DISSECTION DES SPÉCIMENS ET PRÉSERVATION DES TISSUS

DISSECTION DES SPÉCIMENS ET PRÉSERVATION DES TISSUS

Sélection des individus pour les analyses génétiques

Les classes d’âge de 1994 à 2000 ont été sélectionnées pour tester la différenciation génétique temporelle sur les gisements de Chandler et de Bonaventure.
Pour les autres gisements de la baie des Chaleurs, la classe d’âge de 1996 a été choisie pour faire la caractérisation génétique à l’échelle spatiale à l’exception de Percé où seulement des individus plus âgés étaient disponibles. Seulement les échantillons possédant un effectif de plus de 25 individus étaient pris en considération pour les analyses statistiques.
Les individus représentant les autres gisements du Golfe ont été sélectionnés selon la distribution des fréquences de taille disponible dans l’échantillon. Ces individus ont été sélectionnés parmi les classes de taille les mieux représentées afin de réduire le plus possible le nombre de classes présentes dans les analyses. Tous les pétoncles géants du gisement de la baie de Chesapeake ont fait l’objet d’analyses génétiques. Un total de 1394 individus ont été sélectionnés pour les analyses génétiques sur un ensemble de 19 gisements (Tableau 2).

Extraction de l’ADN à partir du tissu musculaire

L’ADN de chaque individu sélectionné a été extrait d’après le protocole pour tissu animal de la compagnie QIAGEN à partir d’environ 15 mg de tissu musculaire préservé dans l’éthanol à 95%. La concentration de l’ADN a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre WPA, modèle UV 1101, à la longueur d’onde de 260 nm. La concentration d’ADN obtenu variait entre 15 et 135 ng/p.\. La solution ct’ ADN ainsi obtenue était conservée dans un réfrigérateur à 4°C pour la durée des analyses.

 Analyses génétiques

Six rnicrosatellites (Pma130, Pma132, Pma135, Pma200, Pma212 et Pma275) ont été amplifiés par Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) suivant les conditions décrites par Gjetvaj et al. (1997). Les caractéristiques de ces marqueurs rnicrosatellites apparaissent au Tableau 3.L’amplification des différents loci a été effectuée en utilisant de 15 à 135 ng d’ADN, 0,2 mM de chacun des dNTP, 0,75 à 0,9 p.M de chacune des amorces, 0,35 U de polymérase (<< Expand High Fidelity Polymerase », Roche Diagnostic) et IX tampon « Expand High Fidelity» avec 1,5 mM MgCh. Un volume total de 10 p.l était utilisé pour amplifier les brins d’ADN comprenant 0,5 p.l d’ADN de chaque individu.
Trois microsatellites, soit Pma130, Pma200 et Pma275, ont été amplifiés à l’ aide d’un thennocycleur de type Robocycler™. Les trois autres microsatellites (PmaJ32 , Pma135 et Pma212) ont été amplifiés à l’aide d’un thennocycleur de type Perkin Elmer™. Une goutte d’huile minérale était ajoutée lors de l’amplification pour empêcher l’évaporation durant la réaction PCR. Pour chacun des loci, une des amorces était marquée à la fluorescence, soit Pma130 (VIC), Pma132 (NED) , Pma135 (VIC), Pma200 (6FAM), Pma212 (6FAM) et Pma275 (NED). Les paramètres de PCR étaient les suivants: pour tous les loci, une dénaturation initiale de 30 secondes à 94°C a été effectuée. Pour Pma130, Pma212 et Pma275, vingt-cinq cycles de 20 secondes à 94°C et 80 secondes à 52°C. Pour le locus Pma200, vingt-cinq cycles de 20 secondes à 94°C et 80 secondes à 50°e. Pour le locus Pma135, vingt-cinq cycles de 20 secondes à 94°C, 20 secondes à 57°C et 30 secondes à 72°e. Finalement, pour le locus Pma132, vingt-cinq cycles de 20 secondes à 94°C, 20 secondes à 50°C et 30 secondes à 72°e.
Les fragments amplifiés ont été séparés par électrophorèse capillaire en utilisant le système automatique d’analyse génétique ABI Prism 31O™ (PE Applied Biosystems).
Un mélange de 12JlI de fonnamide et de 0,2JlI de standard, auquel était ajoutée une quantité (0,2 à 3JlI) des produits de la PCR de chaque individu, était placé dans le séquenceur. Un standard servait de point de référence afin d’établir la taille des allèles, en paire de bases, dans chaque analyse effectuée. Le standard pour les loci Pma130, Pma200 et Pma275 était le 400HD rox, alors que le standard pour les loci Pma132, Pma135 et Pma212 était le 2 500 rox. Le temps d’analyse variait en fonction de la taille des allèles rencontrés aux différents loci. Une durée de 25 minutes était nécessaire pour le standard 400HD rox. Le temps d’analyse pour le standard 2 500 rox était de 40 minutes.
L’identification des allèles a été faite à partir des logiciels GeneScan 3.1.2 / Genotyper 2.5 (Applied Biosystems Division, Perkin Elmer, Poster City, CA) en s’assurant de déterminer les allèles de manière uniforme pour chaque locus. Les catégories des allèles pour les six loci microsatellites utilisés ont été déterminées a partir des résultats bruts obtenus et de la structure du microsatellite. Les premiers résultats ont permis d’établir la répartition des allèles selon leur taille brute par rapport au standard utilisé.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela rapport gratuit propose le téléchargement des modèles gratuits de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie ?avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

Remerciement
RÉSUMÉ
TABLE DES MA TIÈRES
LISTE DES TABLEA UX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ANNEXES 

CHAPITRE 1 INTRODUCTION
CHAPITRE II MATÉRIEL ET MÉTHODE

2.1 ÉCHANTILLONNAGE
2.2 DISSECTION DES SPÉCIMENS ET PRÉSERVATION DES TISSUS
2.3 DÉTERMINATION DE L’ÂGE DE CHAQUE INDIVIDU
2.4 SÉLECTION DES INDIVIDUS POUR LES ANA LYSES GÉNÉTIQUES
2.5 EXTRACTION DE L’ADN À PARTIR DU TISSU MUSCULAIRE
2.6 ANALYSES GÉNÉTIQUES
2.7 ANALYSES STATISTIQUES

A. Déséquilibre de liaison
B. Caractéristiques génétiques des gisements ou classes d ‘âge
C. Variation génétique entre les gisements ou entre les classes d’âge
D. Organisation spatiale ou des classes d’âge
CHAPITRE III RÉSULTATS
3.1 DÉSÉQUILIBRE DE LIAISON
3.2 CARACTÉRISATION ET DIFFÉRENCIATION GÉNÉTIQUE DES CLASSES D’ÂGE 

A. Gisement de Chandler (baie des Chaleurs)
B. Variabilité génétique intra-c1asse d’âge
C. Différenciation génétique entre les classes d’ âge
D. Organisation des classes d’âge
E. Gisement de Bonaventure (baie des ChaLeurs)
F. Variabilité génétique intra-c1asse d’ âge
G. Différenciation génétique entre les classes d’ âge
H. Organisation des classes d’âge
3.3 DIFFÉRENCIATION GÉNÉTIQUE ENTRE LES GISEMENTS DE CHAQUE RÉGION
A. Gisements de la baie des Chaleurs
B. Variabilité génétique intra-gisement
C. Différenciation génétique entre les gisements
D. Gisements des Îles-de-la-Madeleine
E. Variabilité génétique intra-gisement
F. Différenciation génétique entre les gisements
G. Gisements au sud du Golfe
H. Variabilité génétique intra-gisement
I. Différenciation génétique entre les gisements
J. Gisements de la Basse Côte-Nord
K. Variabilité génétique intra-gisement
L. Différenciation génétique entre les gisements
M. Comparaison entre les 19 gisements
N. Organisation spatiale
O. Regroupement par région
P. Variabilité génétique intra-région
Q. Différenciation génétique entre les régions
R. Comparaison géographique à l’aide de quatre microsatellites
CHAPITRE IV DISCUSSION
4.1 VARIATION GÉNÉTIQUE DES CLASSES D’ÂGE
4.2 Variabilité GÉNÉTIQUE AU NIVEAU DES GISEMENTS ET DES RÉGIONS
4.3 VARIATION DANS LE SUCCÈS REPRODUCTEUR
4.4 DÉFICIT EN HÉTÉROZYGOTES
4.5 TRANSFERT D’INDIVIDUS ENTRE RÉGIONS 

CHAPITRE V CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

Rapport PFE, mémoire et thèse PDFTélécharger le rapport complet

Télécharger aussi :

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée. Les champs obligatoires sont indiqués avec *