Soutenance mémoire
Diagnostic moléculaire chez l’hôte intermédiaire
Caractéristiques morphologiques de la paroi des kystes
Les kystes sarcosporidiens sont contenus dans une vacuole parasitophore dans le cytoplasme de la cellule hôte (Chen et al., 2011). Sous la membrane de la vacuole parasitophore se trouve une couche de substance fondamentale, dense aux électrons (Dubey, Fayer, Speer, 1988). Chez S. hirsuta, elle a une épaisseur de 0,7 à 1 μm (Bowman, Hendrix, Lindsay, Barr, 2002). Et pour S. hominis, 1,5 μm (Domenis et al., 2011). L’ensemble de ces deux structures forme la paroi kystique primaire, celle-ci change avec l’âge du kyste sarcosporidien (Lindsay, Blagburn, Braund, 1995). Les
septa issus de cette couche de substance fondamentale séparent le kyste en différents compartiments remplis de bradyzoïtes et de mérozoïtes. On trouve également une paroi secondaire d’origine adventitielle (Euzéby 1997).
La paroi primaire porte, sur sa face externe, des formations digitiformes, appelées “cytophanères”, dont la disposition est propre à chaque espèce de sarcosporidies (Euzéby 1997). La paroi des kystes de S. cruzi présente des formations capilliformes au microscope électronique à transmission. On constate que la paroi des kystes de S. hirsuta présente des villosités en forme de doigts de gant, d’une longueur de 0,6-1,2 μm et d’une largeur de 0,3-0,4 μm (Bowman et al. 2002) donnant l’aspect d’une bordure ciliée. La paroi a une épaisseur de 5 μm (Pena, Ogassawara, Sinhorin, 2001). On constate également que la paroi des kystes de S. hominis présente des formations arrangées en palissade couvrant la surface du kyste, d’une longueur d’environ 6,8 μm et d’une largeur d’environ 1 μm (Domenis et al., 2011). La paroi a une épaisseur de 6,3 à 8,8 μm (Pena, Ogassawara, Sinhorin, 2001).
L’IHAT (Indirect Haemagglutination Antibody Test)
L’hémagglutination indirecte (Lunde, Fayer, 1977) est réalisée avec des érythrocytes de mouton « sensibilisés », c’est-à-dire ayant été mis en contact auparavant avec des antigènes de Sarcocystis spp., et du sérum de bovin dans des puits de plaques de micro-titration.
Le test utilise des antigènes issus des bradyzoïtes et des mérozoïtes. Ils sont libérés des kystes par une technique de digestion utilisant une solution à base de pepsine et de HCl à 37°C sous agitation magnétique. Puis, la solution de mérozoïtes et de bradyzoïtes est centrifugée à 10000 G pendant 30 min. Le surnageant est récupéré et forme la solution d’antigène. La solution d’antigène est mise au contact du sérum de bovin à tester. Le test est lu après une incubation de 1h à 37°C. Les érythrocytes de mouton non « sensibilisés » sont utilisés comme témoins de contrôle négatif (Lunde, Fayer 1977).
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR ou réaction en chaîne par polymérase est une technique d’amplification in vitro d’un segment particulier d’ADN à partir d’un mélange de séquences. La PCR est basée sur la répétition de cycles qui amplifient le nombre de séquences. Chaque cycle est constitué de 3 étapes : dénaturation de l’ADN, hybridation des amorces et élongation.
Comme source d’ADN, on peut choisir : un morceau de muscle (Jehle et al., 2009; Moré et al., 2011; Kia et al., 2011), des kystes sarcosporidiens isolés de muscles frais (Dahlgren et al., 2007; Yang et al., 2001; Xiang et al., 2011), une solution de bradyzoïtes purifiés (Güçlü, Aldemir, Guler, 2004). L’ADN génomique est isolé, par digestion des bradyzoïtes et des mérozoïtes avec la protéinase K et la trypsine. L’ADN est extrait grâce à une méthode utilisant du phénol-chloroforme (Yang et al., 2001; Li et al., 2002; Güçlü, Aldemir, Guler, 2004; Jehle et al., 2009) et une précipitation à l’éthanol ou grâce à des kits commerciaux (Domenis et al., 2011; Moré et al., 2011;
Moré et al., 2013). La quantité d’ADN isolée peut être mesurée par un spectrophotomètre (Carletti et al., 2013). Pour éliminer l’ARN restant, on peut ajouter une ARNase (Güçlü, Aldemir, Guler, 2004).
La PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
La technique de la PCR-RFLP se base sur le polymorphisme des longueurs des fragments de restriction. L’utilisation de la PCR-RFLP et de différentes endonucléases, comme EcoR1, Taq1, Dra1, Hinf1, Alu1, Pst1, Bcl1, ACC1, Mbo2, Ssp1, Rsa1 et Mbo1 (Yang et al., 2002), ou Fok1, Dra1, Bsl1 et Ssp1 (Jehle et al., 2009), ou Bcl1 et Rsa1 (Moré et al., 2011), sur les produits de l’amplification du gène de l’ADN ribosomique 18S, a permis de déterminer le nombre de sites de restriction et la taille des fragments de restriction pour de nombreuses espèces de sarcosporidies.
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Etude bibliographique
I. Présentation générale
1. Etiologie et cycle évoluti
1.1. Etapes du cycle chez l’hôte intermédiaire
1.2. Etapes du cycle chez l’hôte définitif
2. Importance médicale
2.1. Symptômes chez l’hôte intermédiaire : le bovin
2.2. Symptômes chez les hôtes définitifs
3. Importance économique en élevage
3.1. Sarcosporidiose clinique et sub-clinique
3.2. Saisies à l’abattoir pour « lésions évoquant la sarcosporidiose »
4. Diagnostic
4.1. Diagnostic microscopique chez l’hôte intermédiaire
4.2. Diagnostic chez l’hôte intermédiaire de la sarcosporidiose aiguë de son
vivant
4.3. Diagnostic moléculaire chez l’hôte intermédiaire
4.4. Diagnostic de troupeau chez les hôtes intermédiaires
4.5. Diagnostic macroscopique chez l’hôte intermédiaire : la myosite
éosinophilique
4.6. Diagnostic chez l’hôte définitif
II. Facteurs de risques de la sarcosporidiose et gestion de ces facteurs de
risques
1. Epidémiologie descriptive
2. Facteurs de risque d’infestation des bovins par Sarcocystis spp
2.1. Facteurs de risque liés à l’hôte
2.2. Facteurs de risque liés au parasite : espèce de Sarcocystis
2.3. Facteurs de risque liés à l’environnement
3. Facteurs de risque de développement de lésions de myosite éosinophilique
suite à l’infestation par Sarcocysti
3.1. Facteurs de risque liés au parasite
3.2. Facteurs de risque liés à l’hôte
3.3. Facteurs de risque liés à l’environnement
4. Prophylaxi
4.1. Prophylaxie médicale
4.2. Prophylaxie sanitaire
Etude expérimentale
I. Etude des facteurs de risque de l’infestation par Sarcocystis spp. dans les élevages
de bovins abattus en Midi-Pyrénées
1. Matériel et méthode
1.1. Les prélèvements d’oesophages en abattoir
1.2. Population d’étude
1.3. L’histologie
1.4. La PCR
2. Résultats
2.1. Résultats de l’examen histologique
3. Discussion sur les prélèvements d’oesophages à l’abattoir
II. Etude des facteurs de risque du développement d’une myosite éosinophilique suite
à l’infestation par Sarcocystis spp. dans les élevages de bovins abattus en Midi-
Pyrénées
1. Matériel et méthode
1.1. Evaluation de la prévalence de la saisie pour motif « myosite
éosinophilique évoquant la sarcosporidiose » chez les bovins abattus en
Midi-Pyrénées
1.2. Evaluation des facteurs de risques possibles de développement d’une
myosite éosinophilique suite à l’infestation par Sarcocystis spp. des bovins
abattus en Midi-Pyrénées : enquête par envoi de questionnaires
1.3. Prélèvements d’oesophages à l’abattoir de bovins provenant
d’exploitations ayant eu des saisies antérieures pour motif « myosite
éosinophilique évoquant la sarcosporidiose »
2. Résultats
2.1. Prévalence de la saisie pour motif « myosite éosinophilique évoquant la
sarcosporidiose » chez les bovins couverts par Intersu
2.4. Etude des facteurs de risque possibles liés à la conduite d’élevage
2.5. Etude des facteurs de risque possibles liés à l’environnement
2.6. Etude des facteurs de risque possibles liés à l’alimentation et à
l’abreuvement
2.7. Etude des facteurs de risque possibles liés à la présence de carnivores
domestiques
2.8. Etude des facteurs de risque possibles liés à la présence de la faune
sauvage
2.9. Etude des facteurs de risque possibles liés au mode de vie de l’éleveur
2.10. Etude des facteurs de risque possibles liés à la situation sanitaire de
l’élevage
2.11. Remarques des éleveurs dans les questionnaires
2.12. Apport des visites d’élevage
2.13. Niveau d’infestation par Sarcocystis spp. des bovins provenant
d’exploitations ayant eu des saisies antérieures pour motif « myosite
éosinophilique évoquant la sarcosporidiose »
3. Discussion sur l’évaluation des facteurs de risques de saisie pour motif
« myosite éosinophilique évoquant la sarcosporidiose » chez les bovins abattus
en Midi-Pyrénées
3.1. L’évaluation de la prévalence de la saisie pour motif « myosite
éosinophilique évoquant la sarcosporidiose » chez les bovins abattus en
Midi-Pyrénées
3.2. Le choix du type d’enquête pour évaluer les facteurs de risque de saisie
pour motif « myosite éosinophilique évoquant la sarcosporidiose » chez
les bovins abattus en Midi-Pyrénées
3.3. Le biais de sélection des éleveurs de l’étude et la réponse au
questionnaire
3.4. Le biais de classement des éleveurs de l’étude
3.5. L’étude de l’exposition aux matières fécale
3.6. L’évaluation de la prédisposition génétique
3.7. L’évaluation du niveau d’infestation par Sarcocystis spp. des bovins
provenant d’exploitations ayant eu des saisies antérieures pour motif
« myosite éosinophilique évoquant la sarcosporidiose »
3.8. Discussion sur l’analyse statistique
Conclusion
Bibliographie
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