance de l’étude des phénomènes de transport ayant lieu dans cette région pour la compréhension de la physiologie de l’intestin et des pathologies éventuelles.

Les sucres non dégradés parl’amylase salivaire le sont par l’amylase pancréatique, puis par les enzymes présentes à la surface des entérocytes comme la dextrinase et la glucoamylase. Une fois transformés en monosaccharides, les sucres pénètrent dans les cellules par co-transport avec les ions sodium, puis sont acheminés aux capillaires sanguins.

Les protéines suivent également une digestion enzymatique qui les dégradent en leurs composants de base, les acides aminés. La première phase se situe dans l’estomac par l’action de la pepsine qui dissocie les protéines en polypeptides et quelques acides aminés libres à hauteur de 10 à 15% des protéines ingérées. Arrivés dans l’intestin, ces polypeptides sont hydrolysés par les enzymes pancréatiques comme la trypsine et la chymotrypsine pour former des polypeptides plus petits. Ceux-ci sont alors scindés en acides aminés simples par la carboxypeptidase, sécrétée par le pancréas, et les enzymes de la bordure en brosse comme la dipeptidase et l’aminopeptidase. Ces acides aminés peuvent être alors absorbés par les entérocytes par transport actif (avec un cotransport des ions sodium). Les dipeptides ou les tripeptides (formés de 2 ou 3 acides aminés, respectivement) peuvent également être absorbés. Ils seront alors dégradés en acides aminés simples par la cellule avant de rejoindre les capillaires sanguins par diffusion.

Les lipides, constitués majoritairement de triglycérides et de triglycérols dans notre alimentation, sont, à leur arrivée dans l’intestin, agglomérés en gros amas graisseux offrant peu de surface d’action aux enzymes lipolytiques (ou lipases). Ils sont donc d’abord transformés en une émulsion stable par l’action des sels biliaires (acide cholique, chénodesoxycholique) qui agissent comme des détergents. Les lipases pancréatiques peuvent ensuite agir sur ces gouttelettes d’environ 1 m de diamètre pour dégrader les lipides en acides gras libres et en monoglycérides. Ceux-ci s’associent aux sels biliaires pour former des micelles qui peuvent, par leur taille, diffuser entre les microvillosités pour entrer en contact avec la membrane plasmique. Une fois dans la cellule, les acides gras libres et les monoglycérides servent à synthétiser des triglycérides dans le réticulum endoplasmique lisse. Ces derniers, combinés à des phospholipides et à du cholestérol, forment, par traitement par l’appareil de Golgi, des chylomicrons, petites gouttelettes hydrosolubles de lipoprotéines, qui migrent ensuite vers le vaisseau chylifère [André et al., 1999, Marieb, 1999].

Les entérocytes

La polarité cellulaire 

Les entérocytes ont comme fonctions principales l’absorption des nutriments et la formation d’une barrière entre la lumière intestinale et l’intérieur de l’organisme. La mise en oeuvre de ces fonctions repose sur une asymétrie morphologique de ces cellules avec une spécialisation de la membrane plasmique, la bordure en brosse, du côté de la lumière intestinale (pôle apical). La partie qui est en contact avec les autres cellules et la matrice extracellulaire est appelée pôle ou domaine basolatéral.

L’asymétrie morphologique des entérocytes s’appuie sur une différence de composition de la membrane plasmique entre les deux domaines, ainsi que sur une asymétrie dans l’organisation du cytosquelette et du cytoplasme. Les entérocytes forment une barrière étanche grâce aux jonctions serrées (zonula occludens) joignant les cellules adjacentes entre elles par un contact très étroit [Zahraoui et al., 2000]. De plus, elles permettent le maintient de l’asymétrie de la composition de la membrane plasmique entre les domaines apical et basolatéral en empêchant les protéines et les lipides de ces deux domaines membranaires de se mélanger, cette ségrégation étant essentielle au bon fonctionnement de la cellule.

Les jonctions serrées font partie d’un complexe jonctionnel  comportant également :
– les jonctions adhérentes (zonula adhaerens), formées de cadhérines, qui servent aussi à réunir les cellules adjacentes entre elles ;
– les desmosomes, sortes de disques formés de protéines transmembranaires, qui servent de liaison entre les cellules ;
– les jonctions communicantes (gap-junctions), constituées de connexines, qui forment des canaux intercellulaires et permettent une communication directe entre les cellules adjacentes.

Dans l’intestin, les jonctions sont présentes dans les entérocytes tout le long des villosités. In vitro, les cellules isolées ne comportent pas de jonctions. Elles se polarisent lorsqu’elles arrivent à confluence, c’est-à-dire quand elles établissent un contact avec leurs voisines, et lors de l’adhésion à un substrat [Yeaman et al., 1999].

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Table des matières

Partie I Introduction
I.1 Contexte biologique
I.1.1 L’épithélium intestinal
I.1.1.1 L’intestin
Anatomie de l’épithélium
Physiologie de la digestion et absorption
I.1.1.2 Les entérocytes
La polarité cellulaire
La bordure en brosse
I.1.2 Dynamique de la bordure en brosse à l’état stationnaire
I.1.2.1 Vers une connaissance de la dynamique de la bordure en brosse
I.1.2.2 Dynamique du cytosquelette d’actine
Dynamique de polymérisation de l’actine in vitro
Dynamique et rôle de l’actine dans les cellules
I.1.2.3 La myosine I de la bordure en brosse
Les myosines I
Structure de BBMI
Cinétique de l’activité ATPase
Interaction avec les membranes lipidiques
Régulation de l’activité in vitro
Rôle de BBMI dans les cellules
I.2 Objectifs de cette étude
I.3 Principes physiques et méthodes expérimentales
I.3.1 La microscopie à deux photons
I.3.1.1 La fluorescence en excitation à deux photons
Rappel sur la fluorescence classique
L’excitation à deux photons
I.3.1.2 Principe d’un microscope à deux photons
Imagerie
Localisation de l’excitation
Profil d’excitation : PSF
Résolution
Collecte de la fluorescence
I.3.1.3 Avantages et applications
Comparaison avec la microscopie confocale
Utilisation en biologie
I.3.2 La technique de FRAP
I.3.2.1 Le photoblanchiment
I.3.2.2 Principe de la méthode
I.3.2.3 Hypothèses et exploitation théorique
Cas diffusif
Cas convectif
Cas diffusif et convectif
Distinction diffusion/convection
I.3.2.4 Limitations de la technique
Le photoblanchiment réversible
I.3.2.5 Applications biologiques
I.3.3 La FRAP en excitation à deux photons
I.3.3.1 Principe
I.3.3.2 Interprétation des expériences
I.3.3.3 Photoblanchiment à deux photons
Partie II Système expérimental
II.1 Modèle biologique
II.1.1 Choix du fluorophore
II.1.1.1 Les différents mutants de la Green Fluorescent Protein (GFP)
II.1.1.2 Comparaison entre EGFP et GFPuv
II.1.2 Modèle cellulaire
II.1.2.1 Les cellules Caco-2
II.1.2.2 Distribution des protéines du cytosquelette dans les cellules utilisées
II.1.2.3 Mesure de la hauteur de la bordure en brosse des cellules Caco-2
II.2 Dispositif expérimental
II.2.1 Le microscope à deux photons
II.2.1.1 Matériel utilisé
Principe du montage
Description du montage
II.2.1.2 Logiciel d’acquisition
II.2.2 Montage expérimental pour la FRAP
II.2.2.1 Matériel spécifique pour la FRAP
Principe
Description du montage
II.2.2.2 Logiciel dédié à la FRAP
Principe du programme
Synchronisation entrées/sorties
II.2.3 Caractérisation de l’instrument
II.2.3.1 Réponse du modulateur électro-optique
Réponse statique
Réponse dynamique
II.2.3.2 Réponse des photomultiplicateurs
Réponse statique
Réponse dynamique
II.2.3.3 Correction de la réponse du modulateur
II.2.3.4 Détermination de la réponse impulsionnelle spatiale (PSF)
II.2.3.5 Limitations et améliorations
Pertes par réflexion
Amélioration du rapport signal sur bruit
II.3 Déroulement des expériences
II.3.1 Réglage de l’instrument
II.3.1.1 Calibration de la puissance
II.3.1.2 Choix des paramètres d’acquisition
II.3.2 Traitement des données brutes
II.3.2.1 Correction des données
II.3.2.2 Normalisation et représentation graphique
Partie III Résultats
III.1 Analyse théorique des expériences de FRAP
III.1.1 Modélisation du système
III.1.1.1 Limitations des modèles existants
Modèle Axelrod (1976)
Modèle Brown (1999)
Critique des hypothèses
III.1.1.2 Géométrie du système
III.1.1.3 Modélisation du photoblanchiment
III.1.1.4 Dynamique des molécules
III.1.1.5 Calcul numérique
III.1.1.6 Simulation des expériences de FRAP
III.1.2 Caractérisation des conditions expérimentales
III.1.2.1 Effet de la durée de la phase de photoblanchiment
Mise en évidence expérimentale
Déplétion en concentration
Partie IV Discussion
Partie V Conclusion

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