Diffusion de récepteurs synaptiques à la membrane de neurones 

Mémoire présenté dans le cadre du programme de maîtrise en biophotonique pour l’obtention du grade de Maître en sciences

Introduction générale
Chapitre 1 : Notions préliminaires  
1.1 Diffusion de récepteurs synaptiques à la membrane de neurones
1.1.1 L’équilibre dynamique de la synapse
1.1.2 Sonder la mobilité de protéines
1.1.3 Stimulation neuronale et effet sur les propriétés de diffusion des récepteurs
1.2 Marquage de récepteurs uniques et imagerie des synapses
1.2.1 Imagerie de synapses à travers l’accumulation de protéines fluorescentes
1.2.2 Stratégies pour imager des récepteurs uniques
1.2.3 Utilisation de protéines hameçons et de cibles génétiquement modifiées pour lier spécifiquement la sonde à la cible
1.3 Biofonctionnalisation de nanocristaux fluorescents
1.3.1 Propriétés optiques et cristallines des QDs
1.3.2 Enrobage des QDs avec des molécules hydrophiles
1.3.3 Conjugaison de protéines hameçons pour marquer des récepteurs synaptiques
1.4 Objectifs du projet
Chapitre 2: Suivi de récepteurs synaptiques uniques
2.1 Matériel et méthodes
2.1.1 Transfert de gènes sur modèle de neurones en culture
2.1.2 Marquage des récepteurs avec des QDs fonctionnalisés
2.1.3 Imagerie
2.1.4 Reconstitution hyper-résolutive des trajectoires et identification des synapses
2.2 Analyse des résultats
2.2.1 Quantification du coefficient de diffusion et de la résidence synaptique
2.2.2 Comparaison de l’utilisation de QDs-SAV vs QDs-AB en condition contrôle
2.2.3 Effet de l’application d’un protocole de stimulation neuronale sur les dynamiques des récepteurs
2.3 Discussion sur le suivi de récepteurs synaptiques
2.3.1 Comparaison QDs-SAV et QDs-AB
2.3.2 Effet de la stimulation neuronale sur les dynamiques des récepteurs
2.3.3 Combiner des méthodes hyper-résolutives pour les trajectoires des récepteurs et la localisation des synapses
Chapitre 3: Biofonctionnalisation de points quantiques  
3.1 Matériel et méthodes
3.1.1 Échanges de ligands
3.1.2 Conjugaison de la streptavidine (SAV)
3.1.3 Électrophorèse sur gel d’agarose
3.1.4 Marquage des cellules avec les QDs
3.2 Analyse des résultats
3.2.1 Biofonctionnalisation de QDs DHLA et PEG-DHLA
3.2.2 Biofonctionnalisation de QDs avec des peptides
3.3.3 Marquage d’échantillons biologiques
3.3 Discussion sur la biofonctionnalisation de QDs
3.3.1 Problème de spécificité des petites sondes fonctionnalisées pour marquer des neurones
3.3.2 Retour sur les techniques de biofonctionnalisation abordées
Conclusion générale

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Utilisation de protéines hameçons et de cibles génétiquement

Afin d’étiqueter une protéine à la membrane à partir de l’extérieur de la cellule, il faut avoir un complexe sonde-hameçon qui vient lier spécifiquement un segment extracellulaire de la protéine. Les anticorps (AB) sont sans contredit le type de molécule intermédiaire liant la sonde à la cible le plus répandu pour le suivi de molécules uniques. Par exemple, les premières démonstrations de récepteurs synaptiques diffusants à la membrane de neurones ont été réalisées en utilisant des microbilles de latex enrobées d’AB dirigés contre les récepteurs (2002) [23]. La taille de ces microbilles empêchant les récepteurs d’atteindre la synapse, on a par la suite raffiné la technique de suivi de récepteurs uniques en utilisant des AB couplés à un ou quelques fluorophores organiques (2003) [24], ou encore des QDs enrobés d’AB (2003) [1,2].

Discussion sur le suivi de récepteurs synaptiques

Comparaison QDs-SAV et QDs-AB
Nous aimerions premièrement discuter de l’impact qu’a le choix de la stratégie de marquage sur les dynamiques des récepteurs. En comparant l’utilisation de QDs-SAV à celle de QDs-AB pour le marquage des récepteurs, nous avons remarqué des différences importantes entre les dynamiques des récepteurs marqués. Contrairement à ce qui a été publié dans le passé [16], le simple effet du temps après le marquage a engendré une immobilisation progressive des récepteurs à la synapse ainsi que sur le reste de la membrane pour les récepteurs liés aux QDs-SAV. Pour les récepteurs liés aux QDs-AB, les dynamiques sont restées comparables pour les 4 temps d’acquisition (15 minutes entre le premier et le dernier film). Il est important de souligner que l’utilisation d’un micro- injecteur pour marquer localement le neurone d’intérêt nous a permis de contrôler adéquatement le temps zéro. Avec la méthode d’incubation globale, le long temps d’incubation et la recherche post-marquage d’un neurone d’intérêt auraient introduit une grande variabilité entre le moment du marquage des récepteurs et le moment du premier film.

Conclusion
Un objectif important du projet était de valider l’utilisation de différents types de QDs pour marquer des récepteurs synaptiques sur des neurones en culture. Nous avons pu tester de nouvelles constructions génétiques pour exprimer des récepteurs qui exposent une étiquette biotine au milieu extracellulaire, et marquer spécifiquement ces récepteurs avec des QDs enrobés de streptavidine (SAV). Pour les essais avec les QDs-SAV fonctionnalisés à partir d’une monocouche de ligands de surface (PEG-DHLA et peptides), les marquages sur neurones étaient caractérisés par une majorité d’adhésions non spécifiques. À la lumière de récents tests que nous avons réalisés avec un échantillon du laboratoire du Dr David Ferning, il semblerait que l’utilisation d’un ligand amphiphile composé d’un alcane, de PEG et d’un monothiol permette de fonctionnaliser des QDs très compacts, qui occasionnent beaucoup moins de liaisons non spécifiques sur des neurones en culture.
L’autre objectif majeur était de comparer les dynamiques de récepteurs marqués avec des sondes de différentes tailles et d’évaluer s’il y avait des différences au niveau de l’accessibilité synaptique. Les QDs commerciaux enrobés de SAV sont relativement plus compacts (23 nm contre 35 nm) que les QDs commerciaux avec un échafaudage anticorps primaire-anticorps secondaire, et la comparaison des trajectoires de récepteurs marqués avec ces deux types de sonde a montré qu’en moyenne, on retrouve plus souvent les récepteurs marqués avec des QDs-SAV à la synapse. Ce résultat suggère que les QDs plus compacts ont un meilleur accès à la synapse. En parallèle, l’application d’un protocole de stimulation chimique n’a pas induit une immobilisation synaptique et une augmentation claire de la proportion de temps passé à la synapse pour les récepteurs-QDs-AB. Un mauvais accès synaptique peut être en partie responsable de cette observation.

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