DIAGNOSTIC DES HEMOGLOBINOPATHIES AU CHU-HJRA

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Diagnostic biologique 

Le diagnostic de la drépanocytose repose sur des arguments biologiques témoignant de la présence de l’hémoglobine S : tracés électrophorétiques qui seront interprétés selon les données hématologiques, cliniques, mais aussi ethniques et familiales [6]. Le test de falciformation est positif.
Drépanocytose homozygote
· L’anémie est constante, mais variable dans son degré (6 à 10 g/dl).Elle est normochrome, normocytaire, toujours régénérative (>150000/mm3). L’aspect du frottis révèle une anisocytose, une poïkylocytose correspondant aux cellules falciformes dont le pourcentage est très variable d’un individu à l’autre. Les drépanocytes peuvent être rares ou au contraire très nombreux .Mais, en moyenne sur un frottis, ils représentent 5 à 10% des hématies .Quand l’auto splénectomie se constitue, il apparaît des corps de Jolly dans les globules rouges.
L’érythroblastose circulante est en général de 1 à5 pour 100 leucocytes. Elle est soit permanente, soit elle survient plutôt à l’occasion de l’accentuation de l’hyperhémolyse.
L’hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles est habituelle en dehors de toute infection.
Les plaquettes sont normales sauf quand l’auto splénectomie est importante, et dans ce cas, elles augmentent entre 300 et 500 G/l.
· L’électrophorèse le plus souvent faite en pH alcalin montre l’absence de l’Hb A, une Hb A2 normale ou un peu augmentée, une Hb F jusqu’à 20% et une Hb S entre 80 à 100%
· Les autres données biochimiques confirment l’hémolyse : hyperbilirubinémie libre élevée, haptoglobine diminuée, fer sérique élevé.
Drépanocytose hétérozygote
Les caractéristiques hématologiques du sang périphérique sont normales. L’électrophorèse de l’hémoglobine montre une Hb A ntre 50 et 60%, une Hb A2 normale et une Hb S entre 40 et 50%.

Principes de prévention et traitement des manifestations cliniques

Prévention
Les mesures de prévention consistent à éviter la falciformation des hématies : éviter la déshydratation et l’hyperthermie, l’hydratation importante et régulière est recommandée, prévenir les infections notamment contre le pneumocoque par la vaccination Deux vaccins sont disponibles : le plus ancien est le vaccin polysaccharidique (Pneumo 23), le plus récent est le vaccin conjugué (Prevenar).
Le vaccin polysaccharidique comprend 23 antigènes, correspondant à la plus grande majorité des sérotypes incriminés. Il n’est efficacqu’à partir de l’âge de deux ans et réclame des rappels tous les 3 ans [11].
Le vaccin conjugué induit des réponses intenses etplus constantes dès le premier mois de la vie. Il contient toutes les souches de pneumocoques résistantes à la pénicilline et 91% des souches intermédiaires. Les souches non contenues dans le vaccin sont sensibles à la pénicilline dans l’immense majorité des cas.
Le schéma vaccinal est logiquement le suivant :
· à 2, 3 et 4 mois : vaccination par le vaccin conjug ué
· à 16-18 mois : rappel avec le même vaccin
· à partir de 2 ans : vaccination par le vaccin polys accharidique, avec rappel tous les 3 ans.
Il est recommandé aussi de vacciner contreHaemophilus influenza (de type b), contre le méningocoque et contre la grippe. Le calendrier vaccinal habituel doit par ailleurs être rigoureusement suivi.
La prise d’acide folique est aussi recommandée.
Instaurer un traitement antibiothérapique de toute infection bactérienne. On préconise même une antibioprophylaxie dès que le diagnostic ed drépanocytose est posé jusqu’à l’âge de 5 ans.
Eviter toutes les situations d’hypoxie : séjour ou voyage en altitude, vêtements serrés, atmosphère confinée
Traitement
Le traitement au long cours a pour objectif de réduire la fréquence et la gravité des complications.
Les transfusions corrigent l’anémie hémolytique etses conséquences, mais répétées, elles posent le problème d’immunisation, d’infection, et de surcharge en fer ainsi que le problème de l’abord veineux.
L’hydroxyurée (Hydréa ) vise à augmenter le taux d’Hb F et à empêcher la polymérisation de l’Hb S. Efficace à court terme, ses effets à long terme sont mal connus [11].
La greffe de moelle est le seul traitement curatif radical, mais reste un traitement d’exception [2] [6] [13].
Malgré la prévention, on est souvent amené à traiteles crises douloureuses ainsi que les accidents thrombotiques.

Thalassémies

Les thalassémies sont des anémies hémolytiques héréditaires dues à la diminution ou à l’absence de synthèse d’une des chaînes protéiques de l’hémoglobine [4].On parlera de β-thalassémie ou d’ α-thalassémie selon la nature de la chaîne concernée.
Les thalassémies sont à transmission autosomique récessive. Ces affections génétiques, initialement décrites chez des sujetstaliens par Cooley, touchent les populations du bassin méditerranéen, d’Afrique, du Moyen-Orientet d’Asie du Sud-est. Actuellement, la distribution des thalassémies tend à devenir mondiale du fait des mouvements de population [4].
A Madagascar, la β-thalassémie, bien que très rare, a été la seule rmefo décrite [14].

Physiopathologie

Les principales thalassémies sont dues à un déficit de synthèse de la chaîneα (alpha-thalassémies) et ou à un déficit de la chaîneβ (bêta-thalassémies).

Alpha thalassémies

Dans la majorité des cas, il s’agit d’une délétiontotale ou partielle d’un gène avec une absence de la synthèse de la chaîne correspondante [4] [15].
Chez le sujet normal, il existe deux copies de gène α sur chaque chromosome soit quatre gènes fonctionnels par génome diploïde αα(/αα). On distingue donc quatre types d’ α-thalassémies correspondant à la délétion d’un, deux, trois ou quatre gènes α-globine.
Délétion des quatre gènes[4] [15]
Le déficit de 4 gènes est incompatible avec la vieextra-utérine. C’est l’α°-thalassémie homozygote où aucun gène n’est fonctionnel (- -/- -). Cette forme est surtout répandue en Asie du Sud-est.
La chaîne α étant une des composantes de l’Hb F, le fœtus ne p eut produire ni Hb F, ni Hb A. Les manifestations de cette forme grave débuteront pendant la vie fœtale et conduiront à une mort in utero ou périnatale dans un tableau d’anasarque foeto-placentaire.
Hémoglobinose H
Elle correspond, du point de vue génétique, à l’atteinte de 3gènes (- -/ α -). Les chaînes β en excès s’associent en un tétramère relativementinstable : l’hémoglobine H.
A côté des formes constitutionnelles, on peut trouver une hémoglobinose H acquise au cours de leucémie aiguë myéloïde (LAM), erythroleucémie, syndrome myélodysplasique (SMD), leucémies aiguës lymphoïdes (LAL), surtout chez les hommes âgés.
α – thalassémie de type 1
Sur le plan génétique, cette forme est la conséquence d’une inactivation des 2 gènes en cis sur l’un des deux chromosomes (- -/ αα) ou d’une inactivation d’un gène sur chaque chromosome (- α/ – α).
α – thalassémie de type 2 ou thalassémie silencieuse Un seul des 4 gènes se trouve inactivé (-α/ αα).
Hémoglobinose CS (Constant Spring)
Elle correspond à une mutation sur le codon non sen s terminal et aboutit à une chaîne allongée de 31 résidus. De nouveaux acides aminés’adjoignents à la chaîne α.

β-thalassémies

Contrairement aux α-thalassémies, la grande majorité desβ-thalssémies sont dues à des mutations ponctuelles [4] [16]. Si la mutation responsable d’un défaut de synthèse de chaîne porte sur un seul gène, elle donne une forme hétérozygote (thalassémiemineure ou trait thalassémique) et si elle porte sur les deux gènes, elle est responsable de la thalassémieβ homozygote (thalassémie majeure).
Hémoglobine Lepore (Hb Lepore)
Elle résulte d’une fusion par crossing-over des gènes delta et bêta au niveau du chromosome 11. La chaîne synthétisée est de type delta à une extrémité et de type bêta à l’autre. Elle est, par ailleurs, synthétisée à un taux moindre qu’une chaîne bêta normale.
Delta bêta thalassémieδ -(β thalassémie)
Elle est plus souvent le résultat d’une délétion auniveau des deux gènes δ et β, elle équivaut à une β-thalassémie hétérozygote.

Conséquences

L’insuffisance de synthèse de l’hémoglobine est responsable d’une microcytose à fer sérique normal ou élevé [6] [17].
La précipitation des chaînes de globine synthétiséeen excès altère la membrane du globule rouge. Ceci est à l’origine de l’hémolyse entraînant une anémie hémolytique dont la gravité dépend du type de chaîne déficiente, de l’intensité du déficit, conditionné par le caractère homozygote / hétérozygote.

Clinique

α-thalassémies

L’α°-thalassémie homozygote se traduit cliniquement par un tableau d’anasarque foeto-placentaire avec mort in utero ou très rapidement après la naissance (anasarque de Bart).
L’Hémoglobinose H se présente par une anémie hémolytique chronique edsévérité variable mais le plus souvent bien tolérée. On retrouve également, à des degrés variables, un ictère cutanéo-muqueux et une splénomégalie.
Le tableau de l’hémoglobine CS (Constant Spring) se rapproche de l’hémoglobinose H.
L’α-thalassémies de type 1 et 2sont cliniquement muettes.

β-thalassémies

Thalassémie majeure ou maladie de Cooley (forme homozygote)
Cette affection très sévère se manifeste vers 3 mois après la naissance. Elle se traduit par une anémie profonde avec pâleur cutanéo-muqueuse, hépatosplénomégalie et subictère. La face a un aspect « mongoloïde » (hyperplasie des os de la face). L’enfant est sujet à des infections à répétition et présente un retardstaturo-pondéral et pubertaire.
β-thalassémie mineure ou trait thalassémique
C’est la forme observée chez le porteur sain ou hétérozygote. Elle n’a pas d’expression clinique.
La delta bêta thalassémie hétérozygote se rapproched la β-thalassémie hétérozygote.
Thalassémie intermédiaire
Elle est une forme modérée de la maladie qui se déclare après la deuxième année de vie.
Hb Lepore
A l’état hétérozygote, elle donne lieu à un tableau de bêta thalassémie mineure. A l’état homozygote, elle se révèle alors cliniquement très grave avec une présentation analogue à la bêta thalassémie de Cooley [6].

Diagnostic biologique 

β-thalassémie majeure

L’hémogramme montre une anémie majeure 4( à 7 g/dl), microcytaire ou hypochrome apparaissant à partir du troisième mois, le taux des réticulocytes est normal. Les plaquettes sont normales ou discrètement augmentées ainsi queles leucocytes.
Le frottis sanguin permet de retrouver des microcytes, des poïkylocytes avec annulocytes, leptocytes (hématies aplaties de grande taille, très hypochromes) et des érythroblastes circulants. Les corps de Jolly ne sont visibles dans le sang périphérique qu’après splénectomie.
L’étude de l’hémoglobine par électrophorèse confirme le diagnostic en montrant l’absence totale ou quasi-totale d’ Hb A et la présence majoritaire d’ Hb F, l’Hb A2 étant normale ou augmentée. Elle permet la recherche systématique d’un trait thalassémique chez chacun des deux parents.
Les examens biochimiques révèlent une sidérémie et une ferritinémie élevées, une bilirubine libre augmentée et une haptoglobine diminuée.

β-thalassémie mineure ou trait thalassémique

Le signe évocateur d’un trait thalassémique est la mise en évidence à l’hémogramme d’une microcytose, d’une hypochromie et d’une pseu dopolyglobulie, en l’absence de carence martiale chez un sujet originaire d’un pays à risque.
Une étude de l’hémoglobine est alors indiquée et consiste à quantifier les différentes fractions d’Hb A, d’Hb A2 et éventuellement d’Hb F. La fraction d’Hb A2 , normalement inférieure à 3%, est variable : chez l’hétérozygote, elle est augmentée en général entre 3,5 et 5,5%, rarement au-delà de 7%.

Hb Lepore

L’hémogramme montre une microcytose. En électrophorèse à pH alcalin, l’Hb Lepore migre de façon très proche de l’Hb S. Sur le tracé, on retrouve pour les formes hétérozygotestrois bandes : Hb F, Hb A et Hb Lepore migrant au niveau de l’Hb S.
Dans les formes homozygotes, il n’existe que deux bandes correspondantes à l’Hb F et à l’Hb Lepore, sans Hb A.

Delta bêta thalassémie

L’électrophorèse de l’hémoglobine peut montrer à pH alcalin les résultats suivants:*Delta+-β+thalassémiehomozygote A:10-90%,F :10-90%, A2 : normal ou>4%
*Delta°- β° thalassémie homozygote : F 100%
*Delta– βthalassémie hétérozygote : F 10,5 3%, A2 2,30,5%

Hémoglobinose H ouα-thalassémie

Le diagnostic de l’ α-thalassémie est suspecté en présence d’une microcytose et d’une hypochromie sans augmentation de la fraction d’HbA2 ou encore en présence de corps de Heinz visibles sur le frottis colorés au bleu de Crésyl.
A l’électrophorèse de l’hémoglobine, on note la présence d’Hb H (10 à 30%) et d’Hb Bart’s (10 à 30%) à la naissance.

Thalassémie mineure de type 1

Les résultats de l’hémogramme notent une microcytose sans anémie. L’électrophorèse de l’hémoglobine retrouve à la naissance jusqu’ à 5 % d’Hb Bart’s, est normale chez l’adulte (quelquefois Hb A2 < 2%) avec Hb F normale. Le bilan martial est normal.
Le diagnostic de l’ α-thalassémie de type 1 est porté devant une légèremicrocytose sans augmentation de la fraction de l’Hb A2 et sans perturbation du bilan martial. Il peut être confirmé par la mesure du rapport de la synthèse des chaînes α et β in vitro ou par la caractérisation des délétions dans le locus des gènes α-globine par des techniques de biologie moléculaire.

Principes des traitements et prévention desmanifestations cliniques 

Thalassémie majeure

L’hospitalisation est particulièrement indispensable pour les transfusions répétées. Les transfusions érythrocytaires doivent être phénotypées selon un régime d’hypertransfusion pour maintenir un taux d’Hb à 11,5 g/ dl. Une splénectomie est indiquée en cas d’hypersplénisme ainsi que la correction d’autres carences volontiers associées : folates, zinc, vitamines C, E. et le traitement rapide des infections intercurrentes.
Les mesures préventives consistent en une prévention de l’hémochromatose transfusionnelle (Desféral ), une éviction des régimes riches en fer, un dépistage systématique des formes hétérozygotes avec conseilgénétique et une vaccination précoce contre l’hépatite B et le pneumocoque.

Autres hémoglobinopathies

Hémoglobine E 

Elle est extrêmement commune en Asie du Sud-est. L’hémoglobine E résulte d’une mutation dans la chaîne β de l’hémoglobine (mutation au niveau du 26° acide aminé de la chaîne β). Le trait de l’Hb E est un état asymptomatique tandis que la maladie homozygote est associée à l’anémie hémolytique et à la splénomégalie.
L’association d’Hb E et thalassémie (Hb E / β°-thalassémie) produit une image clinique plus grave qui ressemble aux β-thalassémies majeures. Cette association est très fréquente en Asie du Sud-est.

Hémoglobine C 

L’hémoglobine C existe au Ghana et aux Antilles. Elle résulte d’une mutation du gèneβ (mutation au niveau du 6° acide aminé de la chaîne β). L’hémoglobinose C est relativement bénigne. Il y a une légère anémie hémolytique et eunsplénomégalie. Mais les doubles hétérozygotes SC présentent un tableau de syndromedrépanocytaire majeur.
Le diagnostic biologique repose sur les migrations électrophorétiques en gélose acide.

Hémoglobine D

L’hémoglobine D est commune au Pundjab [20]. Les patients présentant le trait de l’Hb D sont asymptomatiques et même dans la maladiehomozygote, l’anémie et le processus hémolytique sont extrêmement légers.
Le frottis sanguin présente une microcytose, une hypochromie et peu de cellules cibles. L’Hb D a la même mobilité que l’Hb S sur l’électrophorèse de l’hémoglobine à pH alcalin. L’électrophorèse à pH acide permet de faire la différenciation.

Hémoglobine avec affinité pour l’oxygène modifiée

Une hémoglobine à affinité diminuée pour l’oxygènentraîne une anémie avec cyanose.
Une hémoglobine à affinité augmentée entraîne au contraire une polyglobulie.
Le diagnostic se fait sur l’étude de la courbe de dissociation de l’oxyhémoglobine et par la mesure de la P 50.

Doubles hétérozygotismes

Le diagnostic est étayé par l’enquête milialefa (atteinte des 2 parents) et l’origine ethnique. Les phénotypes SC, Sβ (S/β+ ou S/β°), S/D Pundjab et S/O Arab sont responsables de Syndromes Drépanocytaires Majeurs (SDM).
En résumé, les hémoglobinopathies se manifestent par deux types d’anomalies : l’anomalie quantitative par défaut de synthèse des chaînes de globine α ou non alpha (syndromes thalassémiques) et l’anomalie qualitative de la structure de la protéine (Hb S ; Hb C ; D ; E… )
Il existe une grande variété d’hémoglobines dites normales ; c’est-à-dire comportant une modification dans la séquence polypeptidique.
Dans 95% des cas, l’hémoglobine mutée est le résulta de la substitution d’une seule base au niveau de l’ADN. Trois quarts de ces modifications n’ont aucune conséquence pathologique à l’état hétérozygote. On dénombre à ec jour, plus de 800 variants d’hémoglobine.

METHODES DE DIAGNOSTIC

TEST D’EMMEL 

Principe

Ce test permet la mise en évidence des hématies falciformes en présence d’un agent réducteur et en atmosphère appauvrie en oxygène. Ilest spécifique de la drépanocytose.

Intérêts

Le test d’Emmel peut être utilisé dans esd laboratoires peu équipés car il ne nécessite que peu d’équipements. Il permet de rechercher une drépanocytose de façon spécifique.

Limites de la technique

· Il ne permet pas de faire la différence entre une drépanocytose homozygote et une drépanocytose hétérozygote.
· Certains médicaments fréquemment utilisés en zone ropicalet (Disulone-Métronidazole) peuvent empêcher la falciformation rovoquéep.
· D’autre part, des réactions faussement positives ou négatives sont assez fréquentes (10 à 15 % des cas).

TEST DE SOLUBILITE OU TEST D’ITANO 

Principe

L’HbS, réduite par action de l’hydrosulfite de Sodium, précipite dans une solution tampon phosphate de 2,24 M.
Travailler toujours par comparaison à un échantillon témoin HbA.
Il est indispensable d’éliminer soigneusement les stromas globulaires.

Intérêts

Ce test est utilisé pour faire la différence entre HbS et d’autres variants qui ont la même mobilité électrophorétique à pH alcalin.

limites

Seule, l’HbC Harlem précipite dans les mêmes conditions.

ELECTROPHORESES DE L’HEMOGLOBINE

Electrophorèse sur acétate de cellulose àpH alcalin

Elle permet l’étude et l’évaluation des différentes fractions de l’hémoglobine. L’électrophorèse sur acétate de cellulose, en raison de sa simplicité, reste encore aujourd’hui une des techniques les plus utilisées pour le dépistage des hémoglobinopathies [2] [6] [24].

Principe

A pH 8,5, la molécule d’hémoglobine estnégativement chargée et de ce fait migre vers l’anode. Les hémoglobines qui ont un gain de charge positive, migrent plus lentement. Les étapes à suivre sont le lavage préalable des hématies, la préparation de l’hémolysat, la migration électrophorétique et l’évaluation quantitive des différentes fractions observées sur les tracés électrophorétiques.

Intérêts

L’électrophorèse de l’hémoglobine sur acétate de cellulose à pH alcalin permet :
Une séparation assez précise des différentes fractions normales de l’hémoglobine : Hb A, Hb A2, H b F.
Le dépistage des syndromes thalassémiques :
® β°-thalassémie : l’Hb A est absente, on ne retrouve que deux bandes : Hb F et Hb A2,
® β+ thalassémie : l’Hb A persiste à un taux pouvant varier de 10 à 90% et les trois bandes A, A2, F sont alors observées.
Elle révèle la présence de la plupart des hémoglobines anormales.

Limites de la technique

L’électrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin a un faible pouvoir résolutif. Il est en effet impossible de distinguer des variants qui ont à peu près la même mobilité comme par exemple les Hb S – D Punjdab ou Hb G. Ceci est également le cas pour l’Hb E et l’Hb C qui migrent au niveau de l’Hb A2.

Electrophorèse sur agar à pH acide 

Elle complète utilement l’électrophorèse à pH alcalin.

Principe

Dans ce type d’électrophorèse, la mobilité de la molécule d’hémoglobine ne dépend pas de la charge du résidu muté mais des modifications structurales induites par la mutation dans certaines régions positivement chargées de laprotéine. Ces régions qui correspondent à celles où physiologiquement se fixent les anions régulant la fonction oxyphorique, interagissent alors avec les molécules d’agaropectine du gel.
Dans ce système, en milieu citraté à pH 6,2, l’hémoglobine liée à l’agaropectine migre vers l’anode alors que l’électro-endosmose provoque une diffusion continue vers la cathode. Il existe donc deux mouvements de directions opposées qui séparent les hémoglobines en fonction de leur affinité pour l’agaropectine.
Les étapes à suivre sont les mêmes que celles de l’électrophorèse en milieu alcalin.

intérêts

Elle a surtout un intérêt au niveau des anomaliesqualitatives de l’hémoglobine. En effet, elle permet de séparer les variants ayant lamême mobilité que les hémoglobines S ou C sur acétate de cellulose. Les hémoglobines D et G uiq migrent comme l’Hb S sur acétate, migrent au niveau de l’Hb A sur citrate. Les hémoglobines C et E qui ont la même migration sur acétate de cellulose peuvent aussi être séparéepar cette technique. C’est une technique très sensible qui permet de détecter des pourcentages très faibles d’Hb A et d’Hb F. C’est pourquoi, elle peut être utilisée pour le dépistagenéonatal des hémoglobinopathies.

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Table des matières

INTRODUCTION
1- CONSIDERATIONS THEORIQUES
1-1 Hémoglobinopathies
1-1-1 Hémoglobine
1-1-2 Drépanocytose
1-1-3 Thalassémies
1-1-4 Autres hémoglobinopathies
1-2 Méthodes de diagnostic
1-2-1 Test d’Emmel
1-2-2 Test de solubilité
1-2-3 Electrophorèse de l’hémoglobine
1-2-4 Isoélectrofocalisation
1-2-5 Chromatographie en phase liquide à haute pression
2- DIAGNOSTIC DES HEMOGLOBINOPATHIES AU CHU-HJRA
2-1 Matériels
2-2 Méthodes
2-3 Moyens de diagnostic
2-3-1 Test d’Emmel
2-3-2 Electrophorèse à pH alcalin
2-3-3 Hémogramme
2-3-4 Numération des réticulocytes
2-3-5 Fer sérique
2-4 Résultats
3- COMMENTAIRES ET DISCUSSIONS
4- SUGGESTIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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