Diagnostic immunochromatographique

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Aspects cliniques du paludisme

Accès palustre

Les manifestations cliniques sont diverses dans leur expression et dans leur gravité et dépendent à la fois du parasite (espèce plasmodiale, densité parasitaire) et de son hôte.
À une incubation variant de 9 à 20 jours en général, succède alors une phase d’invasion, où la fièvre a un rythme irrégulier, mais est progressivement croissante : la parasitémie va elle aussi en augmentant. Des cycles schizogoniques différents se chevauchent et l’on observe donc pour P. vivax, P. ovale et P. malariae différents stades : trophozoïtes jeunes ou âgés, schizontes jeunes ou âgés simultanément.
Après une dizaine de jours apparaissent alors les accès palustres typiques : fièvre tierce pour P. falciparum, P. vivax et P. ovale : accès fébrile le premier jour, température normale le deuxième jour, nouvel accès fébrile le troisième jour.
Dans la fièvre quarte due à P. malariae la température normale dure deux jours.
L’accès palustre comprend un bref stade de frissons avec sensation de froid, où la température atteint 39 °C. Il est suivi d’un stade de chaleur, de quelques heures avec une température de 40 °C à 41 °C. Enfin un stade de sueurs, de même durée pendant lequel la température redevient normale ou en dessous.
Ces accès correspondent à la durée du cycle schizogonique qui est de quarante huit heures (72 heures pour P. malariae). L’accès fébrile correspond à l’éclatement des rosaces, avec présence surtout dans le sang de trophozoïtes jeunes, dont le diagnostic d’espèce est difficile. Ceux-ci pendant l’intervalle entre deux accès, évoluent progressivement en trophozoïtes âgés, schizontes jeunes à 2-4 noyaux, schizontes mûrs ou corps en rosace. Les gamétocytes apparaissent en général après la période d’invasion [32, 53].

Formes graves du paludisme à P. falciparum

Le paludisme à P. falciparum du sujet non immun (jeune enfant en zone d’endémie, femme enceinte, voyageur) est potentiellement mortel.
L’accès pernicieux ou neuropaludisme ou paludisme cérébral regroupe toutes les manifestations neurologiques qui ont pour conséquence l’atteinte cérébrale au cours de l’accès palustre : troubles de la conscience, prostration et convulsions.
Le début est soit progressif ou brutal. La phase d’état associe fièvre – troubles neurologiques (coma stade II et/ou convulsions, troubles toniques, signes méningés). L’abolition des réflexes est considérée comme de mauvais pronostic. L’évolution dépend de la rapidité et de la qualité du traitement. Le taux de létalité reste élevé 10 à 30% [32].

Paludisme viscéral évolutif

Il s’agit d’une manifestation chronique atteignant préférentiellement l’enfant vivant en zone d’endémie ou l’adulte non prémuni, soumis à des inoculations parasitaires répétées. Cliniquement le tableau associe : une anémie importante (avec pâleur, dyspnée, asthénie, souffle anorganique et oedèmes), une splénomégalie importante, une fébricule autour de 38° avec parfois des poussées thermiques plus importantes et, chez l’enfant, un retard staturo- pondéral. Le parasite est retrouvé dans le sang périphérique du malade (mais la parasitémie peut être très faible et le diagnostic difficile) [32].

Fièvre bilieuse hémoglobinurique

C’est un syndrome d’hémolyse intra-vasculaire accompagnée d’hémoglobinémie et d’hémoglobinurie survenant occasionnellement dans des cas de paludisme aigu à P. falciparum à répétition. Ce syndrome survient chez les sujets prenant irrégulièrement une chimioprophylaxie et / ou des traitements par la quinine. La symptomatologie associe : un début brutal avec lombalgie, pâleur, fièvre avec ictère, oligurie [32].

Diagnostic biologique

Diagnostic parasitologique

L’examen microscopique de la goutte épaisse et du frottis mince a toujours été la méthode de référence dans le diagnostic du paludisme. Il repose sur la mise en évidence du parasite dans le sang en utilisant 2 techniques qui doivent toujours être associées : le frottis mince et la goutte épaisse. Après confection sur une même lame, celle-ci est séchée à l’air libre, le frottis mince est fixé au méthanol tandis que la goutte épaisse est déshémoglobinisée par l’eau. La lame est colorée ensuite au Giemsa et examinée immédiatement au microscope optique. C’est une méthode moins cher, rapide d’exécution et relativement sensible permettant de détecter entre 10 et 50 parasites par microlitre (respectivement pour la goutte épaisse et le frottis mince) [26]. La microscopie permet de faire l’identification des espèces et de déterminer la densité parasitaire. Toutefois, la lecture des lames nécessite un microscopiste expérimenté surtout dans les cas de densités parasitaires faibles ou dans certains cas des risques de confusion des espèces [43].

Diagnostic immunochromatographique

D’autres méthodes de diagnostic sont utilisées basées sur les méthodes immunologiques, les tests de diagnostic rapides (TDR). Ces tests mettent en évidence des antigènes ou des enzymes du parasite, présents dans le sang. On met en migration un prélèvement de sang sur une membrane ; les antigènes sont capturés par des anticorps monoclonaux fixés sur la membrane et la révélation se fait par de nouveaux anticorps monoclonaux couplés à une particule colorée révélatrice. Les TDR ont été développés dans le but d’augmenter la sensibilité et la rapidité du rendu de résultat [36].

Diagnostic moléculaire

Polymerase chain reaction (PCR)

Cette technique consiste en l’amplification d’un segment de l’ADN par une réaction enzymatique répétée : PCR ou réaction de polymérisation en chaîne. C’est la méthode la plus sensible (pouvant détecter moins de 5 parasites par microlitre) et la plus spécifique. Avec la PCR nichée ou la PCR semi-nichée ciblant le gène de la sous-unité 18S de l’ARN ribosomal, on peut détecter toutes les quatre espèces plasmodiales. La PCR présente en outre une meilleure sensibilité pour la détection des infections mixtes [44, 48]. Toutefois, ces PCR dites conventionnelles sont techniquement difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent un temps d’exécution long. En outre, elles sont souvent sujettes à des contaminations du produit de l’amplification [27]. Par contre, les méthodes de PCR en temps réel, de développement récent, utilisent un fluorochrome qui permet de suivre la formation des amplicons au cours de la réaction. Les avantages de ces techniques sont : la possibilité de quantification du pathogène, la diminution du risque de contamination et la disponibilité des résultats dans les 3 heures (y compris la préparation de l’échantillon). Quelques études ont établi l’application de cette technique en parasitologie [1, 4, 12, 20, 35, 42].

Loop mediated isothermal amplification (LAMP)

La LAMP est une technique de détection des acides nucléiques qui présente un véritable intérêt dans le diagnostic du paludisme et plus particulièrement dans un cadre qui a pour objectif l’élimination du paludisme. La LAMP diffère de la PCR en plusieurs points. Premièrement, c’est un processus isothermal d’amplification reposant sur la polymérase de Bacillus stearothermophilus (Bst). Elle ne nécessite pas de changement cyclique de la température [28] contrairement à la PCR ; cela facilite l’adaptation sur le champ d’étude. Deuxièmement, une réaction positive à la LAMP se traduit par la formation d’un précipité de pyrophosphate de magnésium qui peut être détecté visuellement, par turbidimétrie [28] ou en utilisant un indicateur à base d’ion métallique telle que la calcéine [50], le bleu d’hydroxynaphtol [13] et le pico-green [54].
Depuis sa première description en 2001 [28], de nombreuses recherches ont été effectuées dans le sens d’adapter la LAMP dans le diagnostic du paludisme. La LAMP a été utilisée pour la détection de P. falciparum utilisant de l’ADN extrait de façon grossière à partir de sang total [39], ou utilisant une méthode rapide par ébullition et centrifugation [38].
Par la suite, la LAMP a été utilisée pour identifier toutes les espèces de Plasmodium [14] y compris P. knowlesi [17, 19] et les amorces de LAMP ont été améliorées pour augmenter la sensibilité de sorte que P. falciparum [37, 38] et P. vivax [21, 34] puissent être détectés. Des kits commerciaux Loopamp ont été validés pour la détection de P. falciparum [15], y compris les faibles densités parasitaires [8] et pour la détection indirecte de P. vivax utilisant une combinaison d’amorces pan-genres et spécifiques de P. falciparum [51]. Toutefois, un haut débit de traitement ferait de la technique LAMP une méthode largement applicable [16] dans le but d’une élimination du paludisme. Quoique pour la plupart des plateformes LAMP, le temps de traitement soit rapide (60-90 min), le haut débit est toujours restreint par la nature de la plateforme utilisée. Par exemple, le kit Loopamp utilisé en turbidimétrie (Eiken Chemical Co) a une capacité de traitement de seulement de 16 échantillons alors que le kit utilisé en bloc chauffant et ultraviolet en a une capacité de 46 échantillons [8].
En outre, la LAMP pourrait jouer un rôle important dans la détection des cas asymptomatiques dans les régions qui sont proches de l’objectif de pré-élimination. Sur cette même lancée, une technique de Reverse transcriptase-LAMP (RT-LAMP) a été développée pour la détection de gamétocytes dans le sang périphérique ; cette RT-LAMP présente une meilleure sensibilité mais une spécificité identique à celle de la RT-PCR et avec comme avantage le raccourcissement du temps de manipulation [6].

Type d’étude et période

Il s’agit d’une étude d’évaluation d’une méthode de diagnostic biologique du paludisme. Nous avons sélectionné des échantillons chez des patients suspects de paludisme pendant la saison de transmission palustre (octobre et novembre) de l’année 2015.

Considérations éthiques

Pour les patients éligibles, nous avons expliqué l’étude au patient ou à son tuteur en incluant les objectifs du projet. Le patient ou son tuteur a ainsi la libre option de participer ou non à cette étude. En cas d’acceptation, une fiche de consentement est signée par le patient, le parent ou tuteur. Notre protocole d’étude a été approuvé par la commission Ethique du Ministère la Santé et de l’action sociale.

Populations d’étude

Critères d’inclusion des patients

Nous avons inclus :
– Les patients suspects de paludisme sur la base de la fièvre ou une histoire de fièvre dans les 48 heures
– Les patients de plus de 2 ans
– Les patients ayant un poids corporel supérieur ou égal a 8 kg
– Les accès palustres simples
– Les patients ayant donné un Consentement libre et éclairé

Critères de non inclusion

Il s’agit d’absence de consentement du malade, de ses parents ou de ses tuteurs, les patientes en état de grossesse ou allaitantes.

Recrutement des patients

Cette étude a été réalisée chez les sujets de plus 2 ans qui ont rempli les critères d’inclusion après accord des parents ou tuteurs.
Le recrutement était fait entre 8h00 du et 14h00. Après un bref interrogatoire suivi de l’examen clinique mené par le clinicien au niveau de la formation sanitaire, celui-ci étudie l’éligibilité du patient à l’étude. Un prélèvement veineux était effectué chez les patients éligibles et suspects de paludisme. Un test de diagnostic rapide était immédiatement effectué. Les prélèvements de sang étaient acheminés au laboratoire de Parasitologie Mycologie de l’Hôpital Aristide Le Dantec et faisaient l’objet de confection d’un frottis mince et d’une goutte épaisse pour la recherche des plasmodies.

Prélèvement des échantillons

Le sang des patients ayant rempli les critères de sélection est collecté directement sur tube avec anticoagulant (EDTA) et sur papier buvard. Cette dernière méthode s’accompagne d’une diminution de la sensibilité de la détection des parasites mais présente l’avantage d’être pratique en matière de transport, de coût et d’acceptabilité [11]. Un volume de 50 μl de sang est prélevé et séché sur papiers filtres FTA Whatmann.
Les échantillons sont acheminés par la suite au laboratoire de parasitologie-mycologie de l’hôpital Aristide Le Dantec de Dakar. Le sang est conservé à 4 degrés Celsius si l’analyse est effectuée dans les 7 jours ; au delà, les prélèvements sont congelés à -80 degrés Celsius.

Techniques de diagnostic biologique

Microscopie

Une goutte épaisse et un frottis mince sont confectionnés sur une même lame et colorés par une solution de Giemsa diluée à 10%. La lame est observée au microscope optique à l’objectif x100 par deux microscopistes. Une observation sur 300 champs est faite avant de déclarer une lame négative. Si la lame est positive, la densité parasitaire est calculée sur la base du rapport du nombre de trophozoïtes sur le nombre de leucocytes en assumant que chaque échantillon contient 8000 leucocytes par microlitre. Si l’écart observé entre les microscopistes est inférieur à 20%, la moyenne des 2 observations est reportée ; si l’écart est supérieur à 20%, la lame est adressée à un troisième lecteur.

Illumigene Malaria

– Principe du test
La LAMP utilise des amorces conçues spécialement pour donner une amplification de l’ADN en condition isothermale. Le test a pour cible une région du génome de Plasmodium qui est conservée au sein de P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae et P. knowlesi. Le kit illumigene Malaria a pour cible une séquence d’ADN mitochondriale non codante de 214 paires de base de Plasmodium spp. Au cours de l’amplification, les extrémités des brins d’ADN se recourbent (par appariement entre 2 séquences complémentaires) et forment des boucles. Ces derniers constituent des points d’initiation pour de nouvelles amorces pour former une nouvelle élongation. Un dérivé de l’amplification est constitué du pyrophosphate de magnésium qui donne une solution trouble. Les caractéristiques de l’absorbance sont détectées et interprétées par un système Incubateur/Lecteur illumigene pro-10. Le changement des caractéristiques d’absorbance dus au précipité de pyrophosphate de magnésium indique la présence de la séquence d’ADN cible.

Microscopie

Les résultats de la goutte épaisse et du frottis mince ont permis de noter 123 échantillons positifs sur les 200 suspects de paludisme soit un taux de positivité de 61,6% et 77 échantillons négatifs (38,4%) (Tableau I). Parmi les échantillons positifs, un seul était à Plasmodium ovale, tous les autres étant à P. falciparum. Les densités parasitaires variaient entre 16 et 404000 parasites par microlitre de sang avec une moyenne de 36942.

Illumigene Malaria

Avec le protocole S-PREP, nous avons noté 137 échantillons positifs (67,8%) et 62 échantillons négatifs (32,2%) ; 1 échantillon est sorti non valide même après répétition de l’analyse.
Avec le protocole M-PREP, nous avons noté 148 échantillons positifs (73,9%) et 52 échantillons négatifs (26,1%) (Tableau I). Il existait ainsi 11 échantillons qui étaient positifs avec le protocole M-PREP alors qu’ils étaient négatifs avec le protocole S-PREP. Ces 11 échantillons étaient également négatifs à la microscopie. L’échantillon qui était non valide avec le protocole S-PREP était positif avec le protocole M-PREP. Au total, 189 échantillons étaient concordants entre les 2 protocoles (94,5%) et 11 échantillons présentaient de discordances (5,5%)

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Table des matières

Introduction
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Epidémiologie du paludisme
1.1. Agents pathogènes
1.1.1. Morphologie générale
1.1.2. Cycle évolutif du parasite
1.2. Vecteur
1.3. Répartition géographique
1.4. Modalités épidémiologiques
1.4.1. Classification de l’endémie palustre
1.4.2. Faciès épidémiologiques
2. Aspects cliniques du paludisme
2.1. Accès palustre
2.2. Formes graves du paludisme à P. falciparum
2.3. Paludisme viscéral évolutif
2.4. Fièvre bilieuse hémoglobinurique
3. Diagnostic biologique
3.1. Diagnostic parasitologique
3.2. Diagnostic immunochromatographique
3.3. Diagnostic moléculaire
3.3.1. Polymerase chain reaction (PCR)
3.3.2. Loop mediated isothermal amplification (LAMP)
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
1. Méthodologie
1.1. Sites d’étude
1.2. Type d’étude et période
1.3. Considérations éthiques
1.4. Populations d’étude
1.4.1. Critères d’inclusion des patients
1.4.2. Critères de non inclusion
1.4.3. Recrutement des patients
1.5. Prélèvement des échantillons
1.6. Techniques de diagnostic biologique
1.6.1. Microscopie
1.6.2. Illumigene Malaria
1.7. Analyse des données
2. Résultats
2.1. Microscopie
2.2. Illumigene Malaria
2.3. Concordances et discordances
3. Discussion
Conclusion

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