Soutenance mémoire
Le syndrome de Leigh type Canadien-Français est une maladie génétique ayant une prévalence élevée (1/2063) au Saguenay-Lac-Saint-Jean (SLSJ). Celle-ci est caractérisée entre autres par de l’hypotonie, un retard psychomoteur sévère ainsi qu’un taux élevé d’acidose lactique dans le sang principalement lors d’épisodes de crises. C’est dans les années 1980 que le pédiatre Jean Larochelle a remarqué une incidence élevée de patients présentant ces manifestations qui sont semblables au syndrome de Leigh classique. En 1993, suite à ces observations, le Dr Charles Morin et ses collaborateurs ont démontré que cette maladie possède des caractéristiques distinctes du syndrome de Leigh classique. Un défaut dans l’enzyme cytochrome c oxydase (COX) est alors reconnu. En 2003, le gène leucine-rich pentatricopeptide repeat containing (LRPPRC), responsable de la maladie, est identifié ainsi que les deux mutations entraînant une diminution de l’enzyme COX. En 2005, par l’initiative du Dr Charles Morin, pédiatre ayant participé à la découverte de la maladie, et de Pierre Lavoie, père de famille ayant perdu deux enfants du syndrome de Leigh type Canadien-Français, un consortium de recherche est créé regroupant des chercheurs de la région de Montréal et du SLSJ. Celui-ci est d’abord soutenu par la Fondation de l’association de l’acidose lactique, puis en 2008, le groupe obtient une subvention d’équipe émergente des Instituts de recherche en santé du Canada.
PROBLÉMATIQUE EN LIEN AVEC LA MALADIE
La population du Saguenay-Lac-Saint-Jean
La région du SLSJ se caractérise par une prévalence élevée de certaines maladies héréditaires dont la prévalence ailleurs dans le monde est relativement faible (1). La littérature scientifique actuelle tend à appuyer que le profil génétique du SLSJ est dû à un effet fondateur qui se serait répété à trois reprises lors de la colonisation du Québec (1). L’effet fondateur est défini comme étant un phénomène démographique se produisant lorsqu’un certain nombre d’individus migrent hors d’une population mère initiale et se déplacent vers un endroit géographique distinct. Cela a pour conséquence la création d’une nouvelle population qui est moins variable sur le plan génétique que la population d’origine (2). Au Québec, le premier effet fondateur s’est déroulé lors de l’arrivée des colons Français au début du I7ieme siècle. Les premières familles se sont installées dans la ville de Québec puis, certaines d’entre elles ont migré vers le nord et fondèrent la région de Charlevoix. Cette seconde migration est à l’origine du second effet fondateur. Le troisième effet fondateur, quant à lui, s’est produit au I9’eme siècle lors d’un déplacement de certains résidants de Charlevoix vers la région du SLSJ. Ce phénomène est en grande partie responsable de la plus grande homogénéité du bagage génétique de la population du SLSJ comparativement à des populations cosmopolites. Un autre phénomène ayant contribué à augmenter l’incidence de certaines maladies, reconnu comme un effet multiplicateur, est sans doute le nombre élevé d’enfants qu’avaient les femmes à cette époque (3). Un fait intéressant à noter est que la principale raison des déplacements des familles vers des nouvelles terres non habitées était le manque d’espace et de terres cultivables (2).
Le syndrome de Leigh
Le syndrome de Leigh est une maladie mitochondriale causée par un déficit à plusieurs niveaux de la chaîne de transport des électrons (5). Au niveau mondial, une personne sur 40 000 est affectée par cette maladie (6). Le docteur Denis Leigh a décrit cette maladie en 1951 ((http://omim.org/entry/220111). Elle se caractérise par des lésions symétriques dans le cerveau, soit au niveau des noyaux gris, du thalamus et du tronc cérébral ce qui entraîne une neurodégénération progressive du système nerveux central (5, 7). Le système nerveux périphérique est également touché par des neuropathies et des myotonies. De plus, les patients peuvent présenter des cardiomyopathies, des problèmes rénaux ainsi qu’une myopathie sévère (8). Les cliniciens identifient généralement un retard psychomoteur, de la faiblesse musculaire et de l’hypotonie, une ataxie au niveau du tronc et des tremblements (7). De plus, il y a souvent une acidification des liquides corporels tels que l’urine, le sang ou le fluide céphalo-rachidien due à l’augmentation des niveaux de lactate et de pyruvate (7). Bien que tous les patients atteints du syndrome de Leigh aient des manifestations semblables, la cause de cette maladie est très variable au point de vue génétique.
Causes génétiques du syndrome de Leigh
La majorité des cas de syndrome de Leigh observés est causée par des défauts à différents niveaux du processus de production d’énergie dans la mitochondrie (9). En général, un défaut de la chaîne de transport des électrons est en cause. En effet, les complexes I, II, IV et V sont majoritairement responsables du syndrome de Leigh bien que la, maladie a déjà été observée alors que le coenzyme Q ou le complexe pyruvate déshydrogénase avaient une activité réduite (9, 10). La cause la plus fréquente est un déficit dans l’enzyme formant le complexe IV de la chaîne de transport des électrons (11). Celle-ci se nomme la cytochrome c oxydase (COX) et sera décrite à la section 1.4. Des mutations dans le gène surfeit 1 (SURF1), un gène encode au niveau nucléaire, causent la maladie chez une grande partie des patients atteints du syndrome de Leigh (12). SURF1 est responsable de l’assemblage du complexe IV (12). Parfois, des mutations dans les gènes COX10 et COX15, des sous-unités du complexe IV, entraînent des défauts de l’assemblage de COX ce qui peut également causer la maladie (10). Bien que ces quelques gènes soient responsables de la plupart des cas observés, il ne s’agit pas d’une liste exhaustive puisqu’il y aurait près d’une trentaine de gènes pouvant causer le syndrome de Leigh (13). En plus des manifestations au niveau du système nerveux nommées précédemment, les patients présentent une grande faiblesse et un niveau modéré d’acidose lactique (8).
Syndrome de Leigh type Canadien-Français
En 1980, des cas de syndrome de Leigh furent observés au SLSJ par le docteur Jean Larochelle (14). Les enfants atteints présentaient une hypotonie, un retard psychomoteur ainsi qu’une fréquence variable pour les crises d’acidoses métaboliques (15). En 1993, une forme de syndrome de Leigh propre à la région du SLSJ fut décrite par le docteur Charles Morin et ses collaborateurs (15). Cette maladie est appelée aujourd’hui syndrome de Leigh type Canadien-Français et plus communément acidose lactique congénitale due au principal symptôme qu’est la crise acidotique (14). Le taux de porteurs de cette maladie récessive au SLSJ est de 1 personne sur 23 alors qu’un enfant sur 2063 naît avec ce syndrome dans la région annuellement (15).
Différences entre le syndrome de Leigh classique et le type Canadien-Français
Comme il a été mentionné ci-haut, le syndrome de Leigh « classique » peut être causé par un défaut dans l’assemblage de l’enzyme COX (11). Ce défaut est observé dans tous les organes avec une activité de l’enzyme de 25% (8). Comparativement à la version classique du syndrome de Leigh, le type Canadien-Français résulte de la mutation d’un gène spécifique, le « leucin-rich pentatricopeptide repeat containing protein » (LRPPRC) . De plus, il semble que le déficit au niveau de l’enzyme COX n’affecte pas tous les organes avec la même intensité comme il sera vu à la section suivante. Bien que ces deux formes de la maladie présentent des différences au niveau de leurs mécanismes biochimiques, les manifestations observées sont causées par un défaut de l’une des activités essentielles de la cellule, la production d’énergie.
CONCLUSION
La voie de l’hypoxie régulée par HIF-1 est un mécanisme de compensation permettant aux cellules de s’adapter à un changement dans le niveau d’oxygène ambiant pour maintenir une respiration cellulaire efficace. Dans cette étude, il a été proposé que les gènes induits dans l’hypoxie puissent être en cause dans le syndrome de Leigh type Canadien-Français, maladie génétique rare dont la fréquence est élevée au Saguenay LacSaint-Jean. L’hypothèse selon laquelle ces gènes seraient davantage exprimés chez les patients par rapport aux témoins n’a pas été confirmée au niveau génétique. Comme la réponse à l’hypoxie était semblable chez les sujets affectés par la maladie et chez les témoins, l’implication de cette voie dans le contexte du syndrome de Leigh type CanadienFrançais a été rejetée dans les fibroblastes de patients. Les résultats obtenus au niveau protéique n’ont pas permis de se prononcer sur l’implication de cette voie dans le contexte de la maladie. Ils devront donc être refaits en utilisant une protéine contrôle étant invariable d’un patient à l’autre. Malgré cela, il a été noté que la protéine NDUFA4L2 était moins exprimée chez les patients par rapport aux témoins comme le sont les autres protéines composant le complexe IV de la chaîne de transport soulignant son importance dans la maladie. De plus, il a été observé que l’expression de certaines protéines variait d’un patient à l’autre, particulièrement chez l’hétérozygote composé qui a un phénotype très résistant par rapport aux autres malades.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 PROBLÉMATIQUE EN LIEN AVEC LA MALADIE
1.1. La population du Saguenay-Lac-Saint-Jean
1.2. Le syndrome de Leigh
1.2.1. Causes génétiques du syndrome de Leigh
1.3. Syndrome de Leigh type Canadien-Français
1.3.1. Manifestations cliniques
1.3.2. Différences entre le syndrome de Leigh classique et le type CanadienFrançais
1.4. Lacytochrome c oxydase
1.5. Principe de production d’énergie
1.5.1. La voie aérobique
1.5.2. La voie anaérobique
1.6. Crise d’acidose métabolique
1.7. Traitements actuels
1.8. Le syndrome de Leigh type Canadien-Français : une maladie génétique
1.8.1. Identification du gène défectueux
1.8.2. Rôle du gène Leucine-rich pentatricopeptide repeat containing
(LRPPRQ
CHAPITRE 2 MISE EN CONTEXTE DE L’ÉTUDE
2.1. Étude comparative du patron d’expression de fibroblastes d’individus
atteints du syndrome de Leigh type Canadien-Français et de témoins
2.2. NDUFA4L2 : Un gène différemment exprimé dans les fibroblastes de
patients atteints du syndrome de Leigh type Canadien-Français
2.3. La voie de l’hypoxie cellulaire
2.3.1. Principe général
2.3.2. Mécanisme de l’hypoxie
2.3.3. Gènes impliqués dans la réponse à l’hypoxie
2.3.3.1. Gènes régulant le système vasculaire et l’érythropoïèse
2.3.3.2. Gènes régulant le métabolisme énergétique
2.3.4. Pertinence d’étudier la voie de I’hypoxie dans le contexte du syndrome
de Leigh type Canadien-Français
2.3.5. Induction de l’hypoxie par voie chimique
HYPOTHÈSE
OBJECTIFS
CHAPITRE 3 MATÉRIEL ET MÉTHODES
3.1. Principe général de l’étude
3.2. Culture des lignées cellulaires
3.3. Simulation de la condition d’hypoxie ;
3.4. Quantification des protéines
3.4.1. Préparation des échantillons
3.4.1.1. Extraction des protéines
3.4.1.2. Quantification des protéines par spectrophotométrie
3.5. Mesure de la nécrose cellulaire
3.5.1. Principe de la mesure
3.5.2. Démarche expérimentale
3.6. Mesure de l’expression génique
3.6.1. Culture cellulaire pour les essais
3.6.2. Extraction de l’ARN messager
3.6.3. Transcription inverse
3.6.4. Réaction de PCR en temps réel
3.7. Analyses statistiques
CHAPITRE 4 RÉSULTATS
4.1. Détermination de la dose de chlorure de cobalt et de sa toxicité
4.2. Mesure de l’expression des gènes de la voie de l’hypoxie
4.2.1. Résultat du traitement sur l’expression du gène NADH dehydrogénase
(ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 4-like 2
4.2.2. Résultat du traitement sur l’expression du gène hypoxia-inductible
factor 1-a
4.2.3. Résultat du traitement sur l’expression du gène cytochrome c oxydase
subunit IV isoform 2
4.2.4. Résultat du traitement sur l’expression du gènepyruvate
déshydrogénase kinase 1
CHAPITRE 5 DISCUSSION
5.1. Réduction de la cytotoxicité en fonction de la dose de chlorure de cobalt
5.2. Effet de l’hypoxie sur l’expression des gènes de la voie de l’hypoxie
5.2.1. Variation de l’expression de NADH dehydrogénase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 4-like 2 selon les patients
5.2.2. Stabilisation de la sous-unité alpha en hypoxie
5.2.3. Cytochrome c oxydase isoforme 2
5.2.4. Pyruvate déshydrogénase kinase 1
5.3. Limites de cette étude
5.4. Études d’expression par puces à ADN
CONCLUSION
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